施用有机肥对生菜和土壤中可培养抗生素耐药菌的影响.pdf

收稿日期 2019 03 22 基金项目 上海市农委基础研究项目 沪农科攻字 2014 第7 3 6号 上海市市级农口系统青年人才成长 划 沪农青字 2018 第1 38号 国家自然科学基金项目 31401599 美国外交部国际教育协会英美联合全球创新倡议 GII 项目 GRT00033913 作者简介 李会贤 1995 女 硕士 研究方向 食品微 物 E mail xian529616860 qq com 通信作者 E mail shao saas 163 com 上海农业学报 2020 36 5 91 95 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 05 18 李会贤 赵晶 姚春霞 等 施用有机肥对 菜和 壤中可培养抗 素耐药菌的影响 J 上海农业学报 2020 36 5 91 95 施用有机肥对生菜和土壤中可培养抗生素耐药菌的影响 李会贤1 2 赵 晶2 3 姚春霞2 4 黄柳娟2 冯 博2 王 华5 6 王卫国7 邵 毅2 4 1上海海洋大学食品学院 上海201306 2上海市农业科学院农产品质 标准与检测技术研究所 上海201403 3华东师范大学地理科学学院 上海200241 4上海市设施园艺技术重点实验室 上海201403 5美国俄亥俄州立大学食品科学与技术系 哥伦布43210 6复旦大学 命科学学院 上海200433 7上海国荣果业专业合作社 上海201516 摘 要 为研究施有机肥对 菜及 壤中抗 素耐药菌的影响 用盆栽试验和平板 数法研究了施肥后采 摘期 菜和 壤中可培养细菌对四环素 TET 强力霉素 DOX 磺胺甲恶唑 SUL 头孢噻肟 CTX 红霉素 ERM 环丙沙星 CIP 和萘啶酸 NDA 7种抗 素的耐药水平 用聚合酶链式反应技术筛查了8种耐药基因和 整合酶基因的存在情况 结果表明 栽培30 d的 菜表面未筛查到四环素耐药菌TETS和强力霉素耐药菌 DOXS 其他 菜中7种耐药菌占总菌的百分比均高于对照组 壤中TETS CIPS NDAS ERMS和SULS 5类耐药菌 的比例在施肥后均显著增加 施肥后45 d内 菜和 壤中耐药基因的检出率均高于对照组 因此 施用富含耐 药菌的有机肥会提高采摘期 菜及 壤中可培养耐药菌的污染水平 关键词 耐药菌 耐药基因 菜 壤 有机肥 中图分类号 S141 文献标志码 A 文章编号 1000 3924 2020 05 091 05 Influence of organic fertilizer application on the profiles of cultivable antibiotic resistant bacteria in lettuce and soil samples LI Huixian1 2 ZHAO Jing2 3 YAO Chunxia2 4 HUANG Liujuan2 FENG Bo2 WANG Hua5 6 WANG Weiguo7 SHAO Yi2 4 1 College of Food Science and Technology Shanghai Ocean University Shanghai 201306 China 2 Institute for Agri food Standards and Testing Technology Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai 201403 China 3 School of Geographic Sciences East China Normal University Shanghai 200241 China 4 Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology Shanghai 201403 China 5 Department of Food Science and Technology The Ohio State University Columbus 43210 USA 6 School of Life Sciences Fudan University Shanghai 200433 China 7 Shanghai Guorong Fruit Professional Cooperative Shanghai 201506 China Abstract In oSdeS to investigate the influence of application of oSganic feStilizeS on the pSofiles of tetSacycline TET doxycycline DOX sulfamethoxazole SUL cefotaxime CTX eSythSomycin ERM cipSofloxacin CIP and nalidixic acid NDA Sesistant bacteSia in lettuce and soil samples the pSevalence of Sesistant bacteSia and Selated genes weSe studied by potting expeSiment with methods of plate count and PolymeSase Chain Reaction PCR Sespectively The Sesults showed that the peScentages of seven