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吉林农业大学学报 抗虫 基因的原核表达及玉米的遗传 转化 樊书羽 金时酉 王艺燃 曲 静 刘思言 关淑艳 马义勇 吉林农业大学生命科学学院 长春 吉林农业大学农学院 长春 摘 要 玉米的产量深受虫害的影响 抗虫 基因对玉米黏虫抗性有重要意义 利用外源抗虫基因 构建到原核表达载体 中 对其进行 检测和抗黏虫性鉴定 检测结果表 明 基因编码的杀虫蛋白在大肠杆菌 中得到正确的表达 条带大小为 抗黏虫性鉴定结 果表明 当 蛋白浓度为 时 对东方黏虫致死率达到 同时构建 植物表达载体 通过农杆菌介导法将外源抗虫基因 转入玉米自交系 愈伤组织中 利用除草剂筛选及 技术检测得到 转基因阳性植株 株 获得的转基因抗虫玉米植株为抗虫转基因玉 米的研发及抗虫玉米新种质的创制奠定了基础 关键词 玉米 基因 表达载体 功能分析 中图分类号 文献标志码 文章编号 引文格式 樊书羽 金时酉 王艺燃 等 抗虫 基因的原核表达及玉米的遗传转化 吉林农业大学学 报 基金项目 吉林省自然科学基金项目 吉林省科技引导计划项目 吉林省科技支撑计划项目 吉林省教育厅 十三五 科学技术项目 作者简介 樊书羽 女 硕士研究生 研究方向 细胞生物学 收稿日期 通信作者 樊书羽 等 抗虫 基因的原核表达及玉米的遗传转化 吉林农业大学学报 玉米 是一种广泛种植的农作物 是我国主要的粮食 经济和饲料作物 转基 因或基因改造的抗虫和耐除草剂的玉米 已在 部分国家商业化大规模种植 目前 玉米主要 用于饲养牲畜或用作工业产品的原料 而仅 的玉米用作人类食品 近年来 在中国 个省和 个地区都暴发了黏虫虫害 造 成的粮食作物损失 东北地区黏虫 暴发的面积范围较大 华北地区的成虫数量多 危害较重 黄淮地区和湖南省呈局部大暴发状态 西北和西南地区虫害暴发较晚 成虫数量较少 初步统计 全国虫害暴发面积约为 万公顷 主要为害玉米 水稻 高粱 小麦和谷子等禾本科 作物 因此本试验将培育抗黏虫转基因玉米 作为首要目的 苏云金芽孢杆菌 是 具有昆虫病原性特征的革兰氏阳性孢子形成的细 菌 在孢子形成阶段产生杀虫蛋白作为伴孢 晶体 这些晶体基本上由一种或多种蛋白质 和 毒素 组合而成 也被称为 内毒 素 蛋白是来自苏云金芽孢杆菌的伴随包 涵体 晶体 蛋白 其对靶生物具有可验证的毒性 或与已知的 蛋白序列具有极高的相似性 类似地 蛋白是来自苏云金芽孢杆菌的伴孢 包含蛋白 其表现出溶血 活性或与已知 的 蛋白序列具有较高的相似性 这些毒素对 人类 脊椎动物和植物无害并对其目标昆虫具有 高度特异性 是完全可生物降解的 因此 蛋白是可代替农药 控制农业中鳞翅目害虫的可 行替代方案 通常 蛋白会被肠道蛋白酶摄入并加工 在昆虫碱性肠道中转化为活性毒素 活性毒 素与易感昆虫肠道中存在的特定受体结合 结合 的毒素受体复合物导致肠膜孔形成 随后引起败 血病并最终导致死亡 人类和其他哺乳动物 为酸性肠道以及 蛋白结合受体 因此不易受 到相应 蛋白的毒性作用 多年来 几种 含 基因的 蛋白已被安全地用于商业和农 业的杀虫喷雾剂 在过去的 年中 来自表 达 蛋白的转基因农作物的产品已安全地用于 食品和饲料 这些毒素对其目标昆虫具有高 度特异性 对人类 脊椎动物和植物无害 并且是 完全可生物降解的 截至 年 月 共有 近 种 类抗虫基因被发掘鉴定出来 