番茄颈腐根腐病抗性基因Frl的定位研究.pdf-

资源描述：

核农学报 2025 39 2 0244 0254 Journal of Nuclear Agricultural Sciences 番茄颈腐根腐病抗性基因 Frl 的定位研究叶青静王荣青姚祝平阮美颖周国治万红建李志邈程远浙江省农业科学院蔬菜研究所浙江杭州 310021 摘要番茄颈腐根腐病是近年来极具破坏性的番茄土传病害之一严重影响番茄的品质和产量为挖掘番茄颈腐根腐病抗性相关基因本研究利用全基因关联分析 GWAS 和遗传定位对番茄颈腐根腐病抗性基因进行研究首先对来自国内外的 200 份番茄材料进行全基因组关联分析在番茄 9 号染色体定位到抗颈腐根腐病的位点再利用抗病材料 KP13 及感病材料 T15196 的双亲群体进行连锁作图综合 GWAS 和连锁作图结果将 Frl 定位于标记 SSR105 和 FrlSNP20 之间遗传距离约为 0 8 cM 物理距离约为 93 kb 筛选出 4 个属于番茄谷胱甘肽硫转移酶 SlGST 家族成员的候选基因 Solyc09g011510 2 1 Solyc09g011580 2 1 Solyc09g011600 2 1 和 Solyc09g011630 2 1 获得 1 个与抗病性状紧密连锁的标记 FrlSNP25 利用该标记对 94 个番茄材料进行抗性鉴定样品基因型与颈腐根腐病抗性鉴定表型吻合率 92 55 本研究为番茄抗颈腐根腐病种质创新和揭示番茄抗颈腐根腐病抗性机理奠定了基础关键词番茄颈腐根腐病基因定位抗性鉴定 DOI 10 11869 j issn 1000 8551 2025 02 0244 近年来番茄 Solanum esculentum 种植面积和产量都有所增加 1 然而番茄病害的频繁发生影响了番茄的产量和品质番茄颈腐根腐病 Fusarium crown and root rot FCRR 是近年来给番茄生产带来严重危害和经济损失的一种土传病害 2 3 严重制约了番茄生产的发展 4 番茄颈腐根腐病在世界各地普遍发生 5 10 在我国浙江陕西山东海南等番茄主产区均有发生 11 16 因此挖掘番茄颈腐根腐病抗病相关基因和开发抗性相关分子标记可为番茄抗病遗传改良和对颈腐根腐病的防治提供理论基础为番茄抗病种质创新及分子育种提供重要技术支撑在番茄生产中具有重要的理论意义和应用价值截至目前相关领域学者对番茄颈腐根腐病已进行了大量研究番茄颈腐根腐病抗性由 9 号染色体上一个显性基因 Frl 控制 17 其抗源来自秘鲁番茄 Solanum peruvianum 1999 年 Fazio 等 18 开发了与 Frl 基因紧密连锁的分子标记 UBC 194 UBC 655 UBC 116 2011 年 Truong 等 19 将 UBC 116 转化为 SCAR 标记 2014 年 Staniaszek 等 20 开发了一个 CAPS 标记C2 25 其距离抗病基因3 cM 位于基因组5 89 Mb 位置定位于 9 号染色体的短臂上 2015 年 Mutlu 等 21 开发了 2 个 InDel 标记 SCAR 200 和 SCAR Frl 其中 SCAR Frl 位于基因组 61 78 Mb 位置定位于 9 号染色体的长臂上 2016 年 Kim 等 22 应用高分辨率熔解曲线分析技术筛选到 PNU T1212 和 PNU D4 标记其中 PNU D4 为共显性标记位于基因组 6 0 Mb 位置 PNU D4 和 SCAR Frl 在分离群体中不存在连锁关系 2018 年 Devran 等 23 利用第二代测序技术和集团混合分离分析法 BSA 筛选到与 Frl 位点紧密连锁共分离的标记并将 Frl 定位到标记 4206K 与 5108K 之间前人研究的试验材料遗传背景不同定位结果不完全吻合开发的抗颈腐根腐病分子标记数目比较有限在染色体上分布极不均匀基因定位区段覆盖着大量的基因目前抗番茄颈腐根腐病的关键基因尚未被分离与抗颈腐根腐病有关的候选基因有待进行深入解析鉴于此本研究利用全基因组关联分析连锁作图转录组分析等技术对番茄颈腐根腐病进行研究筛选出与颈腐根腐病抗性相关的候选基因旨在为番茄抗颈腐根腐病种质创新和揭示番茄抗颈腐根腐病抗性机理奠定基础文章编号 1000 8551 2025 02 0244 11 收稿日期 2024 04 22 接受日期 2024 08 01 基金项目浙江省科技特派员项目 2020R23A58D03 浙江省自然科学基金 LY19C150010 浙江省院地合作项目 2023R23T77C02 