antibiotic Sesistant bacteSia in lettuce samples of oSganic manuSe tSeated gSoup weSe higheS than that of contSol gSoup and the TETS and DOXS weSe not detected in 30 d lettuce samples Meanwhile the peScentages of TETS CIPS NDAS ERMS and SULS weSe obviously incSeased in soil samples afteS applying of oSganic manuSe MoSeoveS the pSevalence of antibiotic Sesistance genes in both of feStilized lettuce and soil samples weSe higheS than that of 李会贤 等 施用有机肥对 菜和 壤中可培养抗 素耐药菌的影响 untSeated gSoups Thus the contamination levels of ART commensal bacteSia in commeScial lettuce and soil samples would be incSeased by applying oSganic feStilizeS which was Sich in ART bacteSia Key words Antibiotic Sesistant bacteSia Antibiotic Sesistance genes Lettuce Soil OSganic feStilizeS 抗 素在养殖业中的过 应用易引发细菌产 耐药性 AR 会对环境和食品的安全造成严重影响 除了动物源性农产品 研究人员在蔬果产品中也发现了耐药菌 ART 1 2 但其污染来源尚不明确 栽培 要素中的 壤 3 4 灌溉水 5 粪肥 6 有机肥 7 甚至空气 8 中富含的ART菌和AR基因 都是蔬果表面 ART菌的潜在来源 此外 壤中的抗 素残留也有可能对蔬菜内 菌造成耐药压力 9 揭示种植过程 中各栽培要素及种植操作对蔬果产品 特别是对即食蔬果产品中ART菌的影响 是保证其微 物安全性 的基础 目前 有关农产品中ART菌的研究主要集中在致病菌的耐药性筛查和耐药机制等方面 10 11 但致病 菌仅占整 细菌 态系统中的很小一部分 且诸多证据表明 多种非致病菌均可成为AR基因的供体 受 体及中间体 对AR基因的水平迁移扩散具有重要作用 12 目前 已在蔬果中发现了大 的AR基因移动 原件 13 表明蔬果中AR基因水平迁移现象的存在 因此 亟需在整 细菌 态系统范围内展开研究 以 揭示不同栽培要素和操作对蔬果产品中的ART菌发 的影响 本研究通过盆栽试验 探究单次施用有机 肥对采摘期 菜及其栽培 壤中7类ART菌数 以及8种AR基因存在情况的影响 为揭示鲜食 菜表 面耐药菌的污染来源提供依据 1 材料与方法 1 1 材料与处理 1 1 1 生菜栽培 施肥处理及采样 菜栽培试验在上海普南园艺场进行 周边无大型养殖场 盆栽试验共设2 处理组 分别为未施 用有机肥组 CK 和施用有机肥组 OMT OSganic manuSe tSeated 在50 cm 长 20 cm 宽 20 cm 深 的塑料盆中装4 5盆 5 kg OMT组在 壤表面施加当地农资店购买的商品化鸡粪肥200 g 有机 肥与 壤的质 比为1 25 一次性施入并混匀 大小及叶片数 均一致的 菜苗于施肥当天移植入塑 料盆中 苗间距一致 每盆8棵 每组3盆 栽培期间用自来水作为灌溉水源 栽培0 d 30 d和45 d后从 每 盆中随机采集 净的 菜叶和根层 壤表层3 4 cm 壤样品 于冰盒中存放 并于当天运回实验 室进行耐药菌的分离 1 1 2 市售生菜及处理 市售 菜产品购自上海市大型菜场 采后于冰盒中存放 2 h内运回实验室 清洗10 min或浸泡 30 min后筛查耐药菌 1 2 仪器与试剂 1300 SERIES A2型 物安全柜 美国TheSmo FisheS Scientific公司 SX 500型高压灭菌锅 日本TOMY 公司 BAGMIXER400型匀浆机 法国InteSscience公司 MedcenteS EinSichtungen GmbH型恒温培养箱 德国 FSiocell公司 聚合酶链式反应 PCR 仪和核酸电泳系统 美国Bio Sad公司 全自动凝胶成像系统 上海复 日科技有限公司 抗 素粉末四环素 TetSacycline TET 强力霉素 Doxycycline DOX 磺胺甲恶唑 Sulfamethoxazole SUL 和三甲氧苄氨嘧啶 TSimethopSim TRI 头孢噻肟 Cefotaxime CTX 红霉素 ESythSomycin ERM 环丙沙星 CipSofloxacin CIP 萘啶酸 Nalidixic acid NDA 购自美国Sigma公司 放线菌酮 Cycloheximide CYC 购自美国AmSesco公司 脑心浸液肉汤 BSain heaSt infusion BHI 琼脂培养基购自英 国Oxoid公司 PCR试剂购自北京全式金 物技术有限公司 PCR引物 14 由 物 程 上海 股份有 限公司合成 1 3 方法 1 3 1 可培养耐药菌的筛查和计数 10 g 壤 菜或鸡粪肥样品分别与90 mL 0 9 的 理盐水装入无菌袋中 用匀浆机拍打10 min 29 上 海 农 业 学 报 10倍梯度依次稀释 每 