涵 盖了从 至 共 小类 其中 蛋白占其中的大多数 类是仅次于 类的杀虫晶体蛋白 对鳞翅目 直翅目等类昆 虫具有较好的杀虫活性 其中 蛋白仅对鳞翅目昆虫具有杀虫活 性 且 对黏虫的毒力要高于 和 因此在害虫防治方面具有较为广泛 的应用前景 本研究将 基因构建到 原核表达载体与植物表达载体中 利用除草剂筛 选及 技术检测得到 转基因阳性植株 株 为抗虫玉米新种质的获得奠定了基础 材料与方法 材料 基因由吉林省库美生物科技有限公 司合成 以克隆载体 形式保存在 大肠杆菌 中 以自交系 愈伤组 织为基因受体 黏虫幼虫购于河南省济源白云实 业有限公司 方法 质粒 的提取 利用质粒 试剂 盒提取吉林农业大学植物生物中心实验室保存的 克隆载体 质粒 和原核表达载 体 具体试验方法参见文献 扩增 基因 根据 基 因的完整序列 设计 基因的特异性下游引 物 表 利用 技术扩增 基 因 其中 反应体系为 分别添加 总 计 反应条件 预变性 变 性 退火 延伸 次循环 延伸 吉林农业大学学报 年 月 表 引物序列 目的片段上游引物序列 下游引物序列 目的片段大小 注 分别表示该引物用于 基因 扩增 连接植物表达载体和原核表达载体 线性化载体及目的基因片段的制备 利 用同源重组的原理 将 基因连入原核表达 载体 上 综合 基因序列上的酶切 位点和 载体序列上的可用酶切位点 选取 限制性内切酶 对 载体进行 双酶切 将载体大片段与 基因连接 其中 酶切体系为 各 载体 质粒 总计 并在 条 件下酶切 重组体系为目的基因 线性 载体 重组蛋白的表达 将构建好的重组质粒 转化 感受态细胞 经 诱导表达并进行 电泳检测 蛋白杀虫活性的生物鉴定 人工 饲料的配制参照文献 方法和条件 含 载体的破碎菌液为阳性对照 含空载体的 破碎菌液为阴性对照 每 培养皿中加入 人工黏虫饲料 并加入不同浓度的破碎菌液 搅拌均匀 将培养皿放在室温环境中蒸发 水分直至没有明显水滴 将 头初孵黏虫幼虫接入各皿中 每个浓度 设 次重复 接虫后 为避免虫子逃逸在其中垫 入纱布并封紧培养皿 将培养皿置于 光照 培养箱培养 光周期为黑暗 光照 湿度为 每天添加新鲜饲料 培养 后 调查活虫数和死虫数 并计算死亡率 质粒 的提取 利用小提质粒 试剂盒提取 实验室保存克隆载体 质粒 和植物表达载体 具体试验方法 参照文献 扩增 基因 根据 基因 的完整序列 设计 基因的特异性引物 表 利用 技术扩增 基因 线性化载体及目的基因片段的制备 利 用同源重组的原理 将 基因连入载体 上 综合 基因序列上的酶 切位点和 载体序列上的可用酶切 位点 选取限制性内切 对 载体进行双酶切 将载体大片段与 基因连接 酶切体系为 各 载体质粒 总计 并在 条件下酶切 灭活 通过 扩增技术制备 基因片段 根据同源重组原理设计引物 以植物 表达载体 质粒为模板 按照本文 中的 扩增体系和条件 扩增 基 因 待酶切和 扩增反应结束后 将酶切产物 和 产物进行电泳验证 回收并纯化 基 因和载体大片段 具体方法参见文献 目的片段与线性载体的连接 将线性载 体片段与 目的基因片段按照同源重组试 剂盒方法进行连接 在干式恒温器中 反应 然后放在冰上静止 后进行工程菌制 备 构建重组载体 重 组体系为 倍 线性载 体 与线性载体片段物质的量的比为 重组表达载体的鉴定 对表达载体 进行 及酶切验证 反应体 系和反应条件同本文 和 