作者简介叶青静女副研究员主要从事番茄辣椒育种研究 E mail jingqingye2013 126 com 通讯作者程远男副研究员主要从事番茄辣椒育种研究 E mail chengyuan1005 126 com 2442 期番茄颈腐根腐病抗性基因 Frl 的定位研究 1 材料与方法 1 1 试验材料和作图群体创制全基因组关联分析 genome wide association study GWAS 材料为 200 份国内外番茄材料其中 125 份来自浙江省农业科学院 60 份来自美国国家植物种质体系 National Plant Germplasm System NPGS 12 份来自浙江大学园艺系 3 份来自美国番茄遗传中心 Tomato Genetics Resource Center TGRC 该套材料在 2017 2018 年于浙江省设施园艺工程技术研究中心共进行 3 次抗性表型鉴定作图群体通过 GWAS 分析方法获得番茄材料 KP13 含有目标抗性位点以其为父本以高感番茄材料 T15196 作为母本配制杂交组合得到 F 1 代 F 1 自交后得到 350 株 F 2 分离群体 F 2 抗病单株自交得到 257 个 F 2 3 家系对 F 2 3 家系和双亲进行接种鉴定 94 份抗性鉴定材料中 51 份来自浙江省农业科学院 23 份来自美国国家植物种质体系 10 份来自浙江大学园艺系 4 份来自美国番茄遗传中心 1 份来自厦门百利种苗有限公司 1 份来自日本金子种苗株式会社 1 份来自杭州三雄种苗有限公司 1 份来自荷兰瑞克斯旺种子种苗集团公司 1 份来自荷兰德澳特种业集团公司 1 份来自台湾农友种苗有限公司试验于浙江省设施园艺工程技术研究中心人工气候室中进行温度保持在 25 左右 1 2 番茄颈腐根腐病苗期抗性表型鉴定 1 2 1 孢子悬浮液配置将番茄颈腐根腐病病原菌 ZAAFORL8 登录号 MN708359 接种在马铃薯葡萄糖琼脂 potato dextrose agar PDA 培养基上 25 培养箱中活化 7 d 再将菌丝接入 PDA 液体培养基中 25 180 r min 1 条件下振荡培养 3 d 用灭菌枪头吸取 20 L 至血球计数板的中央平台观察孢子并计数配成浓度为 2 5 10 6 5 10 6 个孢子 mL 1 的悬浮液 1 2 2 浸根水培接种 T15196 KP13 T15196 KP13F 1 F 2 和 F 2 3 于 25 条件下催芽 48 h 种于 72 孔 54 cm 28 cm 4 5 cm 穴盘中待长出 1 2 片真叶选取均匀一致的幼苗接种将番茄幼苗从育苗穴盘中取出进行清洗冲洗然后将得到的自然伤根幼苗置于病原菌孢子悬浮液中每个接种鉴定的番茄材料设 3 个重复每个重复 5 株苗以没有病原菌的蒸馏水作对照浸根 3 4 h 然后移入清水中培养环境温度控制在 22 25 病原菌侵染约 7 d 后调查发病情况参照 Ye 等 24 的致病力分级方法进行分级调查计算病情指数 disease index DI 番茄种质材料按病情指数划分抗性评价标准高感 high susceptivity HS 70 DI 100 感病 susceptivity S 50 DI 70 中抗 moderately resistance MR 30 DI 50 抗病 resistance R 10 DI 30 高抗 high resistance HR 0 0 05 P 0 001 和 geno 0 1 对 SNPs 进行质控最终获得 1 401 073 个高质量 SNPs 使用全基因组复杂性状分析 genome wide complex trait analysis GCTA v1 92 2 软件进行全基因组关联分析采用 R 语言 v4 1 2 中 qqman 包绘制 QQ 图和 CMplot 包绘制曼哈顿图使用 PLINK v1 9 软件计算目标性状与 SNP 位点关联的可信值 1 4 遗传连锁图谱构建及基因定位通过卡方 2 分析各群体的分离比例测验其适合性根据 T15196 KP13 的 F 2 3 家系对番茄颈腐根腐病的抗性鉴定结果选取 30 个纯合感病单株和 30 个纯合抗病单株构建抗感池将双亲与抗感池送到北京诺禾公司进行基因组重测序对测序得到的质控数据用 GATK v4 4 0 0 Samtools v0 1 19 bcftools v1 13 等软件进行过滤和比对挖掘变异 SNP 同时基于测序数据开发 SNP 插入缺失 insertion and deletion InDel 