陕西省草莓病毒种类的LncRNA测序初步鉴定.pdf

园艺学报 2021 48 8 1589 1594 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2020 0675 http www ahs ac cn 1589 收稿日期 2021 02 23 修回日期 2021 05 11 基金项目 国家重点研发计划项目 2019YFD1001800 陕西省重点研发计划项目 2021NY 040 通信作者 Author for correspondence E mail zhaolei5105 wuyf 陕西省草莓病毒种类的 LncRNA 测序初步鉴定 黄倩茹 1 牛永浩 2 吴 宽 2 刘占杰 3 曹孟籍 4 赵 磊 1 吴云锋 1 1 西北农林科技大学植物保护学院 旱区作物逆境生物学国家重点实验室 陕西杨凌 712100 2 杨凌职业技术学院 陕西杨凌 712100 3 杨凌龙德盛农业科技有限公司 陕西杨凌 712100 4 西南大学柑桔研究所 重庆 400712 摘 要 为明确陕西省草莓主要病毒种类及各种病毒在主产区的地理分布 通过 LncRNA 测序结合 反转录聚合酶链式反应 reverse transcription PCR RT PCR 对陕西省草莓主产区西安 咸阳和宝鸡的 7 个区或县的草莓疑似感染病毒病样品进行了检测 结果表明草莓斑驳病毒 strawberry mottle virus SMoV 和草莓镶脉病毒 strawberry vein band virus SVBV 在 7 个区或县均有发生 而草莓轻型黄边病毒 strawberry mild yellow edge virus SMYEV 菠菜潜隐病毒 spinach latent virus SpLV 和番茄线虫传多面体病毒 Lycopersicon esculentum nepovirus LENV 局部发生 首次报道在草莓上检测到 SpLV 和 LENV 关键词 草莓 草莓斑驳病毒 草莓镶脉病毒 草莓轻型黄边病毒 菠菜潜隐病毒 番茄线虫传多 面体病毒 LncRNA 中图分类号 S 668 4 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2021 08 1589 06 LncRNA Sequencing Identification of Viruses Infecting Strawberry in Shaanxi HUANG Qianru 1 NIU Yonghao 2 WU Kuan 2 LIU Zhanjie 3 CAO Mengji 4 ZHAO Lei 1 and WU Yunfeng 1 1 State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas College of Plant Protection Northwest A F University Yangling Shaanxi 712100 China 2 Yangling Vocational Technical College Yangling Shaanxi 712100 China 3 Yangling Longdesheng Agricultural Science and Technology Co Ltd Yangling Shaanxi 712100 China 4 Citrus Research Institute Southwest University Chongqing 400712 China Abstract In order to clarify major virus species on strawberry and their geographical distribution in main strawberry areas in Shaanxi this study collected and detected strawberry samples from seven districts or counties in Xi an Xianyang and Baoji through LncRNA sequencing and reverse transcription PCR RT PCR Results showed that strawberry mottle virus SmoV and strawberry vein band virus SVBV were identified in all of the seven districts or counties but strawberry mild yellow edge virus SMYEV spinach latent virus SpLV and Lycopersicon esculentum nepovirus LENV were only identified in parts of the seven districts or counties SpLV and LENV were firstly identified in strawberry Keywords strawberry strawberry mottle virus strawberry vein band virus strawberry mild yellow edge virus spinach latent virus Lycopersicon esculentum nepovirus LncRNA Huang Qianru Niu Yonghao Wu Kuan Liu Zhanjie Cao Mengji Zhao Le Wu Yunfeng LncRNA sequencing identification of viruses infecting