铜胁迫下葡萄植株的生理响应和铜转运蛋白基因VvCTR1的克隆及分析.pdf

南 京 农 业 大 学 学 报 2018,41(2):256-265 http:/nauxb.njau.edu.cnJ o u r n a l o f N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y DOI:10.7685/jnau.201706002收 稿 日 期 :2017-06-03 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目(31672131); 国 家 重 点 实 验 室 开 放 课 题 项 目(ZW2014009); 中 国 博 士 后 特 别 资 助 项 目(2014T770533); 南 京 农 业 大 学 校 青 年 基 金 项 目(KJ2013013); 中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费 专 项 资 金(KJQN201541) 作 者 简 介 : 刘 众 杰, 博 士 研 究 生。 通 信 作 者: 房 经 贵, 教 授, 研 究 方 向 为 葡 萄 遗 传 育 种 学,E-mail:fangggnjau.edu.cn。 刘 众 杰, 李 傲, 崔 梦 杰, 等. 铜 胁 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 响 应 和 铜 转 运 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析J. 南 京 农 业 大 学 学 报,2018,41(2): 256-265. 铜 胁 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 响 应 和 铜 转 运 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析 刘 众 杰, 李 傲, 崔 梦 杰, 许 瀛 之, 上 官 凌 飞, 贾 海 锋, 王 晨, 房 经 贵 ( 南 京 农 业 大 学 园 艺 学 院, 江 苏 南 京210095) 摘 要 : 目 的 本 文 旨 在 研 究 重 金 属 铜 对 葡 萄 植 物 生 长 发 育 的 影 响, 为 揭 示 重 金 属 铜 对 植 物 的 伤 害 机 制 提 供 理 论 依 据。 方 法 采 用 过 量 的 硫 酸 铜 以 及 硫 酸 铜 与 其 螯 合 剂 混 合 液 处 理 葡 萄 植 株 幼 苗, 以Hoagland 溶 液 为 对 照, 分 析 根 和 叶 片 的 发 育 情 况, 叶 绿 素 含 量 以 及 铜 在 植 株 中 的 分 布 情 况; 克 隆 了 铜 转 运 蛋 白 基 因 V v C T R 1, 分 析 其 在 果 实 发 育 过 程 中 的 表 达 量, 并 对 其 结 构 特 征 和 物 种 间 的 同 源 性 进 行 分 析, 同 时 分 析 铜 胁 迫 下 葡 萄 根、 茎 和 叶 中 的 V v C T R 1 表 达 情 况。 结 果 与 对 照 相 比, 过 量 的 硫 酸 铜、 硫 酸 铜 与 柠 檬 酸 或EDTA 混 合 处 理 可 以 抑 制 葡 萄 植 株 新 根 的 发 育 数 量 和 长 度, 促 进 叶 片 叶 绿 素 的 降 解 和 落 叶 速 率, 增 加 叶 柄 基 部 乙 烯 的 产 生 以 及 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶 和 纤 维 素 酶 活 性, 尤 其 以 硫 酸 铜 和EDTA 混 合 处 理 伤 害 更 明 显。 Cu 2+ 在 植 株 叶、 茎、 根 中 的 含 量 从 小 到 大 分 别 依 次 为 上 部 叶 片、 中 部 叶 片、 下 部 叶 片, 上 部 茎、 中 部 茎、 下 部 茎, 老 根、 幼 根; 硫 酸 铜 处 理 植 株 中 的Cu 2+ 含 量 高 于 对 照, 并 且 随 着 处 理 时 间 的 延 长 含 量 不 断 升 高, 尤 其 是 硫 酸 铜 与 柠 檬 酸 或 者EDTA 混 合 处 理 植 株 中Cu 2+ 含 量 更 高。 克 隆 的 铜 转 运 蛋 白 基 因 V v C T R 1 中 无 内 含 子, 其 编 码 的 蛋 白 含 有3 个 跨 膜 区TMD13,N 端 含 有 1 个 甲 硫 氨 酸 富 含 区。 