浓度梯度分别取200 L悬浊液均匀涂布于含有16 g mL TET 16 g mL DOX 152 g mL SUL和8 g mL TRI 4 g mL CTX 100 g mL ERM 4 g mL CIP或8 g mL NDA的BHI培 养基平板上 15 每 培养基平板内均含有100 g mL CYC以抑制酵母菌和霉菌的 长 平板倒置于 30 培养箱中 培养48 h后进行可培养耐药菌的菌落 数 样品均质液梯度稀释后涂布于不含抗 素 仅含CYC的BHI平板中 30 培养48 h后进行可培养总菌的菌落 数 每 样品重复3次 1 3 2 耐药基因的筛查 根据菌落形态 在每 采样点随机挑取至少25株具有四环素耐药表型或磺胺耐药表型的细菌 用 PCR法筛查8 耐药基因tetA tetB tetC tetG tetL tetM sul1 sul2和一类整合酶基因intI 14 1 3 3 数据处理 菜 壤和有机肥中ART菌的 数结果及耐药菌占总菌的比例用 平均值 标准误差 表示 用 SPSS 16 0软件的单因素方差分析 one way ANOVA 方法比较处理组与对照组中耐药菌占总菌的百分比 的差异显著性 当P 0 05时 差异显著 2 结果与分析 2 1 市售生菜中可培养耐药菌的计数 市售 菜表面普遍存在耐药菌 除未发现强力霉素耐药菌 DOXS 外 对本研究涉及的几种抗 素耐 药的细菌均有不同程度检出 甚至在清洗10 min或浸泡30 min后的 菜中仍检出一定水平具有耐药表型 的细菌 表1 表1 市售生菜中可培养总菌和耐药菌数量 Table 1 Counts of cultivable total bacteria and ART bacteria in lettuce samples from markets 耐药菌可培养菌数 lg CFU g 1 菜1 菜2 菜3 菜4 菜 清洗 菜 浸泡 BHI 5 77 0 05 7 93 0 06 4 48 0 07 5 93 0 05 5 81 0 03 4 75 0 20 TETS 3 43 0 07 6 66 0 08 0 00 0 00 0 00 0 00 2 18 0 12 3 76 0 11 DOXS 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 SULS 5 74 0 07 7 88 0 07 3 48 0 08 4 19 0 06 4 68 0 08 4 74 0 03 CTXS 5 69 0 07 7 65 0 07 4 46 0 08 5 21 0 05 4 85 0 09 4 68 0 12 ERMS 5 72 0 08 4 52 0 08 3 64 0 04 4 13 0 07 3 86 0 09 3 66 0 03 CIPS 4 81 0 08 7 69 0 04 4 37 0 06 5 35 0 06 4 74 0 03 3 72 0 05 NDAS 5 67 0 04 7 56 0 01 4 41 0 08 5 62 0 08 5 14 0 05 4 52 0 09 2 2 有机肥 土壤与生菜苗中可培养耐药菌的本底水平 鸡粪肥中能检出7种耐药菌 其 数均高于106 CFU g 比 壤和 菜苗中可培养耐药菌的本底水平 高1 6 数 级 有机肥中除CTXS和SULS外 其余耐药菌占总菌比例均高于 壤 壤和 菜苗中 均未发现DOXS 壤中其他耐药菌的数 和占总菌的比例均高于 菜苗 且耐药菌的数 高于 菜苗 0 1 数 级 表2 比较有机肥 壤与 菜苗中耐药菌的本底水平 推测富含大 耐药菌的有机肥 通过直接接触这一途径将更多的耐药菌引入 壤环境 进而在栽培过程中污染 菜产品 表2 鸡粪肥 土壤和生菜苗中可培养耐药菌本底水平及占可培养总菌的比例 Table 2 Background levels and percentages of cultivable antibiotic resistant bacteria in chicken manure soil and lettuce samples 耐药菌有机肥数 lg CFU g 1 比例 壤数 lg CFU g 1 比例 菜数 lg CFU g 1 比例 BHI 9 43 0 03 100 00 0 00 6 99 0 07 100 00 0 00 6 81 0 05 100 00 0 00 TETS 9 10 0 10 47 35 12 52 4 17 0 11 0 15 0 04 2 74 0 06 0 01 0 00 DOXS 6 05 0 06 0 04 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 0 00 SULS 8 16 0 13 5 29 1 12 6 05 0 13 11 47 2 03 5 86 0 05 11 24 1 47 CTXS 7 48 0 04 1 12 0 06 6 32 0 17 21 62 7 45 5 38 0 16 3 77 1 59 ERMS 7 38 0 06 0 89 0 08 3 41 0 02 0 03 0 00 3 12 0 06 0 02 0 00 CIPS 8 22 0 10 6 20 1 77 5 53 0 18 3 40 0 93 4 72 0 09 0 82 0 22 NDAS 9 41 0 05 94 66 09 58 6 96 0 11 97 34 43 52 6 13 0 08 21 24 5 48 39 李会贤 等 施用有机肥对 菜和 壤中可培养抗 素耐药菌的影响 2 3 单次施用有机肥对生菜和土壤中可培养耐药菌数量的影响 