基于高通量测序的草莓白粉病和向日葵白粉病群落组成分析.pdf

基于高通量测序的草莓白粉病和向日葵 白粉病群落组成分析 张振荣 1 朱维贤 1 董琼娥 2 钱 玲 1 任建青 1 李亚平 3 王 薇 1 1 昆 明 市 农 业 科 学 研 究 院 云 南 昆 明 650034 2 昆 明 市 植 保 植 检 站 云 南 昆 明 650032 3 昆 明 三 正 生 物 科 技 有 限 公 司 云南 昆明 650217 摘要 目的 探明相邻地点同时爆发草莓白粉病 CM 向日葵白粉病 XRK 的微生物多样性与 群落种类差异性 为研究白粉病的侵染特点和防治提供理论依据 方法 2023年5 7月 分别取位于昆 明市农业科学院嵩明基地的温室大棚草莓白粉病样品 与之相隔300 m的露天爆发严重的向日葵白粉病样 品 进行Illumina MiSeq高通量测序 对这2种植物感染白粉病部位表面的白粉层真菌群落组成与结构进行 比较分析 结果 在97 相似水平下物种分析和聚类显示 草莓白粉病样本群落涵盖1域1界5门17纲 26目35科39属50种62个OTU的真菌 向日葵白粉病样本群落涵盖1域1界2门5纲7目10科13属13种 15个OTU的真菌 草莓白粉病样本的物种丰富度高于向日葵白粉病样本 2个样本的真菌群落组成与物种 在门 科和属水平上均呈显著差异 子囊菌门 Ascomycota 在2个样本的相对丰度均大于93 草莓白粉 病优势群落以枝孢科 Cladosporiaceae 枝孢属 Cladosporium 真菌为主 同时含有青霉科 Aspergillacea 青霉属 Penicillium 白粉菌科 Erysiphaceae 叉丝单囊壳属 Podosphaera 等多种真菌微生物 向日葵 白粉病优势群落由白粉菌科 Erysiphaceae unclassified f Erysiphaceae真菌组成 群落组成相对单一 结 论 昆明市相邻地点同时爆发的向日葵白粉病和草莓白粉病的微生物多样性与群落种类差异极显著 草莓 白粉病病原菌主要为枝孢属 Cladosporium 真菌 同时含有其他多种真菌微生物 向日葵白粉病由白粉菌 科 Erysiphaceae unclassified f Erysiphaceae真菌组成 群落组成相对单一 且云南省昆明市向日葵白粉病病 原菌种类为白粉菌科 Erysiphaceae 真菌为首次报道 关键词 向日葵白粉病 草莓白粉病 真菌多样性 白粉菌科 Illumina高通量测序 中图分类号 S435 121 4 6 文献标识码 A 文章编号 1001 3601 2025 03 0046 0093 08 Community Composition Analysis of Strawberry Powdery Mildew and Sunflower Powdery Mildew Based on High throughput Sequencing ZHANG Zhenrong1 ZHU Weixian1 DONG Qiong e2 QIAN Ling1 REN Jianqing1 LI Yaping3 WANG Wei1 1 Kunming Academy of Agricultural Sciences Kunming Yunnan 650034 2 Kunming Plant Protection and Inspection Station Kunming Yunnan 650032 3 Kunming Saturn Biological Technology Group Co Ltd Kunming Yunnan 650217 China Abstract Objective The differences in microbial diversity and community species of strawberry powdery mildew CM and sunflower powdery mildew XRK that occurred simultaneously in adjacent locations were studied to provide the theoretical basis for studying the infection features prevention and control of powdery mildew Method From May to July 2023 the Illumina MiSeq high throughput sequencing of strawberry powdery mildew samples in greenhouse of the Songming Base of Kunming Academy of Agricultural Sciences and outdoor sunflower powdery mildew samples located 300 meters apart was conducted to compare and analyze the fungal community composition and structure of powder layer in surface of two plant parts infected with powdery mildew Result The community of strawberry powdery mildew sample included 62 OTUs of fungi in 1 domain 1 kingdom 5 phyla 17 classes 26 orders 35 families 39 genera 50 species while the community of sunflower powdery mildew sample included 15 OTUs of fungi in 1 domain 1 kingdom 2 phyla 5 classes 7 orders 10 families 13 genera 13 species through species analysis and cluster analysis at the similarity level of 97 