V v C T R 1 基 因 的 表 达 量 随 着 果 实 发 育 逐 渐 降 低。 无 论 在 根 中 还 是 在 不 同 部 位 的 茎 和 叶 中, V v C T R 1 都 能 被 铜 诱 导。 结 论 过 量 的 铜 会 对 葡 萄 植 株 造 成 伤 害, 尤 其 与Cu 2+ 的 螯 合 剂 柠 檬 酸 或EDTA 同 时 存 在 时, 能 使 更 多 的Cu 2+ 进 入 植 物 体 内, 最 终 引 起 葡 萄 植 株 死 亡。 关 键 词 : 铜; 葡 萄; 生 理 性 状; 基 因 表 达 中 图 分 类 号 :S663.1    文 献 标 志 码 :A    文 章 编 号 :1000-2030 (2018 )02-0256-10 Physiologicalresponsestocopperstressingrapeplantsandcloning andanalysisofcoppertransport V v C T R 1gene LIUZhongjie,LIAo,CUIMengjie,XUYingzhi,SHANGGUANLingfei,JIAHaifeng, WANGChen,FANGJinggui (CollegeofHorticulture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China) Abstract:ObjectivesThisstudyaimstoanalyzetheeffectsofheavymetalcopperonthegrowthanddevelopmentofgrapeplants, andprovidedtheoreticalbasisforrevealingthemechanismofdamagebyheavymetalcoppertoplants.MethodsTheexcessCuSO 4 andthemixtureofCuSO 4 anditschelatingagentwereappliedongrapeseedlings,therootandleafdevelopment,leafchlorophyll content,andthedistributionofcopperinplantswereanalyzed;coppertransport V v C T R 1genewasisolated,anditsexpressionlevels wereanalyzedduringfruitdevelopment. Itsstructureandhomologyamongspecieswereanalyzed,anditsexpressionlevelswere analyzedunderthecopperstressinroots,stemsandleaves.ResultsComparedtothecontrol,excessCuSO 4 ,themixtureofCuSO 4 andcitricacidorEDTAinhibitedthedevelopmentofthenumberandlengthofnewrootsingrape,promotedthedegradationof chlorophyllandleafratedrop,andincreasedtheproductionofethyleneandthepolygalacturonaseandcellulaseactivitiesinpetiole base.EspeciallytherewereobviousdamageinmixtureofCuSO 4 andEDTAtreatment.ThecontentofCu 2+ inleaves,stemsandroots fromsmalltolargewasthemorphologicallyuptodownofthestemsandleavesandoldrootstonewrootsinturn.Andthecontentof copperioninCuSO 4 treatedplantswashigherthancontrol,andshowedanincreasewiththeextensionoftime,especiallythemixture ofCuSO 4 