抗生素对基质发酵及双孢菇栽培过程中氮素转化的影响.pdf

第 53 卷 第 1 期 2025 年 1 月 西 北 农 林 科 技 大 学 学 报 自 然 科 学 版 J ou r na l o f No r t hwe s t A 吉 林 省 与 中 国 科 学 院 科 技 合 作 高 技 术 产 业 化 专 项 2022SYHZ0020 吉 林 省 重 大 科 技 专 项 YDZJ 202203CGZH045 吉 林 省 创 新 创 业 人 才 项 目 2023QN20 作 者 简 介 王 菲 1990 女 吉 林 长 春 人 研 究 实 习 员 硕 士 主 要 从 事 食 用 菌 基 质 及 秸 秆 饲 料 化 基 质 化 研 究 E ma i l wang f e i 90wf 163 c om 通 信 作 者 钟 荣 珍 1981 女 满 族 河 北 承 德 人 研 究 员 博 士 主 要 从 事 反 刍 动 物 营 养 研 究 E ma i l zhong r ong zhen i ga a c cn 王 菲 1 2 韩 宇 杰 1 3 房 义 1 向 海 1 3 谷 月 4 常 潇 1 3 钟 荣 珍 1 1 中 国 科 学 院 东 北 地 理 与 农 业 生 态 研 究 所 吉 林 省 草 地 畜 牧 重 点 实 验 室 吉 林 长 春 130102 2 黑 龙 江 省 农 业 科 学 院 牡 丹 江 分 院 黑 龙 江 牡 丹 江 157041 3 中 国 科 学 院 大 学 现 代 农 业 科 学 学 院 北 京 100049 4 镇 赉 县 和 合 牧 业 发 展 有 限 公 司 吉 林 白 城 137300 摘 要 目 的 探 究 在 农 作 物 秸 秆 饲 养 基 质 发 酵 食 用 菌 栽 培 过 程 中 抗 生 素 莫 能 菌 素 对 氮 转 化 及 农 业 废 弃 物 综 合 利 用 效 率 的 影 响 为 种 养 结 合 综 合 利 用 体 系 及 农 业 废 弃 物 综 合 利 用 提 供 理 论 基 础 方 法 选 取 吉 林 省 辽 源 县 一 处 肉 牛 养 殖 场 的 30 头 肉 牛 随 机 均 分 为 2 组 饲 喂 60 d 其 中 一 组 饲 料 中 加 入 抗 生 素 莫 能 菌 素 RA 一 组 不 添 加 RN 收 集 2 组 肉 牛 粪 便 分 别 与 水 稻 秸 秆 混 合 后 发 酵 35 d 发 酵 产 物 作 为 基 质 栽 培 双 孢 菇 发 酵 过 程 中 测 定 NH3 和 N2O 的 排 放 情 况 在 发 酵 和 栽 培 过 程 中 测 定 基 质 总 氮 量 同 时 测 定 基 质 含 水 量 温 度 C N pH 以 及 脲 酶 硝 酸 盐 还 原 酶 亚 硝 酸 盐 还 原 酶 活 性 利 用 16S rRNA 和 ITS 测 序 来 表 征 发 酵 基 质 中 的 细 菌 和 真 菌 种 群 组 成 测 定 双 孢 菇 子 实 体 产 量 和 总 氮 含 量 探 究 基 质 发 酵 和 双 孢 菇 栽 培 过 程 中 抗 生 素 对 氮 素 转 移 及 氮 回 收 的 影 响 结 果 在 发 酵 阶 段 基 质 中 残 留 的 抗 生 素 未 改 变 基 质 温 度 含 水 量 C N 的 变 化 趋 势 但 高 温 期 平 均 温 度 下 降 了 1 1 NH3 和 N2O 排 放 量 降 低 更 多 的 氮 留 在 了 基 质 中 RN 处 理 的 氮 保 留 率 为 39 58 RA 处 理 为 43 23 抗 生 素 抑 制 了 氮 素 的 转 移 相 比 RN 处 理 RA 处 理 发 酵 后 基 质 理 化 性 质 不 利 于 双 孢 菇 菌 丝 生 长 残 留 的 抗 生 素 使 RA 处 理 初 始 脲 酶 硝 酸 盐 还 原 酶 和 亚 硝 酸 盐 还 原 酶 活 性 高 于 RN 处 理 P 0 05 发 酵 开 始 后 RA 处 理 基 质 中 的 脲 酶 和 硝 酸 盐 还 原 酶 活 性 低 于 RN 处 理 亚 硝 酸 盐 还 原 酶 活 性 仍 高 于 RN 处 理 栽 培 结 束 后 RA 处 理 的 脲 酶 活 性 高 于 RN 处 理 硝 酸 盐 还 原 酶 和 亚 硝 酸 盐 还 原 酶 活 性 仍 低 于 RN 处 理 在 双 孢 菇 栽 培 阶 段 基 质 中 残 留 的 抗 生 素 影 响 了 双 孢 菇 菌 丝 的 生 长 提 高 了 基 质 的 含 水 量 和 pH 在 开 始 出 菇 前 基 质 的 C N 降 低 最 终 双 孢 菇 产 量 降 低 氮 回 收 率 从 0 17 RN 处 理 下 降 至 0 11 RA 处 理 发 酵 结 束 后 残 留 的 抗 生 素 使 变 形 菌 门 和 拟 杆 菌 门 细 菌 及 海 杆 菌 属 细 菌 M y c o t h e r m u s 属 真 菌 的 相 对 丰 度 降 低 厚 壁 菌 门 和 放 线 菌 门 细 菌 及 假 小 蜜 环 菌 属 真 菌 的 相 对 丰 