酶切扩增多态性序列 cleaved amplified polymorphic sequence CAPS 简单重复序列 simple sequence repeat SSR 等标记利用 R 语言中 ASMap 包进行分子标记与番茄颈腐根腐病表型之间的连锁分析然后利用 LinkageMapView 包绘制连锁图谱 1 5 候选基因的预测筛选及表达分析在鉴定出与 Frl 基因密切相关的多态性标记后基于连锁标记的物理距离从 SGN http solgenomics net phytozome https phytozome next jgi doe gov 及 NCBI https www ncbi nlm nih gov 数据库网站上获得目标区间内的基因和其功能注释根据定位区间和番茄参考基因组 GCF 000188115 4 信息筛选与番茄抗颈腐根腐病相关的候选基因为了再次验证候选基因对 KP13 和 T15196 根系进行病原菌 ZAAFORL8 接种测定接种 3 24 48 和 72 h 后基因的差异表达实时荧光定量 PCR quantitative real 245核农学报 39 卷 time PCR qRT PCR 扩增以 tubulin 为内参表 2 反应体系和程序参照文献 13 以 2 CT 法计算基因的相对表达差异 2 结果与分析 2 1 番茄颈腐根腐病抗性全基因组关联分析通过对 200 份番茄材料进行主成分分析发现在感病资源和抗病资源之间出现分层图 1 A 为鉴定番茄对颈腐根腐病的抗性位点对 200 份番茄材料颈腐根腐病抗性表型数据与重测序获得的 SNP 位点进行关联分析结果发现显著性 SNP 位点多数集中在 9 号染色体 4 278 877 到 7 066 492 bp 之间约 2 79 Mb 参考基因组 GCF 000188115 4 图 1 C 和 D QQ 曲线上翘表明 GWAS 结果较好图 1 B 由此推测该区间为 Frl 的重要目标区间 2 2 T15196 KP13 的群体抗病遗传分析为了进一步精细定位抗病位点对番茄 T15196 KP13 的 F 2 群体 F 2 3 家系及亲本进行抗性表型分析本研究于 2018 年将 T15196 与 KP13 杂交收获 F 1 代 2019 年种植 350 株 F 2 代单株和 F 2 3 家系并对其进行苗期浸根水培接种鉴定结果表明 KP13 表现为抗病图 2 A 感病亲本 T15196 表现为高感图 2 B 在调查的350 株T15196 KP13 F 2 单株中 257 株表现为抗病 93 株表现为感病表 1 经 2 检验符合 3 1 的期望比 2 0 461 2 0 05 1 3 84 F 2 3 家系中有 93 个纯合感病 178 个抗感分离及 79 个纯合抗病其抗性分离比例符合 1 2 1 的期望比 2 1 223 2 0 05 2 5 99 表 1 以上结果表明番茄颈腐根腐病抗性由显性单基因控制 2 3 BSA 与基因定位 BSA 结果表明在抗感池之间差异 SNP 位点共有 213 254 个其中 147 186 个分布在 9 号染色体且大部分聚集在 4 2 7 0 Mb 区间内 T15196 和 KP13 间的差异 SNPs 与抗感池差异 SNPs 在 9 号染色体上重叠率最高为了定位目标基因在 4 2 7 0 Mb 区间内设计开发 268 对 CAPS SNP InDel 及 SSR 等引物其中 36 个在小群体亲本和抗感池中具有多态性的标记引物对 F 2 群体进行基因分型根据表型统计数据和基因型对 F 2 群体进行连锁分析使用 ASMap 计算出各标记与目的基因的距离并使用 LinkageMapView 进行遗传连锁图注 A 200 份番茄主成分分析 B 番茄颈腐根腐病抗性性状 GWAS QQ 图 C 颈腐根腐病抗性性状 GWAS 曼哈顿图利用 200 份番茄材料进行颈腐根腐病表型全基因组关联分析 D 9 号染色体 SNP 关联的曼哈顿图 Note A Principal component analysis of 200 tomato lines B QQ plot of GWAS for resistance to Fusarium crown and root rot C Manhattan plot of GWAS for displaying SNPs related to resistance to Fusarium crown and root rot D Local Manhattan plot of SNPs