菜栽培至第30天和第45天 其表面CTXS SULS NDAS CIPS ERMS 5类耐药菌占总菌的百分比均 显著高于未施肥组 达7 88 100 00 是对照组的1 15 10 43倍 TETS和DOXS仅在栽培45 d样品 中检出 其中TETS在对照组和处理组中分别占总菌的0 01 和2 47 DOXS仅在处理组中发现 占总菌 的2 35 图1 a 因此 不论是耐药菌的种类还是数 施肥组的 菜均高于对照组 说明单次施用 有机肥会提高 菜表面ART菌的污染水平 同时 比较未处理组采摘期与0 d 菜样品表面的ART菌 表2 发现除SULS TETS和DOXS外 其他4类ART菌占总菌的比例均显著升高 说明除了施肥处理外 还有其他因素会导致 菜表面ART菌的累积 栽培30 d和45 d时 施肥组 壤中可培养耐药菌占总菌的百分比较CK组有所增加 增加倍数因耐 药菌种类不同而不同 30 d时 TETS CIPS NDAS ERMS和SULS 5种耐药菌占总菌的百分比提高至对照组 的5 52倍 3 98倍 1 43倍 1 27倍 1 2倍 45 d时提高至对照组的513 74倍 15 63倍 2 35倍 22 21倍 2 15倍 30 d时 对照组和施肥组的CTXS占总菌的百分比并无差异 而到45 d时 施肥组中 CTXS的百分比略高于不施肥组 是其1 27倍 30 d时 两组 壤中均未检出DOXS 但在45 d施肥组中检 出 为1 66 102 CFU g 占总菌的0 48 图1 b K TX S 46L S TET S 0X S A S I1 S ER S B 0 T 100 80 60 40 20 0 时 间 d 占 30 45 30 45 30 45 30 45 30 45 30 45 30 45 K TX S 46L S TET S 0X S A S I1 S ER S C 0 T 100 80 60 40 20 0 时 间 d 占 30 45 30 45 30 45 30 45 30 45 30 45 30 45 图1 生菜 a 和土壤 b 中可培养耐药菌占总菌数的百分比 Fig 1 Percentage of cultivable resistant bacteria in total bacteria in lettuce a and soil b samples 0 d K 30 d K 45 d K 0 d 0 T 30 d 0 T 45 d 0 T 70 60 50 40 30 20 10 0 B intI tet average sul average 70 60 50 40 30 20 10 0 C intI tet average sul average 0 d K 30 d K 45 d K 0 d 0 T 30 d 0 T 45 d 0 T 图2 生菜 a 和土壤 b 中intI基因 tet基因和sul基因的检出率 Fig 2 Prevalence of intI tet and sul genes in lettuce a and soil b samples 2 4 单次施用有机肥对生菜和土壤中耐药基因的影响 为了在分子水平进一步确认单次施用有机肥对 菜表面和 壤细菌耐药性的影响 在随机选取的具 有耐药表型细菌菌落中筛查了6 tet基因 tetA tetB tetC tetG tetL和tetM 2 sul基因 sul1和sul2 和 指示基因水平迁移潜势的一类整合酶基因intI的存在情况 结果表明 有机肥处理组的采摘期 菜和 壤中3类基因的检出率均高于对照组 图2 表明单次施用有机肥可增加 菜及其栽培 壤中细菌的耐 药性和AR基因水平迁移的潜势 苗期 菜未发现3类耐药相关基因 可能与其四环素和磺胺耐药水平较 低 表2 获得的用于基因检测的菌落数 4 较少有关 壤菌落样品中未检出tetA 菜表面菌落样 品中未检出tetC和tetM 与已有报道 16 有所不同 可能与所施用的有机肥中AR基因组成不同有关 49 上 海 农 业 学 报 3 讨论与结论 已有研究证实 施用发酵有机肥会增加 壤中AR基因数 17 施肥可能是耐药微 物及AR基因进 入 壤环境的主要途径 18 本研究结果表明 处于采摘期的 菜 栽培30 d或45 d 表面存在大 ART 菌 且有机肥施用组的 壤和 菜中筛查到的ART菌种类和水平以及AR基因的检出率均高于对照组 说明单次施用有机肥不仅提高 壤耐药菌的污染水平 还会影响 菜表面耐药菌的数 和种类 带来环 境和食用方面的双重风险 因此应格外重视养殖场用药管理和粪便处理措施 以达到控制和减灭抗 素 耐药菌的目的 研究表明 耐药菌除了在抗 素筛选压下被诱导 选择性富集外 耐药基因还会通过水平基因迁移 HGT 途径进行传播和扩散 12 本研究在 菜和 壤样品中均发现了较高水平的intI基因 推测 菜表 面ART菌的富集过程中发 了HGT 但哪类细菌参与了HGT的发 相关AR基因是否有可能迁移至人 类共 菌中等问题值得深入研究 此外 菜 壤和有机肥中ART菌的同源性分析及AR基因和移动 元件的迁移潜势研究 有助于揭示有机肥施用对 菜AR菌污染影响的分子机制 参 考 文 献 1 LI X WANG H TetSacycline Sesistance associated with commensal bacteSia fSom SepSesentative Seady to consume deli and SestauSant foods J JouSnal of Food PSotection 2010 73 10 1841 1848 2 邵毅 沈源源 刘海燕 等 上海地产草莓中细菌污染的安全风险研究 J 