andcitricacidorEDTAtreatmenthadmorecopperions;therewasnointronincoppertransport V v C T R 1gene,andit containedthreetransmembraneregionsofTMD1-3,whichNcontainedamethioninerichregion.Itsexpressiondecreasedgradually withthefruitdevelopment,andtheexpressionof V v C T R 1genewasenhancedundercopperbothinrootsandindifferentpositionsof stemsandleaves.ConclusionsExcessivecoppercancausedamagetograpeplants,especiallywhencombinedwithCu 2+ chelate  第2 期 刘 众 杰, 等: 铜 胁 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 响 应 和 铜 转 运 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析 citricacidorEDTA,whichcanmakemoreCu 2+ entertheplantandultimatelycausegrapeplantdeath. Keywords:opper;grape;physiologicalcharacter;geneexpression 近 年 来, 随 着 化 肥 和 农 药 普 遍 施 用, 果 园 重 金 属 污 染 日 益 严 重。 土 壤 中 的 重 金 属 元 素 主 要 是 指 镉、 汞、 铜、 铅、 铬、 锌、 镍 和 类 金 属 元 素 砷 1 , 其 中 锌 和 铜 还 是 植 物 的 必 需 元 素。 适 合 植 物 生 长 的 铜 含 量 范 围 很 小,当 土 壤 中 的 有 效 铜 含 量 低 于5mgkg -1 时, 植 株 就 会 出 现 缺 素 症, 高 于30mgkg -1 时 植 株 则 表 现 中 毒 症 状 2 。 由 于 含 铜 杀 菌 剂 的 使 用 以 及 工 业 上 含 铜 污 染 物 的 排 放, 果 园 中 铜 含 量 严 重 超 过 正 常 范 围。 卢 树 昌 等 3 研 究 结 果 表 明, 山 东 苹 果 园 土 壤 铜 含 量 达44.8mgkg -1 。 当 重 金 属 积 累 到 一 定 程 度 就 会 对 果 园 土 壤 造 成 污 染, 进 而 影 响 果 树 的 生 长 发 育 和 果 品 质 量, 再 通 过 食 物 链 危 害 人 体 健 康。 因 此 铜 污 染 已 成 为 世 界 性 问 题。 葡 萄( V i t i s v i n i f e r a) 是 我 国 重 要 的 果 树, 在 生 长 发 育 过 程 中 常 常 受 到 黑 痘 病、 霜 霉 病、 灰 霉 病、 炭 疽 病 和 白 腐 病 等 真 菌 性 病 害 的 影 响, 因 此 喷 施 药 剂 是 葡 萄 园 管 理 不 可 缺 少 的 环 节, 而 波 尔 多 液 是 使 用 频 率 比 较 高 的 杀 菌 剂, 其 主 要 成 分 是 硫 酸 铜。 一 般 在 葡 萄 生 长 季 节 需 喷 波 尔 多 液36 次, 长 期 高 剂 量 喷 施 波 尔 多 液 会 造 成 土 壤 中 铜 的 积 累, 最 终 导 致 树 体 中 重 金 属 的 积 累 4 ; 法 国 部 分 葡 萄 园 土 壤 含 铜 量 高 达1280 mgkg -15 ; 天 津 郊 区 不 同 果 园 土 壤 中 含 铜 差 异 很 大, 最 高 的 葡 萄 园 铜 累 积 量 高 达216.7mgkg -16 。 铜 在 果 园 土 壤 中 比 非 果 园 土 壤 中 的 积 累 明 显, 且 园 龄 越 大 土 壤 中 的 铜 积 累 越 多。 植 物 遭 受 铜 毒 害 时, 最 先 感 受 毒 害 的 器 官 是 根。 铜 被 根 系 吸 收 后 通 过 铜 转 运 蛋 白 运 输 至 植 物 的 其 他 器 官, 铜 在 不 同 器 官 的 积 累 规 律 由 大 到 小 依 次 为 根 系、 枝 干、 新 梢、 叶 片 7 。 铜 的 有 效 态 被 植 物 吸 收 后 大 部 分 富 集 于 根 部。 