strawberry in Shaanxi 1590 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1589 1594 随着草莓栽培面积的不断扩大 草莓种苗频繁交换及病毒传播介体的滋生 加剧了草莓病毒的 传播 导致草莓病毒病日益严重 尚巧霞 2015 已成为影响草莓安全稳定生产的重要制约因素之 一 王国平 等 1990 陈道 等 2018 据报道 已发现的草莓病毒约 30 种 陈道 等 2021 其中少数病毒在世界上广泛分布 大 部分病毒仅在局部地区发生 周厚成和何水涛 2003 在中国发生普遍且危害严重的草莓病毒主要 有草莓斑驳病毒 strawberry mottle virus SMoV 草莓镶脉病毒 strawberry vein band virus SVBV 和草莓轻型黄边病毒 strawberry mild yellow edge virus SMYEV 杨洪一 等 2007 另外 草 莓皱缩病毒 strawberry crinkle virus SCV 草莓潜隐环斑病毒 strawberry latent ringspot virus SLRSV 和草莓轻型黄边伴随病毒 strawberry mild yellow edge associated virus SMYEaV 在局部 地区的发生危害也有较多的报道 王国平 等 1990 陈道 等 2018 陕西省各地均有草莓种植 但多数集中在西安 咸阳和宝鸡进行规模化种植 品种以 红颜 和 章姬 为主 有少量 甜查理 迄今为止 陕西省草莓感染的病毒种类以及病毒的地理分布均 缺乏系统性研究 为此 通过 LncRNA 测序结合反转录聚合酶链式反应 reverse transcription PCR RT PCR 对陕西省草莓上述主产区的样品进行了检测 为病毒病的防控提供数据 1 材料与方法 1 1 材料 分别于 2019 年和 2020 年的 4 5 月 在陕西省西安市灞桥区 12 份 红颜 8 份 章姬 临潼县 15 份 红颜 5 份 章姬 户县 8 份 红颜 12 份 章姬 和高陵县 10 份 红 颜 10 份 章姬 咸阳市郊区 12 份 红颜 8 份 章姬 和凤翔县 10 份 红颜 10 份 章姬 宝鸡市眉县 10 份 红颜 8 份 章姬 12 份 甜查理 采集表现叶片黄脉 叶缘 褪绿 花叶 植株矮化和黄化等疑似被病毒侵染的草莓样品共 150 份 于 80 保存备用 1 2 供试样品的 LncRNA 测序与分析 LncRNA long non coding RNA 是一类长度超过 200 bp 没有开放阅读框的内源性非编码 RNA LncRNA 建库时去除 rRNA 可降低 rRNA 序列的干扰 有利于病毒序列的分析 每个地区挑选覆 盖上述症状类型的 10 份独立的样品等量混合后作为一组样品 7 个地区共得到 7 组样品 利用 TRIzol 试剂盒 Invitrogen 提取样品总 RNA 送华大基因科技有限公司进行去 rRNA 建库 用 Illumina HiSeq X ten 平台进行测序 用 CLC Genomics Workbench 9 5 软件去除测序获得片段的接头和低质量的序 列 然后与 GenBank 中已登录的草莓基因组进行匹配分析 去除测序结果中与草莓基因组匹配的序 列 用 Trinity program 软件对没有匹配的序列进行组装 获得组装片段 在 NCBI 数据库对所获得 的片段进行 BLAST 比对 分别找到与已知病毒同源的序列 初步确定感染草莓的主要病毒种类 1 3 供试样品中草莓病毒的 RT PCR 检测 对 LncRNA 测序分析获得的病毒进行 RT PCR 检测 用超微量紫外可见分光光度计测定提取样 品总 RNA 浓度 选择浓度大于 200 ng L 1 的 RNA 用于后续试验 参照韩晓玉等 2020 和冯黎 霞等 2020 报道的 SVBV SMYEV SMoV 和菠菜潜隐病毒 spinach latent virus SpLV 检测引 物对对应的病毒进行检测 番茄线虫传多面体病毒 Lycopersicon esculentum nepovirus LENV 引 黄倩茹 牛永浩 吴 宽 刘占杰 曹孟籍 赵 磊 吴云锋 陕西省草莓病毒种类的 LncRNA 测序初步鉴定 园艺学报 2021 48 8 1589 1594 1591 物根据 LncRNA 测序获得的 LENV 序列设计 表 1 引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成 RT PCR 参照韩晓玉等 2020 报道的试验方法 PCR 产物经 1 琼脂糖凝胶电泳检测 将含有目标 条带的 PCR 产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序 以确定供试样品中有无目标病毒 表 1 RT PCR 检测引物 Table 1 The primers used in RT PCR detection 引物名称 Name of primer 引物序列 5 3 Primer sequence 产物大小 bp Product size 参考文献 Reference SVBVmt F AAGTTTGGATCTGGATTGCG R CTTTCCTTCGGATGGCTGA 816 韩晓玉 等 2020 SMYEVmt F CACCCCGAATCCGAATGTGA R GAGCACGCCATCGAAGAAAT 444 韩晓玉 等 2020 SMoVmt F GCGTGAACAGTCATGTGGTT R TCGTGGTCGCTTACTGGATG 620 韩晓玉 等 2020 SpLV RNA2 F GAACCACCGAAACCGAAA R CCACCTCAACACCAGTCATAG 436 冯黎霞 等 2020 LENV F TCCTTATGAGGCTTTAGGTGGCA