农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化 将 转入农杆菌 中 樊书羽 等 抗虫 基因的原核表达及玉米的遗传转化 吉林农业大学学报 制成工程菌 对工程菌进行扩繁制备成侵染菌液并 对 幼胚诱导形成的愈伤组织块进行侵 染 对侵染后的愈伤组织进行抗性筛选 分化成苗 具体的侵染及再生过程参见文献 图 区结构图 转基因植株的 检测 对转化的玉 米植株进行除草剂筛选 提取出抗性苗的叶片 阴性对照为未转化玉米植株叶片 阳 性对照为植物表达载体质粒 分别对表达元件中的 基因 基因进行 扩增 反应条件 预变性 变性 退火温度分别 为 退火时间 延伸 后延伸 次循环 扩增产物利用 琼脂糖凝胶电泳分离 参照康为世纪公司的植物 基因组提取试剂盒说明书提取目的基因 结果与分析 基因的 扩增及鉴定 对 基因进行 扩增 约在 处有条带 图 证明 基因的 扩增 成功 阴性对照 目的基因 图 基因的 鉴定 原核表达载体的构建 以 质粒为模板扩增 目 的基因 构建 原核表达载体 并 进行 扩增及双酶切验证 目的片段大小为 图 成功构建 原核 表达载体 目的基因 重组质粒 图 原核表达载体 鉴定及酶切鉴定 表达蛋白的 检测 电泳分析 图 经 诱导后 含 工程菌 非可溶性组分 蛋白大小约在 表达出 条明显的特异性条带 与预期 条带大小相吻合 表明 基因编码的杀虫蛋 白在大肠杆菌 中得到正确的表达 图 诱导表达 检测 吉林农业大学学报 年 月 原核表达蛋白对黏虫的抗性分析 由表 可知 蛋白对黏虫的致死率随 浓度的增大而增加 浓度为 和 时 黏虫的死亡率分别为 和 表 蛋白对黏虫的致死率 接虫数死虫数死亡率 植物表达载体 的构建 将构建的植物表达载体 进行 扩增及双 酶切验证 目的片段大小为 图 成功构 建植物表达载体 农杆菌介导玉米的遗传转化 通过农杆菌介导法侵染玉米愈伤组织 经过 共培养 筛选 分化 生根等再生过程共得到 株 再生幼苗 移栽幼苗并对 叶期幼苗进行除草剂 筛选获得抗除草剂 代植株 株 图 将获得 的抗性植株移栽到土壤并在温室中培养 进行分 子检测 阴性对照 目的基因 重组质粒 图 植物表达载体 鉴定及酶切鉴定 预培养 共培养 筛选 分化培养 生根培养 移栽 图 农杆菌介导玉米的遗传转化 樊书羽 等 抗虫 基因的原核表达及玉米的遗传转化 吉林农业大学学报 代转基因玉米 检测结果 对抗除草剂玉米植株的叶片提取基因组 以未转化植株为阴性对照 质粒为阳性对照 分别对 基 因 基因进行 检测 能够扩增出明显的 基因及 基因条带 得到 代阳性植株 株 图 代阳性植株 株 图 基因 基因 阳性对照 阴性对照 空白组 转化植株 图 代转基因玉米阳性植株 检测 基因 基因 阳性对照 阴性对照 空白组 转化植株 图 代转基因玉米阳性植株 检测 讨 论 抗虫转基因玉米的应用取决于抗虫的效 果 大量研究证实 与其他抗虫基因相比 在表 达量相等的情况下 转 基因的作物抗虫性最 强 类基因是转基因玉米研发中的重要 基因 李冬雪等 证明了对小菜蛾 烟草天蛾等 较强的杀虫活性是由其 毒蛋白的结构决定 的 第 批成功用于商业化的转基因玉米 如 所用的抗虫基因均为 类 基因 类基因的晶体蛋白在玉米中的表 达 能够有效地控制苗期及穗期的虫害 魏纪珍 研究了 与 互作对棉 铃虫的影响 结果显示 种蛋白同时运用于棉铃 虫时其肠道中的酶活力显著高于 