瓜类褪绿黄化病毒编码的P6蛋白亚细胞定位及致病特征分析.pdf

园艺学报 2021 48 8 1531 1540 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0914 http www ahs ac cn 1531 收稿日期 2020 12 17 修回日期 2021 05 06 基金项目 国家重点研发计划项目 2018YFD0201208 国家自然科学基金项目 32072506 31770168 国家现代农业产业技术体系 建设专项资金项目 CARS 24 C 01 江苏省农业自主创新基金项目 CX 19 3108 江苏省农业科学院基金项目 6111614 共同第一作者 通信作者 Author for correspondence E mail jiyinghua 瓜类褪绿黄化病毒编码的 P6 蛋白亚细胞定位及 致病特征分析 涂丽琴 1 2 干射香 1 3 吴淑华 1 任春梅 1 程兆榜 1 章松柏 3 朱月林 2 周益军 1 季英华 1 1 江苏省农业科学院植物保护研究所 南京 210014 2 南京农业大学园艺学院 南京 210095 3 长江大学农学院 湖北荆州 434025 摘 要 以瓜类褪绿黄化病毒 cucurbit chlorotic yellows virus CCYV 山东寿光分离物作为研究对 象 对其 RNA1 编码的 P6 蛋白进行克隆 发现其基因全长为 159 bp 编码 1 个大约 6 kD 的蛋白 并含 1 个跨膜区 进一步构建了带有 YFP 标签的荧光表达载体 P6 YFP 浸润本氏烟叶片后利用激光共聚焦显微 镜观察 发现 P6 YFP 在细胞质和细胞核均有分布 将 P6 构建到马铃薯 X 病毒 potato virus X PVX 异源表达载体获得的 PVX P6 接种本氏烟 发现接种 PVX P6 的植株新叶伴有明显黄化 皱缩等症状 并 沿叶脉出现坏死 而接种 PVX 空载体的植株仅有轻微的花叶 表明在 PVX 异源表达系统中 P6 诱导寄 主植物出现更严重的症状 暗示 P6 能增强 PVX 的致病性 可能是参与症状形成的致病相关因子 关键词 瓜类褪绿黄化病毒 P6 蛋白 亚细胞定位 致病性 中图分类号 S 642 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2021 08 1531 10 Characterization of the Subcellular Localization and Pathogenicity of P6 Encoded by Cucurbit Chlorotic Yellows Virus TU Liqin 1 2 GAN Shexiang 1 3 WU Shuhua 1 REN Chunmei 1 CHENG Zhaobang 1 ZHANG Songbai 3 ZHU Yuelin 2 ZHOU Yijun 1 and JI Yinghua 1 1 Institute of Plant Protection Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Nanjing 210014 China 2 College of Horticulture Nanjing Agricultural University Nanjing 210095 China 3 College of Agriculture Yangtze University Jingzhou Hubei 434025 China Abstract Cucurbit chlorotic yellows virus CCYV is an important whitefly transmitted Crinivirus which has become an emerging infectious agent of cucurbits leading to severe disease and significant economic losses P6 is a small protein encoded by ORF2 of RNA1 one segment of CCYV and its functions still remains unknown In this study P6 was cloned from an isolate of CCYV from Shouguang Shandong Provience using specific primers by RT PCR The results of sequence analysis revealed that P6 gene was 159 bp in length encoding a protein of approximately 6 kD with a transmembrane domain To Tu Liqin Gan Shexiang Wu Shuhua Ren Chunmei Cheng Zhaobang Zhang Songbai Zhu Yuelin