‘红颜’草莓短缩茎再生及遗传转化体系建立_甘珂珂.pdf

北京农学院学报 nullnull null null null nullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnull nullnullnullnull null null null nullnullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnull 收 稿日期 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 基金项目 北京农学院科技创新 火花行动 支持计划 第一作者 甘珂珂 硕士研究生 主要从事果实发育分子生物学研究 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull 刘宪夺 助理农艺师 主要从事无公害农产品种植 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnull 通信作者 黄芸 博士 副教授 主要从事果实发育研究 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnull 红 颜 草莓短缩茎再生及遗传转化体系建立 甘 珂珂 null 刘 宪夺 null 贾 燕 null 沈 元月 null 黄 芸 nullnull null 北京农学院 植物科学技术学院 null农业应用新技术北京市重点实验室 北京 nullnullnull null 北京佳铭伟业科技发展有限公司 北京 nullnullnull 摘 要 目 的 为了获得 红颜 草莓再生及遗传转化植株 方 法 以八倍体 红颜 草莓 Fragaria null ananassa nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull 组培苗短缩茎为试验材料 将草莓长日照开花抑制基因 FaTFL1 和 FaSOC1 的靶点 构建至 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 基因编辑载体 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 中 通过建立 红颜 草莓短缩茎再生及遗传转化体系获得 FaTFL1 和 FaSOC1 基因编辑植株 结 果 红 颜 草莓短缩茎不经过愈伤诱导 可直接诱导形成不定芽 整个 再生周期 null 个月左右 通过优化培养基条件 建立了农杆菌介导的短缩茎遗传转化体系 通过扩增 nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull 载体中的 Cas9 基因对遗传转化获得的草莓植株进行鉴定 阳性率 nullnullnull nullnullnull 结 论 成功建立了一种以八倍 体 红颜 草莓组培苗短缩茎为外植体的高效再生体系以及农杆菌介导的稳定遗传转化体系 关键词 红颜 草莓 短缩茎 再生 遗传转化 中图分类号 nullnullnullnullnull nullnull 文章编号 nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 文献标志码 null Establishment of regeneration and genetic transformation system of Benihoppe strawberry shortened stem nullnullnull nullnullnull null nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnullnull nullnull null null null nullnullnullnull null nullnullnullnullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull Abstract nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Fragarianullananassa nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull FaTFL1 nullnullnull FaSOC1 nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullFaTFL1 nullnullnull FaSOC1 nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull Agrobacterium tumefaciens nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Cas9 nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Keywords nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 红 颜 草莓 Fragarianullananassa nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull 属于蔷薇科草莓属 具有生长适应能力强 休眠时间浅 自然坐果能力强 果形大 品质好等特 点 栽培草莓品种大多数为八倍体 具有高度的杂 合性和复杂性 null 森 林草莓是二倍体 其基因组较 小且已完成测序 容易转化 null 前人大多以二倍体 nullnull 北 京 农 学 院 学 报 第 nullnull 卷 森林草莓为遗传转化研究对象 但是森林草莓与八 倍体栽培草莓 在性状特点和经济价值上有所区 别 红颜 草莓是中国主要的栽培品种 占栽培面 积的 nullnullnull以上 null 因此 使用 红颜 草莓为再生及 遗传转化材料更具产业意义 草莓再生及遗传转化的方法中 叶盘是最广泛 使用的外植体 null 但叶盘再生周期长 工作量大 效 率低 草莓短缩茎包括新茎 根状茎 新茎指的是 当年萌发或者 null 年生的短缩茎 节间排列紧密而短 缩 虽然加粗的生长比较旺盛 但是伸长生长却非 常缓慢 草莓的新茎通常长有密集的轮生叶片 并 在叶腋处簇生腋芽 第二年这些新茎将会变成根 状茎 并且未发育的腋芽也会随之发育成为根状茎 上的隐芽 当草莓植株的地上部分遭受到破坏时 这些隐芽可以迅速发育成为新茎 null 短缩茎是草 莓长叶 生根 形成花序的重要部位 分化能力强 刘振使用草莓试管苗基部作为外植体 属于草莓短 缩茎部位 建立草莓再生体系 分化培养基为 nullnull nullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull null 就此以 红颜 草莓短缩茎为试验材料 建立了一种高效的以八倍 体 红颜 草莓组培苗短缩茎为试验材料的再生体 系以及农杆菌介导的遗传转化体系 为运用基因工 程技术对草莓品质 抗逆 抗病改良奠定基础 null 试验材料与方法 1 