过 量 的 铜 会 导 致 膜 脂 过 氧 化、 碱 基 突 变、DNA 链 的 断 裂、 蛋 白 质 的 损 伤, 导 致 植 物 代 谢 紊 乱, 甚 至 植 物 死 亡 8-9 。 研 究 表 明 高 浓 度 铜 胁 迫 下, 柑 橘 须 根 腐 烂, 根 干 质 量 显 著 下 降, 根 中 的 铜 含 量 显 著 升 高 10 ; 苹 果 幼 树 的 株 高、 根 长、 根 系 活 力、 叶 绿 素 含 量 及 各 部 位 干 质 量 等 显 著 降 低 11 ; 苹 果 花 粉 萌 发 及 花 粉 管 伸 长 12 、 欧 洲 越 橘 种 子 的 发 芽 等 受 到 抑 制 13 。 本 研 究 以 栽 培 品 种 夏 黑 幼 苗 为 研 究 对 象, 分 析 了 铜 在 植 株 中 的 积 累 和 植 株 的 生 理 及 分 子 变 化, 为 探 究 葡 萄 对 铜 胁 迫 的 应 答 以 及 果 树 产 业 应 对 铜 污 染 提 供 依 据。 1 材 料 与 方 法 1.1 植 物 材 料 试 验 材 料 为 南 京 农 业 大 学 实 验 农 场 的1 年 生 葡 萄 品 种 夏 黑, 其 生 长 于 营 养 土 与 蛭 石( 质 量 比 为11) 的 花 盆 中。 在 采 集 苗 木 前2 个 月, 每2 周 用Hoagland 植 物 营 养 液 进 行 浇 灌, 期 间 用 水 浇 灌1 次。 待 植 株 生 长 至0.5m 时, 用 硫 酸 铜 进 行 处 理。 1.2 试 验 处 理 与 样 品 采 集 试 验 设 置4 个 处 理:1)1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 人 工 螯 合 剂EDTA(CuSO 4 +EDTA);2)1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 柠 檬 酸(CuSO 4 +CA);3) 单 施1mmolL -1 CuSO 4 (CuSO 4 );4)Hoagland 溶 液(CK)。 将 葡 萄 植 株 放 置 于 含 上 述 溶 液 的 玻 璃 杯 中, 并 在 溶 液 中 安 置 通 气 装 置 防 止 植 株 因 缺 少 氧 气 而 快 速 致 死。 所 用 材 料 共3 种 取 样 方 式:1) 葡 萄 植 株 在 上 述 溶 液 中 分 别 放 置2、4 和6d, 分 别 取 植 株 的 上 部、 中 部 和 下 部 叶 片, 上 部、 中 部 和 下 部 茎 段, 幼 根 和 老 根, 用 去 离 子 水 洗 涤2 次, 烘 干 至 恒 质 量。 称 取0.5g 样 品 于 液 氮 中 研 磨,然 后 用1mL 水 溶 解 至 匀 浆。2) 植 株 在 不 同 的 溶 液 中 生 长6d, 取 出 植 株, 统 计 新 根 数 量, 测 量 新 根 长 度, 计 算 平 均 值。 重 复3 次。3) 植 株 在 不 同 的 溶 液 中 生 长12d, 期 间 每 隔2d 统 计 叶 片 数 量, 测 定 叶 片 叶 绿 素 含 量, 并 取12d 时 脱 落 叶 片 叶 柄 底 端, 测 定 乙 烯 含 量。 对 于 果 实 样 品 的 采 集, 采 用5 年 生 夏 黑 葡 萄, 分 别 在 花 后2、4、6、8( 转 色 期)、10、12、14 周( 成 熟 期) 采 集 果 实, 去 掉 果 皮 后 液 氮 中 速 冻, 放 置-80 保 存 备 用。 1.3 指 标 测 定 铜 含 量 的 测 定 参 照 潘 逸 等 14 的 方 法。 总 叶 绿 素 的 含 量 测 定: 称 取0.2g 叶 片, 用80%( 体 积 分 数) 丙 酮 研 磨, 然 后 用 滤 纸 过 滤、 洗 涤, 定 容 至25mL, 立 即 在645 和663nm 波 长 下 测 定 吸 光 值 15 。 叶 绿 素 总 含 量=(8.04 A 663 +20 .29 A 645 ) V / W1000。 式 中: V 为 提 取 液 的 体 积(mL); W 为 叶 片 的 质 量(g)。 乙 烯 含 量 的 测 定: 取 叶 柄 基 部 离 层 组 织 放 入 密 闭 盒 子 内,1h 后 利 用 气 相 色 谱 法 测 定 乙 烯 含 量 16 。 样 品 中 乙 烯 含 量(LL -1 )= 样 品 峰 高 标 样 浓 度/ 标 准 峰 高。 