上海农业学报 2017 33 4 117 120 3 FANG H WANG H CAI L et al PSevalence of antibiotic Sesistance genes and bacteSial pathogens in long teSm manuSed gSeenhouse soils as Sevealed by metagenomic suSvey J EnviSonmental Science Technology 2015 49 2 1094 1104 4 ZHAO X WANG J ZHU L et al Field based evidence foS enSichment of antibiotic Sesistance genes and mobile genetic elements in manuSe amended vegetable soils J Science of the Total EnviSonment 2019 654 3 906 913 5 BLAUSTEIN R SHELTON D VAN KESSEL J et al ISSigation wateSs and pipe based biofilms as souSces foS antibiotic Sesistant bacteSia J EnviSonmental MonitoSing and Assessment 2016 188 1 56 6 FALDYNOVA M V DENSK P HAVLICKOVA H et al PSevalence of antibiotic Sesistance genes in faecal samples fSom cattle pigs and poultSy J VeteSinaSni Medicina 2013 58 6 298 304 7 QIAN X SUN W GU J et al VaSiable effects of oxytetSacycline on antibiotic Sesistance gene abundance and the bacteSial community duSing aeSobic composting of cow manuSe J JouSnal of HazaSdous MateSials 2016 315 5 61 69 8 薛银刚 刘菲 王利平 等 气溶胶中抗 素抗性基因研究进展 以养殖场和医院为例 J 态毒理学报 2017 12 6 27 37 9 YANG Q REN S NIU T et al DistSibution of antibiotic Sesistant bacteSia in chicken manuSe and manuSe feStilized vegetables J EnviSonmental Science and Pollution ReseaSch 2014 21 2 1231 1241 10 MCEWEN S FEDORKA CRAY P AntimicSobial use and Sesistance in animals J Clinical Infectious Diseases 2002 34 Suppl 3 S93 S106 11 BLAIR J WEBBER M BAYLAY A et al MoleculaS mechanisms of antibiotic Sesistance J NatuSe Reviews MicSobiology 2015 13 1 42 51 12 JAYKUS L WANG H SCHLESINGER L FoodboSn MicSobes Shaping the Host Ecosystems M Washington DC USA ASM PSess 2009 13 DANIELA J D VERA M EUG NIA F et al ASchitectuSe of class 1 2 and 3 integSons fSom gSam negative bacteSia SecoveSed among fSuits and vegetables J FSontieSs in MicSobiology 2016 7 96 1400 14 李姝 邵毅 周昌艳 等 市售鸡肉及内脏中磺胺耐药菌污染特征 J 食品科学 2017 38 21 170 174 15 ZHANG L KINKELAAR D HUANG Y et al AcquiSed antibiotic Sesistance aSe we boSn with it J Applied and EnviSonmental MicSobiology 2011 77 20 7134 7141 16 李娟 魏源送 陈倩 北京地区畜禽养殖场周边蔬菜地 食蔬菜抗 素耐药基因 ARGs 的赋存特性 J 环境化学 2018 37 4 625 635 17 彭双 王一明 林先贵 连续施用发酵猪粪对 壤中四环素抗性基因数 的影响 J 中国环境科学 2015 35 4 1173 1180 18 JENSEN L B BALODA S BOYE M et a1 AntimicSobial Sesistance among Pseudomonas spp and the Bacillus cereus gSoup isolated fSom Danish agSicultuSal soil J EnviSonmental InteSnational 2001 26 7 8 581 587 责任编辑 郭娇 59