associated with Fusarium crown and root rot resistance on chromosome 9 图 1 200 份番茄材料 PCA 及 GWAS 分析 Fig 1 PCA and GWAS analysis of Fusarium crown and root rot responses using 200 tomato lines 2462 期番茄颈腐根腐病抗性基因 Frl 的定位研究谱的构建最终将 Frl 基因定位在 FrlSNP20 和 SSR105 间隔 0 8 cM 区间上图 3 B 对应物理区间为 4 81 4 90 Mb 物理距离约为 93 kb 图 3 C 遗传定位锁定的目标基因区间在全基因组关联分析范围内本研究用于 Frl 定位的部分引物如表 2 所示 2 4 候选基因生物信息分析及 qRT PCR 分析依据SNG 和phytozome 对定位区间17 个基因的注释选取 Solyc09g011510 2 1 SlGSTU31 Solyc09g011520 2 1 SlGSTU32 Solyc09g011540 2 1 SlGSTU34 Solyc09g011550 2 1 SlGSTU35 Solyc09g011580 2 1 SlGSTU38 Solyc09g011600 2 1 SlGSTU40 Solyc09g011610 2 1 SlGSTU41 Solyc09g011620 2 1 SlGSTU42 和 Solyc09g011630 2 1 SlGSTU43 基因进行 qRT PCR 验证图 4 引物见表 2 对这 9 个基因在感病材料 KP13 和抗病材料 T15196 接种病原菌 3 24 48 和 72 h 后分别进行 qRT PCR 分析发现在抗性番茄和感病番茄材料中 SlGSTU32 SlGSTU34 SlGSTU35 SlGSTU41 和SlGSTU42 表达量没有显著变化而SlGSTU31 SlGSTU38 SlGSTU40 和 SlGSTU43 在 KP13 接种 FORL 后短时间 3 24 h 内根系中基因表达量显著或极显著升高 2 5 番茄颈腐根腐病抗性基因连锁标记开发为了开发用于辅助育种的分子标记在抗感池和亲本重测序数据中查找 93 kb 区间内与颈腐根腐病抗性连锁的变异位点在番茄 9 号染色体第 4 836 403 位点处 SNP Solanum lycopersicum cultivar Heinz 1706 chromosome 9 SL3 0 与抗性基因 Frl 高度连锁该多态性位点为 T C 由此位点设计 KASP 标记 FrlSNP25 表 2 该标记对 94 份待测番茄材料进行基因分型结果表明位于 Y 轴附近的蓝色信号点是 FrlSNP25 扩增的抗病基因型 C C 图 5 94 个样品中 78332A 0 基因分型检测无信号 Aihao PI 112215 PI 126932 T12 031A T19 042 0 1 T9022 基因分型和人工接种检测结果不一致其余 87 样品的基因型和抗病表现对应关系良好表 3 即 FrlSNP25 扩增为 T C 或 C 的基因型均为 MR 或 R 抗病表型番茄样品的基因型和颈腐根腐病抗性鉴定表型吻合率 92 55 注 A KP13 R B T15196 S C F 2 分离群体 Note A KP13 R B T15196 S C F 2 population 图 2 番茄苗期浸根水培接种鉴定 Fig 2 The hydroponic culture methods after root soaking treatment at the tomato seedling stage 表 1 番茄 T15196 KP13 群体对番茄颈腐根腐病病菌的反应 Table 1 Response of F 2 and F 2 3 populations of T15196 KP13 to Fusarium oxysporum f sp radicis lycopersici 亲本与群体 Parents and populations T15196 KP13 F 2 F 2 3 株数 No of plants 抗 Resistance 0 45 257 79 抗感分离 Segregate 178 感 Susceptible 45 0 93 93 理论比率 Theoretical ratio 1 3 1 2 1 卡方值 2 value 0 461 1 223 注 Note