样 品 乙 烯 生 成 速 率(Lg -1 h -1 )= 乙 烯 含 量 7 5 2 南 京 农 业 大 学 学 报 第41 卷 (LL -1 ) 容 器 体 积(L)/ 密 封 时 间(h) 样 品 质 量(g)。 多 聚 半 乳 糖 醛 酸 酶(PG) 和 纤 维 素 酶 活 性 的 测 定 参 照Sun 等 16 的 方 法。 重 复3 次。 1.4 RNA 的 提 取 纯 化 与cDNA 合 成 总RNA 的 提 取 和 消 化 参 照 贾 海 锋 等 17 的 方 法。 PowerScript TM 反 转 录 酶 购 自Clontech 公 司, DNase 酶、 T aq 酶、dNTPs、DNAMarker, 荧 光 定 量 染 料SYBRGreen 均 购 自TaKaRa 公 司。 所 用 引 物 由 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 公 司 合 成。 1.5 生 物 信 息 学 分 析 利 用MEGA5 软 件 将 葡 萄VvCTR1 与 其 他11 个 物 种 的CTR 蛋 白 序 列 进 行 分 析 并 构 建 进 化 树。 1.6 RT-qPCR 利 用 软 件PrimerPremier5.0 设 计 荧 光 引 物。 以 葡 萄 中 的 A c t i n 基 因 为 内 参 基 因, 根 据 葡 萄 中 铜 转 运 蛋 白 序 列 设 计 荧 光 定 量qPCR 引 物( 表1)。 按 照SYBR P r e m i x E x T aq TM 试 剂 盒( 宝 生 物 工 程 有 限 公 司) 操 作 指 导, 采 用 实 时 荧 光 定 量PCR(RT-qPCR) 的 方 法, 检 测 基 因 的 稀 释 相 对 表 达 量。 对 反 转 录 所 得 的cDNA 分 别 进 行5 个 梯 度(1、10 -1 、10 -2 、10 -3 和10 -4 ) 稀 释, 实 施 荧 光 定 量 反 应, 然 后 绘 制 相 对 标 准 曲 线。 相 关 基 因 和 A c t i n 基 因RT-qPCR 扩 增 的 总 反 应 体 系 为20L, 包 括:10LSYBR P r e m i x E x T aq TM 混 合 液,2L cDNA,0.4L 上 游 引 物(10molL -1 ),0.4L 下 游 引 物(10molL -1 ),7.2L 无 核 酸 污 染 的 灭 菌 水。 反 应 程 序 为:942min;9420s,5530s,7230s,40 个 循 环, 每 次 循 环 第3 步 进 行 荧 光 采 集, 最 后 从 60 升 温 至95 即 每 隔30s 上 升0.5, 总 共71 个 循 环, 检 测 其 荧 光 值, 并 绘 制 熔 点 曲 线, 标 准 品cDNA 和 待 测 样 品 均 重 复3 次。 采 用2 - C T 法 进 行 数 据 处 理。 表1 引 物 序 列 及PCR 扩 增 片 段 大 小 Table1 SequenceofprimersandsizesofPCRamplifiedproducts 基 因 Gene 引 物 序 列 Sequenceofprimer 片 段 大 小/bp Fragmentsize 登 录 号 Accessionnumber 用 途Usage V v C T R 1 5-CCTATTCAAACTCCGACGC-3 5-TCCACCACCTCTTCCTGAT-3 206 NM 001281256 qPCR A c t i n 5-GGATTCTGGTGATGGTGTG-3 5-CAGCAAGGTCAAGACGAA-3 150 XM 002273532 qPCR V v A C O 1 5-CTTGTTTCCAGGTTGTGTC-3 5-TGTGTGAGGAGAGACTAACT-3 121 NM 001280942 qPCR V v C T R 1 5-ATGATGCACATGACTCTGTAC-3 5-TCAGGAACAGGCACACGAGT-3 446 全 长Full-length V v C T R 1 5-TCTTCTCCGTCTTCTACCA-3 5-ATCTCAGGAACAGGCACA-3 343 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 2 5-ATGTATGCTCTCGCCTTG-3 