度 升 高 结 论 基 质 中 残 留 的 抗 生 素 抑 制 了 氮 素 的 转 化 更 多 的 氮 保 留 在 基 质 中 影 响 了 双 孢 菇 生 长 降 低 了 氮 转 化 率 关 键 词 抗 生 素 废 弃 物 利 用 基 质 发 酵 微 生 物 群 落 氮 素 转 移 双 孢 菇 栽 培 中 图 分 类 号 X705 S579 81 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1671 9387 2025 01 0144 13 E f f e c t s o f a n t i b i o t i c o n n i t r o g e n t r a n s f o r m a t i o n d u r i n g s u b s t r a t e f e r m e n t a t i o n a n d e d i b l e f u n g i c u l t i v a t i o n WANG Fe i 1 2 HAN Yu j i e 1 3 FANG Yi 1 XIANG Ha i 1 3 GU Yue 4 CHANG Xi ao 1 3 ZHONG Rong zhen 1 1 J i l i n P r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f G r a s s l a n d F a r m i n g N o r t h e a s t I n s t i t u t e o f G e o g r a p h y a n d A g r o e c o l o g y C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s C h a n g c h u n J i l i n 130102 C h i n a 2 M u d a n j i a n g B r a n c h o f A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s M u d a n j i a n g H e i l o n g j i a n g 157041 C h i n a 3 C o l l e g e o f A d v a n c e d A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s U n i v e r s i t y o f C h i n e s e A c a d e m y o f S c i e n c e s B e i j i n g 100049 C h i n a 4 Z h e n l a i C o u n t y H e h e A n i m a l H u s b a n d r y D e v e l o p m e n t C o L t d B a i c h e n g J i l i n 137300 C h i n a A b s t r a c t Ob j e c t i ve Th i s s t udy exp l o r ed t he e f f e c t s o f an t i b i o t i c s monens i n on n i t r ogen c onve r s i on and comp r ehens i ve u t i l i z a t i on e f f i c i enc y o f ag r i cu l t u r a l wa s t e i n t he p r oc e s s o f c r op s t r aw f e ed i ng subs t r a t e f e rmen t a t i on ed i b l e f ungus cu l t i va t i on t o p r ov i de ba s i s f o r c omp r ehens i ve u t i l i z a t i on s ys t em o f p l an t i ng and b r e ed i ng and u t i l i z a t i on o f ag r i cu l t u r a l wa s t e Me t hod Th i r t y be e f c a t t l e f r om a f a rm i n L i aoyuan J i l i n we r e r andoml y d i v i ded i n t o two g r oups and f ed f o r 60 days Fe ed o f one g r oup wa s added wi t h an t i b i o t i c monens i n RA wh i l e t he o t he r g r oup wa s no t added RN Be e f c a t t l e manu