Zhou Yijun Ji Yinghua Characterization of the subcellular localization and pathogenicity of P6 encoded by cucurbit chlorotic yellows virus 1532 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1531 1540 clarify the subcellular localization of P6 a YFP tagged P6 P6 YFP was constructed using a 35S YFP vector and transiently expressed in the Nicotiana benthamiana by agrobacterium infiltration Fluorescence signal was observed in the cytoplasm and nucleus of the epidermal cells of infiltrated N benthamiana leaves which indicated that P6 YFP was distributed in the cytoplasm and nucleus To test the pathogenicity of P6 a potato virus X PVX based vector was introduced and PVX P6 was constructed Chlorotic crumple and necrosis symptoms were observed in the emerging leaves of N benthamiana plants inoculated by PVX P6 and only slight mosaic symptoms was observed in the plant inoculated by PVX which showed that heterologous expression of P6 in N benthamiana enhanced the pathogenicity of PVX indicating that P6 might be an important protein involved in the pathology of CCYV Keywords cucurbit chlorotic yellows virus P6 protein subcellular localization pathogenicity 瓜类褪绿黄化病毒 cucurbit chlorotic yellows virus CCYV 是一种粉虱传植物病毒 Tzanetakis et al 2013 Navas Castillo et al 2014 卢少华 等 2015 危害多种葫芦科作物 侵染后植株出 现典型的褪绿黄化症状 早期叶基部和中部出现褪绿 黄化 而后逐渐向叶上部蔓延 严重时整株 黄化 Okuda et al 2010 古勤生 等 2011 严重影响其品质和产量 CCYV 最早由 Gyoutoku 等 2009 在日本发现 随后苏丹 Hamed et al 2011 黎巴嫩 Abrahamian et al 2012 伊朗 Bananej et al 2013 希腊 Orfanidou et al 2014 埃及 Amer 2015 土耳其 Orfanidou et al 2017 沙特阿拉伯 Shakeel et al 2018 等多个国家和地区也出现该病毒危害报道 在中国 Huang 等 2010 首次报道中国台湾地区有 CCYV 发生 之后浙江 上海 山东 古勤生 等 2011 Gu et al 2011 北京 张汝楠 等 2012 海南 河南 刘珊珊 等 2013 湖南 唐鑫 等 2017 广西 杨世 安 等 2017 新疆 潘卫萍 等 2017 等多个省市及地区均出现该病毒发生危害的报道 瓜类作 物生产遭受严重的损失 制约了产业的健康发展 CCYV 属长线形病毒科 Closteroviridae 毛形病毒属 Crinivirus 暂定种 病毒粒体为线状 无包膜 其基因组由两条正单链 RNA 组成 RNA1 全长约 8 6 kb 含有 4 个开放阅读框 open reading frame ORF ORF1a 编码甲基磷酸转移酶和依赖 RNA 的病毒解旋酶 ORF1b 编码依赖 RNA 的 RNA 聚合酶 ORF2 编码 P6 ORF3 编码 P22 蛋白 RNA2 全长约 8 kb 编码 8 个开放阅读框 分 别编码外壳蛋白 CP 小外壳蛋白 CPm 70 kD 类热激蛋白 HSP70h P59 P26 P9 P6 P4 9 蛋白 其中 CP CPm HSP70h 和 P59 为结构蛋白 而其余多为非结构蛋白 Kiss et al 2013 虽然有报道 RNA1 编码蛋白多与病毒复制侵染相关 RNA2 编码蛋白主要参与病毒的组装 运动及 介体传播 但很多蛋白 