5-CTAACCAAACACACCATCAC-3 321 HQ108186 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 3 5-ATGTCTCAGCATGGTGGCAT-3 5-AGGTGCCACAGAGAGTGCAC-3 391 HQ108187 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 4 5-ATCAGCCTCTTCCCAGAA-3 5-GGACATCAAAGCCAGCAT-3 380 HQ108188 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 5 5-GAGTGGCTTTCCTATTGCC-3 5-ATTTCCGTCCTTACACAGAC-3 368 HQ108189 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 6 5-AACATCCACCACCACAAG-3 5-CAGCAACTCATAGAAGGAAG-3 415 HQ108190 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 7 5-ATGGTGCCAATGAACAGCAC-3 5-TCAGAGGCTTTCTCATAAGG-3 500 HQ108191 半 定 量 Semi-quantitative V v C T R 8 5-ATGACCTTCTACTGGAGCA-3 5-AAGCAGAGAGAGAGAGAGG-3 456 HQ108192 半 定 量 Semi-quantitative 1.7 数 据 分 析 采 用SPSS18.0 软 件 进 行 单 因 素 方 差 分 析,Duncans 法 进 行 多 重 比 较。 数 据 均 以 x SE 表 示。 2 结 果 与 分 析 2.1 铜 胁 迫 对 葡 萄 植 株 中 铜 离 子 积 累 的 影 响 由 表2 可 见: 随 着 处 理 时 间 的 延 长, 铜 胁 迫 后 葡 萄 植 株 各 部 位 铜 含 量 明 显 升 高。 幼 嫩 根 中 积 累 的 铜 离 8 5 2  第2 期 刘 众 杰, 等: 铜 胁 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 响 应 和 铜 转 运 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析 子 多 于 老 根, 而 且 植 株 各 部 位 中 的 铜 离 子 积 累 量 由 下 到 上 逐 渐 减 少, 由 小 到 大 依 次 为 上 部 叶 片、 中 部 叶 片、 下 部 叶 片, 上 部 茎、 中 部 茎、 下 部 茎, 老 根、 幼 根。 表2 葡 萄 植 株 各 部 位 的 铜 含 量 Table2 Coppercontentindifferentpartsofgrapeplant mg g -1 处 理 Treatment 处 理 时 间/d Treatmenttime 上 部 叶 片 Upleaf 中 部 叶 片 Middleleaf 下 部 叶 片 Lowleaf 上 部 茎 Upstem 中 部 茎 Middlestem 下 部 茎 Lowstem 幼 根 Newroot 老 根 Oldroot 2 0.250.08 d 0.410.15 d 0.490.10 d 0.190.03 c 0.270.05 d 0.330.07 d 0.890.09 d 0.670.13 d CK 4 0.290.05 d 0.430.03 d 0.650.06 d 0.120.04 d 0.210.09 d 0.320.08 d 1.210.22 d 0.920.15 d 6 0.360.06 d 0.450.08 d 0.690.11 d 0.290.06 d 0.230.08 d 0.500.11 d 1.520.33 d 1.630.62 d 2 0.490.14 c 0.880.17 bc 1.030.22 bc 0.290.08 bc 0.390.07 c 0.770.16 c 1.790.27 c 1.550.32 c CuSO 4 4 0.680.11 ab 1.060.27 b 1.380.34 b 0.420.08 b 0.880.13 ab 1.470.14 