r e wa s c o l l e c t ed and mi xed wi t h r i c e s t r aw f o r f e rmen t a t i on f o r 35 days Emi s s i ons o f NH3 and N2O we r e me a su r ed du r i ng t he f e rmen t a t i on p r o c e s s Du r i ng f e rmen t a t i on and cu l t i va t i on t o t a l n i t r ogen c on t en t o f t he subs t r a t e wa s a l s o de t e r mi ned The e f f e c t s o f an t i b i o t i c s on n i t r ogen t r ans f e r and n i t r ogen r e cove r y dur i ng subs t r a t e f e rmen t a t i on and A g a r i c u s b i s p o r u s cu l t i va t i on we r e i nve s t i ga t ed by me a su r i ng y i e l d and t o t a l n i t r ogen c on t en t o f A b i s p o r u s f ru i t i ng body Wa t e r c on t en t t empe r a t u r e C N pH u r e a s e n i t r a t e r educ t a s e and n i t r i t e r educ t a s e a c t i v i t i e s o f t he subs t r a t e dur i ng f e rmen t a t i on and A b i s p o r u s cu l t i va t i on we r e me a sur ed The 16S rRNA and ITS s equenc i ng we r e us ed t o cha r a c t e r i z e ba c t e r i a l and f unga l popu l a t i on c ompos i t i on i n t he f e rmen t a t i on subs t r a t e Re su l t I n t he f e rmen t a t i on s t age r e s i dua l an t i b i o t i c s i n t he subs t r a t e d i d no t change t he t r ends o f subs t r a t e t empe r a t ur e wa t e r con t en t and C N bu t ave r age t empe r a t ur e i n t he h i gh t empe r a t ur e pe r i od de c r e a s ed by 1 1 and emi s s i ons o f NH3 and N2O de c r e a s ed Mo r e n i t r ogen r ema i ned i n t he sub s t r a t e n i t r ogen r e t en t i on r a t e o f RN and RA t r e a tmen t s we r e 39 58 and 43 23 r e spe c t i ve l y and an t i b i o t i c s i nh i b i t ed n i t r ogen t r ans f e r Compa r ed wi t h RN t r e a tmen t phys i c a l and chemi c a l p r ope r t i e s o f t he subs t r a t e a f t e r RA t r e a tmen t we r e no t c onduc i ve t o t he g r owt h o f A b i s p o r u s myc e l i um The i n i t i a l a c t i v i t i e s o f ur e a s e n i t r a t e r educ t a s e and n i t r i t e r educ t a s e i n RA t r e a tmen t we r e h i ghe r t han t ho s e i n RN t r e a t men t P 0 05 Af t e r t he s t a r t o f f e rmen t a t i on t