x 2 0 05 1 3 84 x 2 0 05 2 5 99 247核农学报 39 卷 3 讨论本研究根据 GWAS 和遗传定位的整合结果把 Frl 定位在番茄 9 号染色体 4 81 4 90 Mb 的 0 09 Mb 区间针对区间内差异 SNP 开发了 KASP 标记 FrlSNP25 为进一步进行分子标记辅助育种提供了标记资源定位区间包含 17 个谷胱甘肽硫转移酶基因 SlGST 这与 Devran 等 23 定位区间内的谷胱甘肽硫转移酶相关基因部分重叠通过 SNG 和 phytozome 对 17 个基因的注释选取 9 个基因进行抗性测试其中 SlGSTU31 SlGSTU38 SlGSTU40 和 SlGSTU43 基因对颈腐根腐病菌响应的表达量在抗性番茄材料中被诱导上调而在感病番茄材料中没有显著变化该结果表明谷胱甘肽硫转移酶基因 SlGST 参与了调控番茄颈腐根腐病的抗性反应由上述结果推测 SlGSTU31 SlGSTU38 SlGSTU40 和 SlGSTU43 为候选基因为进一步克隆并验证其功能及抗颈腐根腐病分子机制的解析奠定了基础谷胱甘肽转移酶 GSTs 是最通用的多基因酶超家族之一 25 在各种生物体内普遍存在植物谷胱甘肽硫转移酶是 20 世纪 70 年代在玉米中被首次发现目注 A 9 号染色体上 Frl 定位区间 B Frl 基因及其标记遗传连锁图谱 C 定位区间的物理图谱 Note A The mapping region of Frl gene on chromosome 9 B Genetic linkage map of Frl gene and linked markers C Physical map of the mapping region 图 3 番茄 9 号染色体上 Frl 的遗传连锁图谱及候选基因 Fig 3 Genetic linkage map and candidate genes of Frl on tomato chromosome 9 2482 期番茄颈腐根腐病抗性基因 Frl 的定位研究前已从小麦水稻玉米番茄等多种植物得到克隆和鉴定 26 番茄全基因组中存在 90 多个谷胱甘肽硫转移酶基因是迄今为止报道的最大谷胱甘肽硫转移酶基因家族与其他植物相比番茄 GST 家族可以划分为 10 个系统发育保守的分类分别为 lambda tau theta zeta DHAR phi TCHQD EF1B GHR 和 MGST 其中 lambda 和 tau 是番茄的主要类别通常 tau 和 phi 类在其他植物中更为突出但 lambda 类在番茄 GST 家族中为例外 27 番茄谷胱甘肽硫转移酶基因在染色体上分布不均匀其中 9 号染色体的基因数量最多 27 谷胱甘肽硫转移酶参与植物对非生物和生物胁迫的响应氧化胁迫下番茄 SlDHAR1 基因在茎和花中表达表 2 用于 Frl 定位的部分引物和番茄颈腐根腐病抗性相关基因表达分析引物 Table 2 Partial primers for Frl mapping and expression analysis primers of Fusarium crown and root rot related genes in tomato 标记名称 Marker name FrlSNP20 FrlSNP22 FrlSNP25 FrlSNP30 FrlSNP31 FrlCAPS22 SSR105 SlGSTU31 SlGSTU32 SlGSTU34 SlGSTU35 SlGSTU38 SlGSTU40 SlGSTU41 SlGSTU42 SlGSTU43 tubulin 引物名称 Primer name Frl SNP20 FAM f Frl SNP20 HEX h Frl SNP20 c Frl SNP22 FAM f Frl SNP22 HEX h Frl SNP22 c Frl SNP25 FAM f Frl SNP25 HEX h Frl SNP25 c Frl SNP30 FAM f Frl SNP30 HEX h Frl SNP30 c Frl SNP31 FAM f Frl SNP31 HEX h Frl SNP31 c FrlCAPS22F FrlCAPS22R SSR105F SSR105R FrlqRT 36F FrlqRT 36R FrlqRT 38F FrlqRT 38R FrlqRT 40F FrlqRT 40R FrlqRT 41F FrlqRT 41R FrlqRT 44F FrlqRT 44R