包括 P6 的功能尚不清楚 洪雪玉和陈剑平 2004 Dolja et al 2006 Okuda et al 2010 P6 蛋白是由 CCYV RNA1 组分 ORF2 编码的 1 个小分子量蛋白 其编码框在位置上处于 RdRp 与 P22 蛋白之间 在毛形病毒属成员中 并不是所有病毒在对应位置都有编码蛋白 有些病毒虽然 在对应位置有编码蛋白 如莴苣褪绿病毒 lettuce chlorosis virus LCV 在 RdRp 与 P23 之间编码 P8 蛋白 Kiss et al 2013 Navas Castillo et al 2014 但其与 CCYV 编码的 P6 之间同源性极低 同时 P6 序列比对分析结果也显示其与目前报道过的病毒蛋白之间的同源性都非常低 因此 P6 极有 可能是 CCYV 特有的 1 个蛋白 在病毒与寄主的互作过程中发挥重要作用 为解析 CCYV 编码的 P6 蛋白功能 选择 CCYV 山东分离物作为研究对象 对其 P6 基因进行 克隆和分析 并构建了带有荧光标签的瞬时表达载体 P6 YFP 和异源病毒表达载体 PVX P6 浸润接 涂丽琴 干射香 吴淑华 任春梅 程兆榜 章松柏 朱月林 周益军 季英华 瓜类褪绿黄化病毒编码的 P6 蛋白亚细胞定位及致病特征分析 园艺学报 2021 48 8 1531 1540 1533 种本氏烟后 分别通过共聚焦显微镜观察及表型观察研究了 P6 的亚细胞定位及致病特征 为后续 深入解析 P6 功能及其在 CCYV 与寄主互作中的作用机理奠定理论基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 供试病样为 2016 年采自山东寿光的发病黄瓜叶片 干射香 等 2019 荧光表达载体 35S YFP 由南京农业大学陶小荣教授提供 农杆菌 GV3101 PVX 异源病毒载体 PGR107 和植物材料本氏 烟种子由本课题组实验室保存 1 2 P6 基因克隆及其序列分析 利用 RNAiso Plus 宝日医生物技术北京有限公司 TaKaRa 参照吴淑华等 2015 使用 TRIzol 法提取黄瓜病样总 RNA 使用反转录试剂盒 PrimeScript TM 1st strand cDNA Synthesis Kit 进行 cDNA 合成 根据在 National Center for Biotechnology Ination NCBI 上已发布的 CCYV 基因组序列 NC 018173 设计 P6 全长扩增引物 表 1 以上述 cDNA 为模板 反应体系 10 PCR 缓冲液 Mg 2 plus 2 5 L dNTPs mix 0 5 L Ex Taq 0 5 L TaKaRa P6 bF 10 mol L 1 和 P6 bR 10 mol L 1 各 1 L cDNA 1 L ddH 2 O 18 5 L 总 体 系 25 L 扩增条件 95 预变性 3 min 95 变性 30 s 50 退火 30 s 72 延伸 30 s 30 个循环 最后 72 充分延伸 10 min PCR 产 物经 1 琼脂糖凝胶电泳检测 回收目的条带 连接 pMD18 T 载体 转化大肠杆菌感受态细胞 TOP10 菌液 PCR 筛选阳性克隆 经酶切验证后阳性克隆送南京金斯瑞公司进行序列测定 将获得的 P6 序列与已公开的 CCYV 不同分离物的 P6 序列进行分析 序列多重比对 同源性分 析使用 ClustalX DNAstar 及 BLAST 程序 http www ncbi nlm nih gov BLAST 完成 跨膜区预 测使用 TMHMM 服务器 http www cbs dtu dk services TMHMM 在线完成 表 1 引物信息 Table 1 Primers used in this research 引物长度 bp Length 引物名称 Name 序列 5 3 Sequence 退火温度 T m 159 P6 bF CGggatccATGTATTTTACAACAATATTTTACCTC 48 9 P6 bR CGggatccAGCTATTTCTATATTCCTGTGG 49 4 159 P6 ClF CCatcgatATGTATTTTACAACAATATTTTACCTC 48 9 P6 SlR GCgtcgacTCAAGCTATTTCTATATTCCTGT 49 5 注 ggatcc 代表 BamH 酶切位点 atcgat 代表 Cla 酶切位点 gtcgac 代表 Sal 酶切位点 Note ggatcc stands for BamH restriction site atcgat stands for Cla restriction site gtcgac stands for Sal restriction site 1 3 P6 YFP 载体构建 选取测序验证无误且读码框正确的阳性克隆提取质粒 使用限制性内切酶 BamH 进行单酶切 后经胶回收试剂盒回收目的片段 使用 T4 连接酶连接目的片段和经 BamH 酶切并利用碱性磷酸酶 TaKaRa 处理后的 35S YFP 连接体系 T4 DNA 连接酶 