he a c t i v i t i e s o f u r e a s e and n i t r a t e r educ t a s e i n RA t r e a t men t we r e l owe r t han t ho s e i n RN t r e a tmen t and t he a c t i v i t y o f n i t r i t e r educ t a s e wa s s t i l l h i ghe r t han t ha t i n RN t r e a tmen t Af t e r t he end o f cu l t i va t i on t he ur e a s e a c t i v i t y o f RA t r e a tmen t exc e eded t ha t o f RN t r e a tmen t and t he a c t i v i t i e s o f n i t r a t e r educ t a s e and n i t r i t e r educ t a s e we r e s t i l l l owe r t han t ho s e o f RN t r e a tmen t I n t he cu l t i va t i on s t age o f A b i s p o r u s r e s i dua l an t i b i o t i c s i n t he subs t r a t e a f f e c t ed t he g r owt h o f A b i s p o r u s myc e l i um i nc r e a s ed wa t e r con t en t and pH o f t he subs t r a t e de c r e a s ed t he C N o f t he sub s t r a t e be f o r e t he beg i nn i ng o f f ru i t i ng and f i na l l y de c r e a s ed t he y i e l d o f A b i s p o r u s The n i t r ogen r e c ove r y r a t e de c r e a s ed f r om 0 17 RN t o 0 11 RA Af t e r t he f e rmen t a t i on p r oc e s s t he r e l a t i ve abundanc e o f phy l a Pr o t eoba c t e r i a and Ba c t e r o i do t a and t ha t o f genus M a r i n o b a c t e r and M y c o t h e r m u s wa s de c r e a s ed wh i l e t ha t o f phy l a F i rmi cu t e s and Ac t i noba c t e r i o t a and genus P s e u d o a r m i l l a r i e l l a wa s i nc r e a s ed Con c l us i on Re s i dua l an t i b i o t i c s i n t he subs t r a t e i nh i b i t ed t he t r ans f o rma t i on o f n i t r ogen and mo r e n i t r ogen r e ma i ned i n t he subs t r a t e wh i ch a f f e c t ed t he g r owt h o f A b i s p o r u s and r educ ed n i t r ogen c onve r s i on K e y w o r d s an t i b i o t i c wa s t e r eus e subs t r a t e f e rmen t a t i on mi c r ob i a l c ommun i t y n i t r ogen t r ans f o rma t i on A g a r i c u s b i s p o r u s cu l t i va t i on 随 着 全 球 畜 禽 养 殖 量 的 增 加 动 物 粪 便 的 产 量 也 逐 渐 增 加 其 中 约 25 的 粪 便 直 接 被 弃 置 1 此 外 还 有 大 量 的 农 作 物 秸 秆 未 得 到 充 分 利 用 未 经 处 理 的 畜 禽 粪 便 和 农 作 物 秸 秆 在 分 解 过 程 中 会 释 放 有 害 气 体 所 含 的 氮 也 会 转 化 成 气 体 排 出 主 要 是 NH3 和 N2O 不 仅 污 染 环 境 还 会 造 成 氮 