1 植物材料 选用八倍体 红颜 草莓 Fragaria nullananassa nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull 再生组培苗为试验材料 培养 条件为 培养箱温度 nullnullnullnullnull null 光周期为 nullnull null 光 nullnull null 暗 相对湿度 nullnullnullnullnullnullnull 1 2 菌株与载体 菌株 大肠杆菌 Escherichia coli E coli 菌株 nullnullnullnull 根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 菌株 nullnullnullnull 由中国科学院遗传与发育生物学研究所许操 老师实验室制作并保存 载体 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 是由中国科学院遗传与发 育生物学研究所许操老师课题组惠赠 载体由农业 应用新技术北京市重点实验室保存 1 3 短缩茎再生方法 nullnullnullnullnull 选取短缩茎 取八倍体 红颜 草莓无菌组 培苗 培养 nullnullnullnullnull null 长势一致 用剪刀剪掉叶片和 根系 用镊子从短缩茎基部去掉多余的茎段 留取 null 个左右去掉叶片的茎段和短缩茎 nullnullnullnullnull 诱导不定芽 草莓植株放入芽诱导培养基 nullnullnullnull null培养室中培养 null null 左右 长出不定芽 nullnullnullnullnull 生根培养 将不定芽转移到芽生长及生根 培养基上 null 个月左右开始长根 null 个月左右可以长 成正常草莓植株 1 4 载体构建 利用 红颜 草莓 FaTFL1 和 FaSOC1 的基因信 息设计基因编辑模块 高效多靶点基因编辑载体 系统是由组成型启动子 nullnullnull 驱动 Cas9 表达 由夜香 树黄曲叶病毒 CmYLCV Cestrum Yellow Leaf Curing 启动子驱动多个 nullnullnullnull 表达 核糖核酸酶 nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null 水解 nullnullnull 磷酸二酯键产生 多个 nullnullnullnull nullnullnullnullnull 基因编辑双元转化载体构建 通过基因编 辑系统网站 nullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 进行基因编 辑靶点设计 利用多靶点载体系统网站 nullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 设计引物表 null nullnullnullnullnull 目的片段扩增 采用 nullnull 高保真 nullnullnull 聚合 酶反应体系扩增目的片段 表 null 用 于 扩 增 CmYLCV 启动子的模板需要经过 Bannull 酶切 扩增其 余片段的模板为 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 载体 nullnullnullnullnull nullnullnull 产物纯化 扩增程序完毕 琼脂糖凝胶 电泳检测目的片段大小及质量 nullnullnull 产物进行清洁 纯化 nullnullnullnullnull nullnullnull 产物载体连接 nullnullnull 产物使用 nullnull 连接 酶边切边连反应表 null 反应程序 nullnull null nullnull null nullnull nullnullnullnull nullnull null nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull 大肠杆菌转化 取 null nullnull 连接产物 转入 nullnullnullnull 感受态中 nullnullnullnullnull nullnullnull 鉴定阳性克隆 使用引物 nullnullnullnullnull 和 nullnullnullnull 引物进行 nullnullnull 鉴定 阳性克隆进行测序 1 5 红颜 草莓短缩茎遗传转化方法 nullnullnullnullnull 农杆菌转化 将构建好的 FaTFL1nullFaSOC1null nullnullnullnull 载体转入根癌农杆菌 nullnullnullnull 农杆菌 农杆菌活 化后 将平板菌体用 nullnull 液体悬浮液 含 nullnullnull nullnull nullnull 重悬 使 OD nullnullnull 值为 nullnullnull 左右 以备侵染 nullnullnullnullnull 材料准备 取八倍体 红颜 草莓无菌组培 苗 培养 nullnull null 左右 长势一致 用剪刀剪掉叶片和 根系 nullnullnullnullnull 农杆菌侵染 将剪好的短缩茎作为外植体 浸入农杆菌重悬液中 振荡侵染 nullnull nullnullnull 结束后用滤 纸 经过高温高压灭菌的 吸去多余的重悬液 nullnullnullnull 年第 null 期 甘珂珂 等 红颜 草莓短缩茎再生及遗传转化体系建立 nullnull 表 1 引物序列和 PC 反应体系 Tab 1 Primer sequences and reaction mixture of PC 名称 序列 nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaTFL1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullFaSOC1nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 表 2 PC 反应体系 Tab 2 eaction mixture of PC 目的片段扩增 nullnullnull 产物载体连接 试剂 体积 nullnullnull 试剂 体积 nullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull 载体 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 模板 nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 纯化后的 nullnullnull 产物 nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 上游引物 null nullnull nullnull nullnullnull Sapnull 酶 nullnullnull 下游引物 null nullnull nullnull nullnullnull Bsanull 酶 nullnullnull n