1 L 10 T4 DNA 连接酶缓冲液 1 L 线性化 35S YFP 载体 1 L 回收的目的片段 7 L 16 过夜连接 连接产物转化大肠杆菌感受态 Tu Liqin Gan Shexiang Wu Shuhua Ren Chunmei Cheng Zhaobang Zhang Songbai Zhu Yuelin Zhou Yijun Ji Yinghua Characterization of the subcellular localization and pathogenicity of P6 encoded by cucurbit chlorotic yellows virus 1534 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1531 1540 细胞 TOP10 北京全式金生物 于含卡那霉素的 LB 平板倒置培养 菌落 PCR 筛选阳性克隆后委 托南京金斯瑞生物有限公司进行序列测定 测序验证无误后获得 P6 YFP 重组表达质粒 1 4 P6 亚细胞定位观察 将 P6 YFP 重组表达质粒和 YFP 空载质粒采用冻融法分别转入农杆菌 GV3101 涂布于含有卡 那霉素 50 mg L 1 和利福平 25 mg L 1 的抗性平板上 28 倒置培养 48 h 至菌落长出 菌 落 PCR 筛选阳性克隆 检测无误后转至同样抗性的液体培养基中扩繁培养至 OD 600 为 0 8 1 2 8 000 r min 1 3 min 收集菌体 配置浸润液 10 mmol L 1 MgCl 2 10 mmol L 1 MES 100 mol L 1 乙酰丁香酮 重悬菌体至 OD 600 0 5 置于 28 静置复苏 2 h 选取 3 5 叶龄本氏烟 用去除针 头的 1 mL 注射器在叶片背面做浸润处理 40 48 h 后 hours post infiltration hpi 取浸润区叶片制 作玻片在激光共聚焦显微镜 蔡司 德国 下观察亚细胞定位 H2B mCherry 组蛋白 H2B 示意 细胞核 生物学试验重复 3 次 1 5 P6 YFP 检测 取适量本氏烟叶片农杆菌浸润部位的组织于液氮冷冻后进行研磨 用 TRIzol 法提取总 RNA 使用去基因组反转录试剂盒 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser TaKaRa 合成 cDNA 将 cDNA 作为模板 选择 P6 bF 和 P6 bR 进行 RT PCR 检测 参照涂丽琴等 2020 的报道进行 P6 YFP 的 Western blot 检测 1 6 PVX P6 载体构建 将引物 P6 ClF 和 P6 SlR 表 1 扩增获得的 P6 片段经纯化回收后连接 pMD18 T 载体 获得 pMD18T P6 阳性克隆 pMD18T P6 提取质粒后进行双酶切 酶切体系 1 L Cla 限制性内切酶 1 L Sal 限制性内切酶 4 L 10 上样缓冲液 20 L pMD18T P6 质粒 14 L ddH 2 O 总体积 40 L 37 酶切 4 h 回收目的片段通过 T4 连接酶连接同样经 Sal 和 Cla 双酶切处理的 PVX 异源病 毒载体 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 菌落 PCR 筛选阳性克隆 经测序验证无误后获得重组 表达质粒 PVX P6 1 7 PVX P6 致病性分析与 RT PCR 检测 将 PVX 异源表达空载体和重组质粒 PVX P6 通过冻融法转入农杆菌 GV3101 Soup 19 北京 庄盟生物 涂布于含有卡那霉素 50 mg L 1 和利福平 25 mg L 1 抗性的平板 28 倒置培 养至菌落长出 挑取单菌落进行菌落 PCR 鉴定 鉴定无误后在含有卡那霉素和利福平的液体培养基 中过夜扩繁培养至 OD 600 值为 0 8 1 2 浸润接种 3 4 龄本氏烟 浸润处理 7 和 13 d 后进行拍照记 录症状并取样检测 取接种 PVX 及 PVX P6 本氏烟植株的上部新叶 非浸润叶 于液氮冷冻后充分研磨 提取样品 总 RNA 利 用 PrimeScript TM RT reagent with gDNA Eraser 合成 cDNA 作为模板 P6 采用引物 P6 ClF 和 P6 SlR 进行 RT PCR 检测 PVX 选择使用引物 PVX F 和 PVX R 姚玉荣 等 2013 进行 RT PCR 检测 涂丽琴 干射香 吴淑华 任春梅 程兆榜 章松柏 朱月林 周益军 季英华 瓜类褪绿黄化病毒编码的 P6 蛋白亚细胞定位及致病特征分析 园艺学报 2021 48 8 1531 1540 1535 2 结果与分析 2 1 CCYV P6 序列分析 以感染 CCYV 黄瓜叶片样品 RNA 反转录获得的 cDNA 产物为模板 使用设计的 CCYV 编码的 P6 蛋白特异性引物 表 1 进行扩增 凝胶电泳结果显示扩增到 1 条约 160 bp 的特异性条带 与目 标基因 159 bp 大小相近 目的条带经纯化回收后 与 pMD18 