素 损 失 利 用 动 物 粪 便 和 农 作 物 秸 秆 好 氧 发 酵 生 产 肥 料 或 者 用 作 食 用 菌 基 质 是 实 现 废 物 资 源 化 利 用 促 进 氮 回 收 维 持 循 环 生 物 经 济 的 有 效 途 径 2 3 在 肉 牛 饲 养 过 程 中 常 会 使 用 抗 生 素 如 莫 能 菌 素 以 提 高 饲 料 转 化 效 率 4 在 全 球 范 围 内 73 的 抗 生 素 药 物 用 于 食 用 动 物 由 于 代 谢 率 较 低 5 其 中 有 30 90 通 过 尿 液 以 及 粪 便 排 出 6 残 留 抗 生 素 代 谢 产 物 和 抗 生 素 抗 性 基 因 对 植 物 7 动 物 8 和 人 类 9 造 成 了 严 重 影 响 发 展 作 物 栽 培 与 畜 禽 养 殖 结 合 的 种 养 一 体 化 循 环 利 用 系 统 可 以 实 现 资 源 循 环 利 用 减 少 污 染 9 与 堆 肥 类 似 基 质 发 酵 可 以 稳 定 有 机 质 并 从 畜 禽 粪 便 中 去 除 有 害 物 质 如 抗 生 5 4 1 第 1 期 王 菲 等 抗 生 素 对 基 质 发 酵 及 双 孢 菇 栽 培 过 程 中 氮 素 转 化 的 影 响素 10 发 酵 过 程 中 的 氨 化 作 用 和 脱 氮 作 用 可 以 分 别 产 生 NH3 和 N2O 导 致 大 量 氮 以 气 体 形 式 排 放 到 大 气 中 11 在 发 酵 过 程 中 许 多 细 菌 负 责 氮 的 转 化 及 磷 和 钾 的 溶 解 可 以 使 营 养 物 质 更 容 易 被 利 用 12 氮 素 转 化 效 果 直 接 决 定 了 最 终 发 酵 和 食 用 菌 栽 培 的 效 果 畜 禽 粪 便 中 残 留 的 抗 生 素 可 能 通 过 选 择 性 抑 制 或 毒 害 微 生 物 群 落 的 方 式 直 接 或 间 接 改 变 微 生 物 群 落 结 构 和 物 质 转 化 过 程 13 目 前 关 于 残 留 抗 生 素 对 氮 转 化 蘑 菇 产 量 和 微 生 物 群 落 影 响 的 研 究 较 少 且 现 有 研 究 只 关 注 种 养 一 体 化 系 统 的 单 个 阶 段 或 某 些 关 键 环 节 缺 乏 基 于 整 个 系 统 的 抗 生 素 对 氮 转 化 影 响 的 研 究 为 此 本 研 究 基 于 农 作 物 秸 秆 养 殖 基 质 发 酵 食 用 菌 栽 培 体 系 将 水 稻 秸 秆 和 牛 粪 混 合 后 作 为 双 孢 菇 栽 培 基 质 通 过 研 究 基 质 理 化 性 质 及 发 酵 阶 段 微 生 物 组 成 的 变 化 探 究 抗 生 素 对 氮 转 化 及 农 业 废 弃 物 综 合 利 用 效 率 的 影 响 以 期 为 种 养 结 合 综 合 利 用 体 系 中 氮 素 转 移 规 律 的 研 究 及 农 业 废 弃 物 综 合 利 用 提 供 参 考 1 材 料 与 方 法 1 1 材 料 与 菌 株 来 源 在 吉 林 省 辽 源 县 一 个 肉 牛 养 殖 场 选 取 体 质 量 约 400 kg 的 健 康 西 门 塔 尔 肉 牛 30 头 随 机 均 分 为 2 组 一 组 正 常 饲 喂 另 一 组 喂 食 相 同 饲 料 但 每 吨 饲 料 添 加 150 g 莫 能 菌 素 连 续 饲 喂 60 d 后 分 别 连 续 7 d 收 集 牛 粪 便 各 自 混 合 均 匀 后 备 用 水 稻 秸 秆 取 自 吉 林 省 辽 源 县 自 然 风 干 后 粉 碎 成 2 5 cm 的 颗 粒 辅 料 为 尿 素 CH4N2O 分 析 纯 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 氧 化 钙 CaO 化 学 纯 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 硫 酸 钙 CaSO4 2H2O 分 析 纯 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 牛 粪 和 水 稻 秸 秆 理 化 性 质 见 表 1 其 中 总 氮 总 碳 纤 维 素 半 纤 维 素 和 木 质 素 含 量 均 为 质 量 分 数 供 试 双 孢 菇 菌 株 W192 购 自 山 东 省 寿 光 市 食 用 菌 研 究 所 表 1 本 试 验 中 不 同 来 源 发 酵 原 料 的 理 化 性 质 n 6 Tab l e 1 Phy s i c a l and chemi c a l p r ope r t i e s o f r aw subs t r a t e ma t e r i a l s f o r f e rmen t a t i on n 6 指 标 I ndex 水 稻 秸 秆 Ri c e s t r aw 有 抗 生 素 牛 粪 An t i b i o t i c manur e 无 抗 生 