b 3.270.45 b 4.270.27 b 6 0.870.08 a 2.190.52 a 2.530.17 a 0.870.09 a 1.160.21 a 2.230.37 a 5.460.55 a 5.730.47 a 2 0.600.04 c 1.370.15 c 7.410.87 c 0.530.21 bc 2.250.33 c 5.980.45 c 2.840.52 c 3.880.66 c CuSO 4 +CA 4 1.800.12 ab 2.600.53 ab 9.690.67 ab 0.700.20 b 4.530.66 b 10.760.52 b 5.370.87 b 8.760.82 b 6 2.360.64 a 3.030.43 a 11.891.22 a 1.290.24 a 7.370.88 a 17.901.86 a 8.540.93 a 11.570.82 a 2 0.630.07 c 1.530.09 c 10.670.82 bc 0.470.11 c 1.230.23 c 2.340.53 c 6.540.77 bc 8.470.53 bc CuSO 4 +EDTA 4 1.420.37 b 3.210.54 b 13.981.38 b 4.700.37 ab 3.100.15 b 10.000.78 b 7.540.85 b 9.541.21 b 6 3.620.24 a 4.260.32 a 21.812.38 a 5.501.08 a 9.681.60 a 23.262.61 a 14.701.83 a 13.721.52 a注:1)CK: 对 照;CuSO 4 :1mmolL -1 CuSO 4 ;CuSO 4 +CA:1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 CA( 柠 檬 酸);CuSO 4 +EDTA:1mmolL -1 CuSO 4 + 1mmolL -1 EDTA。 2) 不 同 字 母 表 示 处 理 间 差 异 显 著( P0.05)。 下 同。 Note:1)CK:Control;CuSO 4 :1mmolL -1 CuSO 4 ;CuSO 4 +CA:1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 CA(citricacid);CuSO 4 +EDTA:1mmolL -1 CuSO 4 +1mmolL -1 EDTA. 2)Differentlettersindicatesignificantdifferenceat0.05levelamongdifferenttreatments.Thesameasfollows. 2.2 铜 胁 迫 对 葡 萄 根 生 长 发 育 的 影 响 由 图1 可 见: 对 照 植 株 在Hoagland 营 养 液 中 已 经 开 始 有 新 根 生 出, 数 量 为38 条, 根 长19cm 左 右, 显 著 高 于3 种 铜 胁 迫 处 理。 根 生 长 状 态 最 好 的 是 单 施CuSO 4 处 理, 新 生 根 数 为19 条, 显 著 高 于CuSO 4 + EDTA 和CuSO 4 +CA 处 理; 单 施CuSO 4 处 理 根 的 平 均 长 度11cm 左 右, 显 著 高 于CuSO 4 +EDTA 处 理, 但 与 CuSO 4 +CA 处 理 差 异 不 显 著。 图1 铜 胁 迫 对 葡 萄 植 株 根 生 长 的 影 响 Fig1 Effectsofcopperstressongraperootgrowth 2.3 铜 胁 迫 对 葡 萄 叶 片 生 长 发 育 的 影 响 从 图2 可 见: 铜 胁 迫 使 幼 苗 叶 片 从 下 部 到 上 部 开 始 脱 落, 其 中CuSO 4 +EDTA 处 理 的 葡 萄 幼 苗 生 长 状 态 最 差, 单 施CuSO 4 和CuSO 4 +CA 处 理 的 叶 片 脱 落 趋 势 相 似。 在 铜 胁 迫6d 时, 单 施CuSO 4 和CuSO 4 +CA 处 理 的 幼 苗, 植 株 底 端 的 叶 片 已 有 脱 落, 但 是 中 上 部 的 叶 片 长 势 良 好; 而CuSO 4 +EDTA 处 理 植 株 底 端 和 中 9 5 2 南 京 农 业 大 学 学 报 第41 卷 部 的 叶 片 都 已 经 脱 落, 只 有 最 上 部 的 幼 嫩 叶 片 未 脱 落。 