T 载体连接 转化至大肠杆菌 筛选 阳性克隆后经酶切 测序验证确定了该条带为扩增的 P6 基因目的条带 CCYV 山东分离物 同时 获得重组载体 pMD18T P6 将获得的 P6 基因序列进行分析 发现其全长 159 bp 编码 1 个约 6 1 kD 的蛋白 使用 ClustalX 软件对 P6 蛋白序列与之前报道 CCYV 其他分离物序列进行比对分析 结果发现在 CCYV 不同分离 物之间 P6 蛋白序列比较保守 本研究中的山东分离物 P6 序列除了与 2 个分离物 AB523788 和 KU507601 存在 1 个氨基酸差异外 与其余分离物的序列完全一致 同时在使用 TMHMM 对获得 的 P6 序列进行分析时发现 P6 蛋白存在 1 个跨膜区 图 1 图 1 CCYV 编码的 P6 氨基酸序列比对 A 和跨膜区分析 B Fig 1 Amino acid sequence alignment of P6 encoded by CCYV A and transmembrane domain prediction B 2 2 P6 亚细胞定位特征分析 P6 YFP 和 YFP 图 2 A 分别转化农杆菌 GV3101 后浸润接种本氏烟 48 h 后于激光共聚焦 显微镜下观察 浸润 P6 YFP 的本氏烟叶片表皮细胞的细胞质和细胞核内均观察到强烈的绿色荧光 信号 同时 P6 YFP 与 H2B mCherry 细胞核 共浸润时二者激发的荧光在细胞核区域存在重叠 图 2 B 说明 P6 YFP 具有细胞质和细胞核分布的特征 Tu Liqin Gan Shexiang Wu Shuhua Ren Chunmei Cheng Zhaobang Zhang Songbai Zhu Yuelin Zhou Yijun Ji Yinghua Characterization of the subcellular localization and pathogenicity of P6 encoded by cucurbit chlorotic yellows virus 1536 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1531 1540 图 2 P6 蛋白亚细胞定位 A P6 YFP 构建示意图 B P6 YFP 亚细胞定位 C P6 YFP 的 Western blot 及 RT PCR 检测 Fig 2 Subcellular localization of P6 YFP A Diagram of P6 YFP construction B Subcellular localization of P6 YFP the distribution of P6 in the nucleus was indicated by H2B in the right small picture C Detection of P6 YFP by RT PCR and western blot RT PCR 结果显示 以浸润 P6 YFP 的本氏烟叶片作为模板进行 RT PCR 扩增 凝胶电泳结果显 示扩增到 1 条大小约 160 bp 的特异条带 与目标基因大小一致 而对照组 YFP 无扩增条带 图 2 C Western blot 检测结果显示 浸润 YFP 的样品中检测到 1 条大小约 27 kD 条带 与 YFP 大小相 近 图 2 C 而浸润 P6 YFP 的叶片检测到 1 条稍大于 YFP 约 33 kD 的特异性条带 与目的条 带大小相近 这说明融合蛋白 P6 YFP 在本氏烟叶片中正常转录和表达 同时也证实了在激光共聚 焦显微镜下观察到荧光信号是由 P6 YFP 在烟草叶片中表达产生的 2 3 P6 致病特征分析 PVX 异源表达空载体和重组质粒 PVX P6 分别转化农杆菌后接种本氏烟 接种 PVX P6 7 d 后 本氏烟上部叶片出现花叶 皱缩等症状 而接种 PVX 的本氏烟仅出现轻微花叶症状 接种 13 d 后 发现接种 PVX P6 的植株新叶伴有明显花叶 皱缩等症状 同时叶片上沿叶脉出现坏死症状 而接 种 PVX 的本氏烟并无明显变化 图 3 A B 对接种植株体内的异源病毒载体 PVX 和 P6 进行了 检测 所有接种植株体内均能检测到 PVX 而在接种 PVX P6 的植株中能检测到 P6 在接种 PVX 的植株中未检到 P6 图 3 C 这些结果说明 P6 能显著增强 PVX 的致病性 暗示了在异源病毒 PVX 侵染中 P6 可能是 1 个参与症状形成的致病相关因子 涂丽琴 干射香 吴淑华 任春梅 程兆榜 章松柏 朱月林 周益军 季英华 瓜类褪绿黄化病毒编码的 P6 蛋白亚细胞定位及致病特征分析 园艺学报 2021 48 8 1531 1540 1537 图 3 PVX P6 的烟草叶片致病特征 A B PVX P6 诱导的症状 C PVX 和 P6 的 RT PCR 检测 Fig 3 Symptoms induced by PVX PVX P6 in Nicotiana benthamiana leaves A B Systemic symptoms induced