素 牛 粪 No an t i b i o t i c manur e 含 水 量 Mo i s t ur e 9 76 81 68 82 64 pH 8 61 8 80 总 氮 To t a l n i t r ogen 0 35 1 94 1 99 总 碳 To t a l c a r bon 49 10 47 41 48 66 纤 维 素 Ce l l u l o s e 36 65 30 81 29 54 半 纤 维 素 Hemi c e l l u l o s e 26 48 27 64 26 46 木 质 素 L i gn i n 14 30 8 85 8 33 莫 能 菌 素 mg kg 1 Monens i n 30 65 1 2 基 质 发 酵 及 食 用 菌 栽 培 试 验 将 无 抗 生 素 牛 粪 与 水 稻 秸 秆 混 合 作 为 对 照 处 理 RN 含 抗 生 素 牛 粪 与 水 稻 秸 秆 混 合 作 为 试 验 处 理 RA 每 个 处 理 重 复 3 次 3 桶 各 处 理 原 料 组 成 均 为 质 量 分 数 秸 秆 49 牛 粪 49 干 质 量 尿 素 1 氧 化 钙 0 5 和 硫 酸 钙 0 5 将 原 料 充 分 拌 匀 后 放 入 不 带 盖 的 高 密 度 聚 乙 烯 桶 直 径 40 cm 高 度 80 cm 容 积 100 48 L 中 进 行 发 酵 发 酵 棚 内 自 然 采 光 自 然 通 风 发 酵 时 间 为 35 d 环 境 温 度 为 15 0 23 0 相 对 湿 度 为 60 70 发 酵 产 物 用 于 栽 培 双 孢 菇 使 用 带 网 眼 的 塑 料 筐 40 cm 60 cm 50 cm 栽 培 双 孢 菇 每 处 理 4 筐 即 4 个 重 复 将 发 酵 基 质 均 匀 铺 入 塑 料 筐 中 按 照 每 千 克 基 质 接 种 125 g 菌 种 的 比 例 进 行 接 种 在 菌 丝 生 长 阶 段 培 养 室 温 度 保 持 在 24 26 该 阶 段 对 湿 度 无 要 求 保 持 自 然 通 风 为 了 防 止 水 分 流 失 过 快 用 塑 料 薄 膜 覆 盖 在 栽 培 筐 顶 部 直 至 菌 丝 在 基 质 中 长 满 后 撤 去 塑 料 薄 膜 菌 丝 长 满 后 对 基 质 进 行 覆 土 天 然 腐 殖 土 使 用 前 于 121 高 压 灭 菌 60 mi n 覆 土 厚 度 为 5 cm 将 温 度 调 节 至 16 18 空 气 湿 度 调 节 至 90 湿 度 不 足 时 以 喷 雾 方 式 对 菇 房 进 行 加 湿 由 于 双 孢 菇 属 于 喜 暗 性 菇 类 因 此 除 原 基 分 化 期 需 要 给 予 微 弱 散 射 光 外 其 余 时 期 均 采 用 暗 培 养 1 3 发 酵 和 栽 培 阶 段 的 样 品 采 集 1 3 1 发 酵 阶 段 气 体 收 集 在 基 质 发 酵 的 0 3 5 7 9 11 14 16 18 21 23 25 28 31 和 35 d 进 行 翻 堆 每 天 在 09 00 和 17 00 使 用 电 子 温 度 计 在 基 质 的 上 中 下 部 测 温 取 平 均 值 在 发 酵 的 2 4 7 10 14 21 28 和 35 d 收 集 气 体 测 定 NH3 和 N2O 排 放 量 气 体 收 集 装 置 包 括 带 气 体 收 集 口 配 备 硅 胶 塞 的 PVC 抽 气 罩 直 径 56 cm 高 90 cm 容 积 221 56 L 和 带 水 槽 的 底 座 每 次 收 集 气 体 前 将 抽 气 罩 扣 置 在 底 座 槽 中 并 将 底 座 的 水 槽 注 满 水 以 确 6 4 1 西 北 农 林 科 技 大 学 学 报 自 然 科 学 版 第 53 卷保 其 密 封 性 使 发 酵 桶 处 于 密 闭 空 间 内 用 容 积 30 mL 带 气 阀 的 注 射 器 每 20 mi n 收 集 一 次 气 体 共 4 次 0 20 40 60 mi n 并 在 24 h 内 用 气 相 色 谱 仪 完 成 样 品 测 试 1 3 2 发 酵 阶 段 和 栽 培 阶 段 基 质 样 品 收 集 在 发 酵 开 始 0 d 及 发 酵 期 的 7 14 21 28 和 35 d 翻 堆 后 收 集 基 质 将 收 集 的 基 质 分 为 4 份 一 份 用 于 测 定 含 水 量 一 份 用 于 测 定 pH 一 份 在 65 下 干 燥 48 h 粉 碎 后 用 于 测 定 其 他 理 化 指 标 一 份 于 80 保 存 用 于 微 生 物 分 析 在 菌 丝 长 满 栽 培 40 d 原 基 生 成 栽 培 55 d 开 始 出 菇 栽 培 62 d 和 子 实 体 采 收 完 成 栽 培 80 d 4 个 阶 段 对 双 孢 菇 栽 培 基 质 进 行 采 样 取 样 时 除 去 基 质 表 面 的 覆 土 分 别 从 栽 培 筐 的 5 个 不 同 位 置 采 