The species richness of strawberry powdery mildew sample was higher than that of sunflower powdery mildew sample There were significant differences in fungal community composition and species between the two samples at phylum family and genus levels The relative abundance of Ascomycota in both powdery mildew samples was more than 93 The community of strawberry powdery mildew was dominated by Cladosporium of the family Cladosporiaceae simultaneously containing Penicillium of the family Aspergillaceae Podospaera of the family Erysiphaceae and other fungi 收稿日期 2024 05 24 基金项目 昆明市级财政支持项目 农业资源环境关键技术研发及推广应用 昆财农 2023 号 作者简介 张振荣 1986 女 高级农艺师 硕士 从事农业微生物研究 E mail 402023657 贵州农业科学 Guizhou Agricultural Sciences 2025 53 3 93 100 DOI 10 3969 j issn 1001 3601 2025 03 012microorganism Meanwhile the community of sunflower powdery mildew was dominated by unclassified f Erysiphaceae of the family Erysiphaceae and the community composition was relatively single Conclusion There are very significant differences in microbial diversity and community species between the strawberry powdery mildew and sunflower powdery mildew that erupted simultaneously in adjacent locations of Kunming City The pathogen of strawberry powdery mildew is mainly Cladosporium containing other multiple fungi microorganism Sunflower powdery mildew is dominated by unclassified f Erysiphaceae of the family Erysiphaceae and the community composition is relatively single The pathogen of sunflower powdery mildew in Kunming Yunnan Province is first reported to be Erysiphaceae Key words sunflower powdery mildew strawberry powdery mildew fungal diversity Erysiphaceae Illumina high throughput sequencing 0 引言 研 究 意 义 白 粉 病 病 原 菌 常 在 寄 主 植物的表面 叶片 茎 花 果实等 产生很 多的分生孢子和菌丝结构 影响植株的光合 作 用 和 整 体 长 势 且 严 重 影 响 果 实 的 外 观 口感和品质等 进而导致寄主作物遭受减产 和经济损失 长期以来 我国许多地区白粉 病的发生普遍而严重 因此白粉病的有效治 理 对 农 业 可 持 续 发 展 具 有 重 要 意 义 前 人 研 究 进 展 关 于 国 内 草 莓 白 粉 病 病 原 菌 种 类 分 子 鉴 定 已 有 报 道 如2014年 河 南 商 丘温室草莓白粉病病原菌为奥隆特高氏白 粉菌 Golovinomyces orontii 1 2019年昆明市 西山区温室草莓白粉病病原菌为叉丝单囊 壳属 Podosphaera 2 但多数文献对草莓白 粉病病原菌的描述是引用二三十年前采用 经 典 形 态 学 观 察 命 名 的 种 类 和 名 称 3 如 羽 衣 草 单 囊 壳 Sphaerotheca aphanis Wallr Braun 等 资料信息相对陈旧 关于向日葵 白 粉 病 的 文 献 报 道 较 少 史 明 等 4 5 介 绍 了 黑 龙 江 省 向 日 葵 白 粉 病 的 危 害 症 状 侵 染 特性和常规防治方法 并未提及病原菌的分 类 鉴 定 1987年 陈 桂 清 等 6 报 告 了 向 日 葵 白 粉 病 病 原 菌 是 棕 丝 单 囊 壳 Sphaerotheca fusca 2007年刘铁志 7 报道了内蒙古向日 葵 白 粉 病 病 原 菌 是 棕 丝 叉 丝 单 囊 壳 Podo sphaera fusca 两者均采用的是真菌形态学 经典分类方法 目前 白粉病病原菌尚无法 实现人工分离纯培养 对白粉病病原菌的鉴 定分类主要依靠真菌形态学经典分类方法 8 但这类方法存在局限性 未对白粉菌的分子 生物学特性进行研究 同时对于由多种真菌 侵染的白粉病 很难作出群落组成判断和鉴 定 随着分子生物技术的发展 用高通量测 序 技 术或ITS基 因 测 序 技 术 鉴 定 白 粉 病 病 原菌的种类或分析生物多样性 已经成为近 年来发展的趋势 9 10 研究切入点 近年 来 受昆明冬春温暖干燥气候的影响 白粉 病在昆明地区的草莓和向日葵等植物上多 发 常 发 给 当 地 农 业 生 产 造 成 了 严 重 损 害 而 对这2种 