R AACTTCTGAGGTGAGGTGGTCC 647 本研究 This study 2 结果与分析 2 1 供试样品的 LncRNA 测序与分析 7 组草莓样品经过 LncRNA 测序分析后 对获得的序列进行 BLASTN 和 BLASTX 比对 获得 了数量不等 1 13 的病毒片段 这些片段与已知病毒的序列同源性介于 86 02 99 80 表 2 其中灞桥区和户县样品均只检测到了 SVBV 最长序列长度分别为 7 862 nt 和 2 813 nt 基因组覆盖 率分别为 99 92 和 35 75 临潼县样品只检测到了 SMoV 最长序列长度为 5 577 nt 基因组覆盖 率为 87 99 高陵县样品检测到了 SVBV 和 SMoV 最长序列长度分别为 7 946 nt 和 6 239 nt 基 因组覆盖率分别为 100 和 98 44 咸阳市郊区样品检测到了 SVBV SMoV SpLV 和 LENV 最 长序列长度分别为 6 706 4 817 2 820 和 3 493 nt 基因组覆盖率分别为 85 23 76 00 96 21 和 46 89 凤翔县样品也检测到了 SVBV SMoV SpLV 和 LENV 最长序列长度分别为 6 703 5 206 2 850 和 4 406 nt 基因组覆盖率分别为 85 23 82 14 97 24 和 59 15 眉县样品检测 到了 SVBV 和 SMYEV 最长序列长度分别为 8 020 和 2 276 nt 基因组覆盖率分别为 100 和 38 12 表 2 供试样品的 LncRNA 测序分析结果 Table 2 Analysis results from LncRNA sequencing of the tested samples 采样地点 Sampling region 大于 200 nt 的病毒片段数量 Total virus contigs 200 nt 与已知病毒核苷酸序列同源性 Nucleotide nt identity with known virus 鉴定到的病毒种类 Viruses identified 灞桥区 Baqiao District 1 98 68 SVBV 临潼县 Lintong County 4 86 02 97 63 SMoV 户县 Huxian County 4 98 68 99 80 SVBV 高陵县 Gaoling County 4 92 48 99 39 SVBV SMoV 咸阳市郊区 Xianyang outskirts 10 95 73 99 05 SVBV SMoV SpLV LENV 凤翔县 Fengxiang County 13 91 00 99 05 SVBV SMoV SpLV LENV 眉县 Meixian County 6 86 23 99 75 SVBV SMYEV 2 2 RT PCR 验证 LncRNA 测序结果 LncRNA 测序分析获得了 SVBV SMoV SMYEV SpLV 和 LENV 共 5 种病毒的序列 对其 对应样品进行 RT PCR 检测 这 5 种病毒均能在对应的样品中检测到 且测序结果正确 图 1 其 中 SVBV 序列 GenBank 登录号 MW001302 与 BJJCX2 GenBank 登录号 KX249738 分离物同 Huang Qianru Niu Yonghao Wu Kuan Liu Zhanjie Cao Mengji Zhao Le Wu Yunfeng LncRNA sequencing identification of viruses infecting strawberry in Shaanxi 1592 Acta Horticulturae Sinica 2021 48 8 1589 1594 源率为 99 02 SMoV 序列 GenBank 登录号 MW001299 与 SMoV RNA2 A GenBank 登录号 MH013325 分离物同源率为 95 21 SMYEV 序列 GenBank 登录号 MW001300 与 T1 GenBank 登录号 LC515235 分离物同源率为 99 78 SpLV 序列 GenBank 登录号 MW001301 与 SRP059420 GenBank 登录号 KY695013 分离物同源率为 98 85 LENV 序列 GenBank 登录号 MW001298 与 pt077 sec 6 GenBank 登录号 MN814315 分离物同源率为 97 99 表明 LncRNA 测序与分析 结果准确可靠 图 1 5 种病毒的 RT PCR 检测结果 M Marker DS2000 阳性 阴性 Fig 1 RT PCR detection results of 5 viruses M Marker DS2000 Positive Negative 2 3 田间样品的 RT PCR 检测 对 150份疑似被侵染的样品进行 5种病毒检测 结果 7个地区的样品中均检测到 SVBV和 SMoV 阳性样品数分别为 33 和 19 个 SMYEV 在眉县 灞桥和临潼检测到 阳性样品总数为 9 个 SpLV 和 LENV 在咸阳郊区和凤翔检测到 阳性样品数分别为 6 个和 5 个 表 3 表 3 田间草莓样品 5 种病毒的 RT PCR 检测结果 Table 3 The detection results of five viruses from different strawberry fields by RT PCR 采样地点 Sampling region 检测结果 阳性数 总数 Detection results No of positive samples No of total samples SVBV SMYEV SMoV SpLV LENV 灞桥区 Baqiao District 6 20 1 20 2 20 0 20 0 20 临潼县 