集 样 品 约 30 g 将 从 每 处 理 4 筐 中 采 集 的 20 份 样 品 混 合 均 匀 后 分 成 3 份 每 份 样 品 约 100 g 作 为 3 次 重 复 选 取 发 酵 0 10 高 温 期 中 期 14 基 质 温 度 最 高 35 d 基 质 发 酵 结 束 和 栽 培 80 d 子 实 体 采 收 完 成 的 基 质 用 于 酶 活 测 定 1 4 测 定 指 标 及 方 法 在 基 质 发 酵 过 程 中 氨 气 NH3 排 放 量 用 硼 酸 吸 收 和 滴 定 法 确 认 14 N2O 排 放 量 用 气 相 色 谱 仪 7890B GC s ys t em Ag i l en t Te chno l ogy 美 国 进 行 分 析 15 每 次 收 集 完 鲜 样 立 刻 测 定 基 质 含 水 量 和 pH 将 收 集 的 基 质 样 品 置 于 105 下 干 燥 至 恒 质 量 后 计 算 含 水 量 16 称 取 基 质 样 品 15 g 放 入 50 mL 的 烧 杯 中 按 质 量 体 积 比 1 2 将 无 离 子 水 加 到 烧 杯 中 搅 拌 均 匀 静 置 30 mi n 用 pH 计 T e s t o 205 T e s t o AG Le n z k i r c h 德 国 测 定 基 质 悬 液 pH 基 质 中 脲 酶 硝 酸 盐 还 原 酶 和 亚 硝 酸 盐 还 原 酶 活 性 测 定 采 用 分 光 光 度 法 使 用 酶 标 仪 RT 6100 RAYTO Lt d 美 国 和 试 剂 盒 BC0120 BC3105 BC2990 索 莱 宝 北 京 测 定 总 氮 量 使 用 流 动 分 析 仪 Fu t u r a AMS Al l i anc e 法 国 测 定 总 碳 量 使 用 元 素 分 析 仪 Rap i dCS cube C Ve r s i on El emen t a r Ana l ys en s ys t eme GmbH 德 国 测 定 计 算 碳 氮 比 C N 氮 保 留 率 和 子 实 体 氮 回 收 率 为 了 保 证 测 定 条 件 一 致 用 于 总 氮 量 总 碳 量 及 酶 活 性 测 定 的 样 品 均 烘 干 粉 碎 或 冻 干 后 保 存 栽 培 完 成 后 统 一 测 定 微 生 物 待 测 样 品 超 低 温 保 存 栽 培 完 成 后 统 一 送 测 发 酵 阶 段 氮 保 留 率 发 酵 基 质 中 总 氮 量 最 初 基 质 中 总 氮 量 100 栽 培 阶 段 氮 保 留 率 栽 培 基 质 中 总 氮 量 最 初 基 质 中 总 氮 量 100 子 实 体 氮 回 收 率 子 实 体 中 总 氮 量 栽 培 开 始 时 基 质 中 总 氮 量 100 由 于 样 品 收 集 消 耗 了 部 分 基 质 影 响 对 相 关 指 标 的 分 析 因 此 初 始 基 质 和 发 酵 结 束 基 质 质 量 均 减 去 取 样 消 耗 的 基 质 质 量 而 栽 培 结 束 时 的 基 质 质 量 为 实 测 质 量 1 5 微 生 物 DNA 提 取 测 序 和 分 析 由 于 双 孢 菇 是 大 型 真 菌 栽 培 期 间 基 质 中 遍 布 双 孢 菇 菌 丝 因 此 只 对 基 质 发 酵 阶 段 的 微 生 物 组 成 进 行 测 定 和 分 析 从 每 个 发 酵 样 品 中 提 取 微 生 物 总 基 因 组 DNA 每 个 处 理 各 阶 段 分 别 设 置 4 次 重 复 利 用 16S rRNA 和 ITS 测 序 来 表 征 发 酵 基 质 中 的 细 菌 和 真 菌 种 群 利 用 I on S5TM XL 细 菌 平 台 和 I l l u mi na 真 菌 平 台 I l l umi na San Di ego 加 利 福 尼 亚 美 国 进 行 分 析 测 序 工 作 委 托 北 京 诺 禾 致 源 科 技 股 份 有 限 公 司 完 成 相 关 分 析 在 该 公 司 的 诺 和 云 平 台 上 进 行 为 研 究 各 样 本 的 物 种 组 成 对 所 有 样 本 的 有 效 数 据 以 97 的 一 致 性 进 行 OTUs Ope r a t i on a l Taxonomi c Un i t s 聚 类 然 后 对 OTUs 的 序 列 进 行 物 种 注 释 根 据 物 种 注 释 结 果 可 看 到 每 个 处 理 在 门 水 平 和 属 水 平 上 相 对 丰 度 较 高 的 物 种 及 其 比 例 采 用 典 型 相 关 分 析 CCA 分 析 探 讨 环 境 因 素 温 度 含 水 量 pH 和 总 氮 量 与 微 生 物 组 成 的 关 联 采 用 env f i t 函 数 检 验 每 个 环 境 因 素 的 显 著 性 1 6 数 据 统 计 与 分 析 用 Mi c r o s o f t o f f i c e 2016 对 试 验 数 据 进 行 统 计 采 用