种蛋白单独作 用和对照组 幼虫校正死亡率依次为双价棉 转 棉 转 棉 李静静 利用含 与 双基因的转基因水稻饲喂棉铃 虫与稻纵卷叶螟 周后发现转基因水稻抗虫性 明显高于未转基因植株 且长势良好 本研究将 基因与原核表达载体 相连接 并转化大肠杆菌 使其表达 检测表明 基因编码的杀虫蛋 白在大肠杆菌 中得到正确的表达 条带大 小为 抗虫性鉴定试验结果表明 蛋白对黏虫有良好的抗性 具有潜在的应 用价值 随后将 基因导入玉米自交系 通过 检测 除草剂筛选初步获得 株 代阳性玉米植株 为后续植株的分子检测 及抗虫鉴定奠定了基础 杨素娟等 的研究指 出 基因当浓度为 时 对东方黏 虫致死率达到 本试验与其结论相似 吉林农业大学学报 年 月 参考文献 王月琴 玉米对亚洲玉米螟抗性研究 应用昆虫 学报 杨素娟 对东方粘虫 亚洲玉米螟具有抗虫作用的 蛋白 筛选与分析 哈尔滨 东北农业大学 魏晓禹 邵诗迪 孙苏等 农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化 体系的建立 吉林农业大学学报 梁海生 转 基因抗虫玉米的农艺性状分析 绵阳 西南科技大学 季丽丽 玉米遗传转化体系的优化及 基因转化玉米的 研究 长春 吉林农业大学 王国莉 丘裕雄 范红英 转基因玉米实验室 检测体系的 优化及应用 基因组学与应用生物学 赵邯郸 转植酸酶基因玉米的获得及后代鉴定分析 长 春 吉林农业大学 钱雪艳 苏颖 姚瑶等 农杆菌介导抗虫基因 转 化大豆的研究 吉林农业大学学报 王江 武奉慈 刘新颖 等 转基因抗虫耐除草剂复合性状 玉米 双抗 对亚洲玉米螟的抗性及对草甘膦的耐 受性研究 植物保护学 李国平 刘冰 黄建荣 等 转聚合 和 基因抗虫耐除草剂玉米的田间抗性评价 植 物保护 任梦云 陈彦君 关潇 转 基因抗虫玉米对无脊椎 动物多样性影响研究 农业环境科学学报 陈亮 黄庆华 孟丽辉 等 转基因作物饲用安全性评价研 究进展 中国农业科学 宋新元 张欣芳 于壮 等 转基因植物环境安全评价策略 生物安全学报 孙越 刘秀霞 李丽莉 等 抗亚洲玉米螟 抗草甘膦转基因 玉米的培育 农业生物技术学报 宋福平 苏云金芽孢杆菌 和 基因的研究 长春 中国农业科学院 宋苗 转 基因抗虫玉米的遗传稳定性分析及农 艺性状观察 绵阳 西南科技大学 王文治 胡天娇 杨本鹏 等 转 基因抗虫甘蔗植株 的培育 分子植物育种 吴楠 大豆查尔酮还原酶基因 干扰表达载体的 构建及遗传转化 长春 吉林农业大学 李晖 玉米 基因的克隆及功能分析 长 春 吉林农业大学 刘双 陈昭汀 董昭旭 等 拟南芥抗寒基因 的克隆及 功能分析 西北农林科技大学学报 李冬雪 田崇兵 刘长华 等 转 基因抗虫超级粳稻 田间目的基因表达及抗螟虫性研究 中国农学通报 汪小福 陈笑芸 张小明 等 转 基因水稻分子特征 及其特异性 检测方法 遗传 张林 新抗虫基因 的克隆及其在大豆中的遗 传转化和功能鉴定 长春 吉林农业大学 魏纪珍 和 防治棉铃虫的交互抗性和互作 北京 中国植物保护学会 植保科技创新与农业精准 扶贫 中国植物保护学会 年学术年会论文集 中 国植物保护学会 中国植物保护学会 李静静 含 和 双基因的抗虫转基因水稻的 研究 杭州 浙江大学 责任编辑 林海涛
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