Lintong County 3 20 2 20 5 20 0 20 0 20 户县 Huxian County 4 20 0 20 1 20 0 20 0 20 高陵县 Gaoling County 5 20 0 20 3 20 0 20 0 20 咸阳市郊区 Xianyang outskirts 4 20 0 20 3 20 3 20 2 20 凤翔县 Fengxiang County 5 20 0 20 3 20 3 20 3 20 眉县 Meixian County 6 30 6 30 2 30 0 30 0 30 合计 Total 33 150 9 150 19 150 6 150 5 150 3 讨论 本研究中明确了 SVBV 和 SMoV 是侵染陕西省草莓的主要病毒 SMYEV SpLV 和 LENV 则 在陕西省局部地区发生危害 SVBV SMYEV 和 SMoV 是草莓上普遍发生且危害严重的病毒 这 3 种病毒中某 1 种单独侵 染可造成约 30 的产量损失 混合侵染最高可造成 80 的产量损失 Horn Carver 1962 Martin Converse 1977 Mellor Krczal 1987 Thompson et al 2002 这 3 种病毒在中国 美国 澳大 黄倩茹 牛永浩 吴 宽 刘占杰 曹孟籍 赵 磊 吴云锋 陕西省草莓病毒种类的 LncRNA 测序初步鉴定 园艺学报 2021 48 8 1589 1594 1593 利亚 加拿大新西兰以及欧洲的许多国家均广泛分布 Frazier Morris 1987 Converse 1992 Honet legrov et al 1995 Petrzik et al 1998 Martin Tzanetakis 2006 Cie li ska 2019 菠 菜潜隐病毒 SpLV 首次在草莓上检测到 SpLV 感染的菠菜种子发芽率降低 芽苗生长势减弱 Bos et al 1980 其主要分布在丹麦 芬兰 瑞典 挪威 新西兰 美国和日本等国家 中国没有该病 毒发生危害的报道 冯黎霞 等 2020 番茄线虫传多面体病毒 LENV 也是首次在草莓上检测 到 关于该病毒对农作物造成危害的报道较少 目前 SpLV 和 LENV 对草莓的危害还不清楚 为防 止这 2 种病毒在草莓上大量的传播和扩散 建议今后在植物病毒检疫 草莓脱毒和草莓病毒检测中 加强重视 SVBV SMYEV 和 SMoV 在田间主要通过草莓钉蚜 Chaetosiphon fragaefolii 传播 尚巧霞 2015 SpLV 则主要通过种子传播 该病毒在藜麦和菠菜上种传率超过 50 在烟草上超过 90 Bos et al 1980 LENV 的具体传播途径目前还不明确 本研究中在陕西省草莓主产区共检测到了 5 种病毒 这 5 种病毒中 SVBV 和 SMoV 在 7 个县或 区均有发生 且检出率分别是 22 0 和 12 7 这可能与当地部分果农不使用草莓脱毒苗 通过自 己繁育草莓苗进行种植有关 今后应加大草莓脱毒苗的推广使用 减少草莓病毒的危害 鉴于 SpLV 和 LENV 目前在陕西局部草莓产区有发生 今后在植物病毒检疫 草莓脱毒 草莓病毒检测等方面 应重视 SpLV 和 LENV 防止这 2 种病毒在不同地区间相互传播 同时防止其由草莓传播到其他作 物 在生产草莓脱毒苗时应重视 SpLV 和 LENV 的脱除 本研究中明确了陕西省侵染草莓的主要病毒种类 明确了它们在陕西省 7 个草莓主产区的分布 和检出率 并首次在草莓上检测到 SpLV 和 LENV 为草莓脱毒及草莓病毒的防治提供了重要数据 References Bos L Huttinga H Maat D Z 1980 Spinach latent virus a new ilarvirus seed borne in Spinacia oleracea Journal of Plant Pathology 86 2 79 98 Chen Dao Ding Xin lun Zhang Jie Xie Li yan Wu Zu jian 2018 Molecular detection of six viruses infecting strawberry in Fujian Province Journal of Plant Protection 45 6 1433 1434 in Chinese 陈 道 丁新伦 张 洁 谢荔岩 吴祖建 2018 福建省六种草莓病毒的分子检测 植物保护学报 45 6 1433 1434 Chen Dao Zhang Jie Wu Zu jian Ding Xin lun 2021 Genome sequence of strawberry pallidosis associated virus isolated in China Acta Horticulturae Sinica 48 1 146 152 in Chinese 陈 道 张 洁 吴祖建 丁新伦 2021 草莓白化相关病毒中国分离物全基因组分析 园艺学报 48 1 146 152 Cie li ska M 2019 Genetic diversity of seven strawberry mottle virus isolates in Poland Plant Pathology Journal 35 4 389 392 Converse R H 1992 Modern approaches to strawberry virus research Acta Horticulture 308 19 30 Feng Li xia He Rui fang Zuo Ran ling He Ri rong Wu Mu tao Hu Xue nan 2020 Detection and 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