铜 胁 迫12d 后,3 种 处 理 的 剩 余 叶 片 量 都 已 低 于 20%, 其 中CuSO 4 +EDTA 处 理 的 葡 萄 幼 苗 叶 片 在12d 时 已 全 部 脱 落。 图2 铜 胁 迫 对 葡 萄 叶 片 生 长 的 影 响 Fig2 Effectsofcopperstressongrapeleafgrowth 由 图3 可 见: 铜 处 理 葡 萄 植 株12d 后 会 使 叶 片 黄 化。 单 独CuSO 4 处 理 的 植 株 脱 落 的 叶 片 还 带 青 色; 而CuSO 4 +CA 处 理 的 植 株 其 脱 落 的 叶 片 呈 黄 色;CuSO 4 +EDTA 处 理 的 植 株 其 脱 落 的 叶 片 已 经 干 枯。 表 明 铜 处 理 后 的 植 株 叶 绿 素 降 解 严 重。 图3 铜 胁 迫 对 葡 萄 植 株 叶 绿 素 含 量 的 影 响 Fig3 Effectsofcopperstressongrapeleafchlorophyllcontent 从 图4 可 以 看 出: 对 照 植 株 叶 柄 底 端 的 乙 烯 含 量 为0.23LL -1 , 而CuSO 4 处 理 乙 烯 含 量 升 高 了 十 几 倍, 尤 其 是CuSO 4 +EDTA 处 理 乙 烯 含 量 达 到 了3.25LL -1 。 同 时, 乙 烯 合 成 路 径 中 的 V v A C O 1 基 因 的 表 达 量 也 在 铜 胁 迫 下 升 高, 说 明 铜 胁 迫 诱 导 了 叶 柄 底 端 乙 烯 的 产 生。 而 且 乙 烯 含 量 的 上 升 也 使 得 多 聚 半 乳 0 6 2  第2 期 刘 众 杰, 等: 铜 胁 迫 下 葡 萄 植 株 的 生 理 响 应 和 铜 转 运 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 及 分 析 糖 醛 酸 酶(PG) 和 细 胞 纤 维 素 酶 活 性 升 高, 并 显 著 高 于 对 照。 这 些 生 理 现 象 的 变 化 导 致 了 叶 柄 底 端 离 层 的 产 生, 最 后 导 致 叶 片 脱 落。 图4 铜 胁 迫 对 葡 萄 叶 柄 基 部 乙 烯 和 细 胞 壁 酶 活 性 的 影 响 Fig4 Effectsofcopperstressonethylenecontentandcellwallenzymeactivityofthegrapeleafpetiolebase 图5 铜 转 运 蛋 白 基 因 的 克 隆 及 表 达 量 Fig5 Coppertransportgenecloneandexpressionlevels 2.4 铜 转 运 蛋 白 基 因 V v C T R 1 的 克 隆 表 达 和 生 物 信 息 学 分 析 由 图5 可 见: 从 植 株 的 幼 嫩 叶 片 中 扩 增 了 V v C T R 1 基 因, 全 长 为447bp, 编 码149 个 氨 基 酸 序 列。 同 时 提 取 了 幼 嫩 叶 片 的DNA 进 行 了 V v C T R 1 基 因 的 扩 增, 与mRNA 扩 增 的 序 列 相 比, 发 现 V v C T R 1 基 因 没 有 内 含 子 序 列, 这 说 明 V v C T R 1 基 因 对 铜 胁 迫 可 快 速 应 答。 V v C T R 1 基 因 在 果 实 发 育 成 熟 过 程 前 期 表 达 量 很 1 6 2 南 京 农 业 大 学 学 报 第41 卷 高, 在 果 实 成 熟 后 开 始 有 些 下 降。 同 时 对 葡 萄 中 的 其 他 铜 转 运 蛋 白 基 因 的 表 达 量 也 进 行 了 分 析, V v C T R 8 基 因 在 果 实 发 育 前 期 表 达 量 很 高, 但 是 在 第8 周 的 转 色 期 开 始 下 降 直 至 成 熟; V v C T R 2、 V v C T R 3、 V v C T R 4、 V v C T R 5、 V v C T R 6、 V v C T R 7 等 基 因 在 果 实 发 育 过 程 中 的 表 达 量 均 比 较 低, 而 且 没 有 发 生 剧 烈 的 变 化。 在 8 个 铜 转 运 蛋 白 基 因 中, 只 有 V v C T R 1 受 铜 处 理 的 强 烈 诱 导, 因 此 选 择 V v C T R 1 做