作 物 白 粉 病 病 原 菌 的 调 查 和 研 究 却 鲜 有 报 道 拟 解 决 的 关 键 问 题 利 用Illumina MiSeq高通量测序平台 对位于云 南省昆明市嵩明县的塑料温室大棚草莓和 露天向日葵的白粉病病原菌进行真菌多样 性和群落组成对比分析 以期了解相邻地点 不同作物同时爆发白粉病病原菌的多样性 与群落种类差异性 为进一步研究白粉病的 侵染特点和防治提供理论依据 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 供试植物 2023年5 7月 昆明市农 业 科 学 研 究 院 嵩 明 基 地 东经103 096 333 北纬25 337 102 海拔1 903 5 m 园区内某温 室 大 棚 面积600 m2 的 草 莓 爆 发 严 重 白 粉 病 与其相隔300 m的露天向日葵同时爆发 严重白粉病 叶片白粉层均厚且明显 发病 率均约70 1 1 2 试 剂 和 设 备 DNA抽 提 试 剂 盒 FastDNA Spin kit for Soil 购自MP Biomedicals生 物 医 学公司 GeneJET胶回收试剂盒购自Thermo fisher公司 Illumina高通量测序分析所需试 剂 设备 检测和操作等均由上海美吉生物 医药科技有限公司提供 94 贵 州 农 业 科 学1 2 采集样品 2023年6月27日 对草莓白粉病叶片和 向 日 葵 白 粉 病 叶 片 分 别 取 样 编 号为CM 草 莓白粉病 和XRK 向日葵白粉病 具体取 样方法 在每种作物的发病区域内选用5点 法 每点用灭菌剪刀剪取3片白粉均匀的叶 片 每个样品5点共15片叶片放进无菌采集 袋 中 尽 快 带 回 实 验 室 在 无 菌 操 作 台 上 分别用无菌脱脂棉擦拭样品表面的白粉孢 子 将脱脂棉擦粘尽量多的白粉孢子并混匀 后 放进无菌离心管中 扭紧管盖 封口膜封 口 80 保 存 送 上 海 美 吉 生 物 医 药 科 技 有限公司进行高通量测序 1 3 DNA提取 PCR扩增和高通量测序 样品总DNA按DNA抽提试剂盒说明书 提 取 用NanoDrop2000 美 国Thermo Scien tific公 司 检 测DNA浓 度 和 纯 度 用1 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检测DNA提 取 质 量 用 ITS3F 5 GCATCGATGAAGAACGCAGC 3 和 ITS4R 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 引 物 11 对ITS2区进行PCR扩增 扩增程序 反 应 参 数 扩 增 产 物 处 理 和 高 通 量 测 序 等 均 由上海美吉生物医药科技有限公司按相应 标准执行 1 4 数据处理 使用Fastp 12 fastp version 0 19 6 软 件 对 双 端 原 始 序 列 进 行 质 控 使用FLASH 13 version 1 2 11 http www cbcb umd edu software flash 软 件 进 行 拼 接 使用UPARSE v7 1 14 15 软件 uparse 根据97 的 相 似 度 对 质 控 拼 接 后 的序列进行操作分类单元OTU聚类并剔除 嵌合体 为减少测序深度对后续多样性数 据分析的影响 保障结果准确可靠 将所有 样本的序列数进行抽平处理 之后每个样本 的平均序列覆盖度 Good s coverage 仍可 达 100 利用RDP classifier 16 version 2 11 http rdp cme msu edu 比对Unite version 8 0 http unite ut ee index php 的真菌数据库 进行OTU 物 种 分 类 学 注 释 设置70 的 置 信 度 阈 值 并 在 门 和科2个 物 种 分 类 水 平 上 统 计 分 析 每个样本的群落组成和样本间的物种差异 Fisher exact test费舍尔精确检验 数据分 析均通过上海美吉生物医药科技有限公司 的 美 吉 生 物 一 站 式 科 研 服 务 平 台 https 2 结果与分析 2 1 稀释曲线及物种统计 利用OTU水平上草莓 向日葵2个样本 的Shannon指数构建2个白粉病样品的稀释 曲线 图1 显示 测序2个样本的稀释曲线 中后端均趋向于平坦直线 表明测序数据量 足够 测序数据和深度合理 样本CM横线 明显高于XRK 说明草莓白粉病的物种丰富 度明显高于向日葵白粉病 1 8 1 6 1 4 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 5 000 10 000 15 000 20 000 25 000 30 000 35 000 40 000 45 000 样本数量 条 Sample number Shannon curves XRK CM OTU水平的Shannon 指数 Shannon index on OTU level 图 1 草 莓 白 粉 病 和 向 日 葵 白 粉病2个 样 本 的 稀 释 曲 线 在 OTU水平上的Shannon指数 Fig 1 Rarefaction curve Shannon index on OTU level of strawberry powdery mildew samples and sunflower pow dery mildew samples 原 始 序 列 经 过 优 化 处 理 后 样本CM和 XRK获得有效序列分别为78 032条和44 498 条 按照97 序 列 相 似 性 水 平 上 进行OTU 聚 类 按 照 置 信度70 对 物 种 分 类 注 释 2 个 样 本 的 平 均 测 序 长 度为305 bp 共 获 得 OTU 68个 其中 样本CM有59个 样本XRK 有9个 共有的OTU数目为6个 图2 同 时 样 本 物 种 统 计 显 示 CM涵盖1域1界5 门17纲26目35科39属50种62个OTU的 真 菌 XRK涵盖1域1界2门5纲7目10科 13属13种15个OTU的真菌 合计涵盖1域 3 期 张振荣 等 基于高通量测序的草莓白粉病和向日葵白粉病群落组成分析 95