by PVX P6 C Detection of PVX and P6 by RT PCR 3 讨论 瓜类褪绿黄化病毒是近些年来传入中国的一种粉虱传植物病毒 目前在多地已有发生危害的报 道 给西瓜 黄瓜 甜瓜等多种葫芦科作物生产造成了严重的经济损失 本研究中选择 CCYV 山东 黄瓜分离物作为研究对象 对其 RNA1 编码的 P6 蛋白进行了研究 激光共聚焦显微镜观察结果显 示带有 YFP 标签的 P6 P6 YFP 在本氏烟叶片细胞中主要分布于细胞质和细胞核 致病性测定结 果显示异源病毒载体过量表达 P6 PVX P6 会诱导寄主植株出现更严重的症状 表明 P6 能显著增 强 PVX 的致病性 暗示了 P6 可能参与了病毒的致病相关进程 同时这也是 CCYV RNA1 组分编码 的 P6 蛋白定位及致病特征的首次报道 为后续深入解析 P6 蛋白功能及其在病毒与寄主互作过程中 的作用机理奠定了基础 P6 是 1 个分子量只有 6 kD 的蛋白 在长线形病毒科 很多成员都会编码类似小分子量蛋白 如 P4 9 P6 P8 等 虽然目前这些小分子量蛋白功能大多不明确 但已有研究结果显示这些蛋白在 病毒与寄主的互作过程中同样也发挥着重要的作用 Alzhanova 等 2000 在研究甜菜黄化病毒 beet yellows virus BYV 时发现其编码的 1 个 6 kD 蛋白突变后会导致病毒扩散受限 说明 P6 参与了 病毒的运动 后续研究揭示其与 HSP70h P64 CP 和 CPm 协同参与了病毒运动 Peremyslov et al 2004 Qiao et al 2017 Qiao 等 2018 在研究莴苣侵染性黄化病毒 lettuce infectious yellows virus LIYV 时发现其编码的 P9 蛋白突变会导致病毒在寄主体内积累量下降 影响病毒的侵染效率 暗 示了 P9 在病毒的侵染过程中起重要作用 Wei 等 2019 在研究 CCYV 编码的 P4 9 时发现其具有 协助蛋白在细胞间扩散的功能 可能参与了病毒的运动 本研究中对 CCYV RNA1 组分编码的 P6 研究结果显示其可以增强 PVX 的致病性 诱发更严重的症状 暗示了 P6 也可能在 CCYV 与寄主互 作的过程中发挥重要作用 Tu Liqin Gan Shexiang Wu Shuhua Ren Chunmei Cheng Zhaobang Zhang Songbai Zhu Yuelin Zhou Yijun Ji Yinghua Characterization of the subcellular localization and pathogenicity of P6 encoded by cucurbit chlorotic yellows virus 1538 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1531 1540 除 CCYV 外 也有毛形病毒属 Crinivirus 其他一些成员编码 6 kD 蛋白的报道 但这些蛋白 在编码位置及同源性上都与本研究中的 P6 存在较大的差异 而目前针对该 P6 尚未见相关功能报道 本研究在利用 PVX 研究 P6 致病性时发现 P6 除导致植物出现褪绿黄化等症状外 还能诱导植物出 现坏死症状 在同属成员中 已有报道多个蛋白会诱导寄主植株出现坏死症状 同时在病毒侵染扩 散及致病等方面都起着重要作用 如 Landeo Rios 等 2017 在研究番茄褪绿病毒时 发现使用 PVX 病毒载体过量表达 P22 也会引起植株坏死 而 P22 是病毒重要的基因沉默抑制子 在病毒侵染过程 中发挥重要作用 Canizares et al 2008 Qiao 等 2018 在研究 LIYV 时也发现使用烟草花叶病 毒载体过量表达 P5 时会引起坏死等症状 而 P5 蛋白突变后会明显的延迟出现病毒症状 这些结果 暗示 P6 可能同样在病毒与寄主互作的过程中发挥重要作用 但具体的功能及其作用方式还有待于 进一步的研究 References Abrahamian P E Sobh H Abou jawdah Y 2012 First report of cucurbit chlorotic yellows virus on cucumber in Lebanon Plant Disease 96 11 1704 1705 Alzhanova D V Hagiwara Y Peremyslov V V Dolja V V 2000 Genetic analysis of the cell to cell movement of beet yellows closterovirus Virology 268 192 200 Amer M A 2015 Serological and molecular characterization of cucurbit 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园艺学报 2021 48 8 1531 1540 1539 洪雪玉 陈剑平 2004 长线形病