FrlqRT 47F FrlqRT 47R FrlqRT 46F FrlqRT 46R FrlqRT 48F FrlqRT 48R FrlqRT 49F FrlqRT 49R ActinNC2F ActinNC2R 序列 5 3 Sequence 5 3 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTAAAGGGTAAAAAGTTCTTTGTG GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTAAAGGGTAAAAAGTTCTTTGTT TTCGCAGCCATATCAGCATATC GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCTCTTTACTTCTTGAATCGAAT GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTCTTTACTTCTTGAATCGAAC TCATTGTGAATGAGCACTGGGA GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACCATAGACTCACAAATGGACTTT GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACCATAGACTCACAAATGGACTTC TTCTTGAATCGAATCCCGTCCT GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTAGAGCCCATTCAACTCTTC GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGAGCCCATTCAACTCTTT TAAGTTGAAAGATGGCTGATGTT GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTCATAAGCTTCCTCTTTAGCTC GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTCATAAGCTTCCTCTTTAGCTT TGTTGTCCAGATGCCACCAGTAGGGA ATGGAAAGTCCATTTGTGAGTCT ACGAGGTTGGAAATGGATAAGCA CTTGCCCATTTCCAAGCTCG TGCTTTTATACTCCACCCAACAG GCCCATTTGTGATTCTATGGTC CCTAAGAATGCATTTACCACCG GCTCAAGGACAAGAAGTTGTTT TTCAGATGCTTCTTCGAAAACG TATAGTCGTCGAGTTGAATGGG TTTTCTTAAGGACGGGATTCGA TTGAAGGTCCTTCCATCTTACC GATGACCCCTTTTCGTCAAAAA CGAAGATAAGTGGCCATCAATG GGAATTTTTCACTTGTCACCGA GATTGGAGAGACGAATATTGTACG GTAAACTTGATAATGGGCAAGC TGATAAGACATTTGAAGGCCCT CCTACTGGTGGCATCTTATCAT GCTTTAGCTCGTTTTTGGGTTA CTCCAGAGGCTTCTTCAAAAAC CCGCCAAGAGATGAAATACTTG CCCACATGCACTCATAAACAAA TGGTCGGAATGGGACAGAAG CTCAGTCAGGAGAACAGGGT 位点 Allele G T T C T C C T C T 注 FAM 与 HEX 是荧光接头 F 正向引物 R 反向引物 Note FAM and HEX are the fluorescent connectors F Forward primer R Reverse primer 249核农学报 39 卷占优势在叶片中表达中等而 SlDHAR2 基因在茎叶和花中的表达被强烈诱导幼叶中的表达量最高可知 SlDHAR 基因在多种应激反应中发挥作用 28 盐胁迫下番茄叶片中 tau 类 GST SlGSTU23 SlGSTU26 表达上调根中 lambda 类 thet 类脱氢抗坏血酸还原酶类和 zeta 类 GST SlGSTL3 SlGSTT2 SlDHAR5 和 SlGSTZ2 表达上调高浓度SA 诱导下SlGSTL3 SlGSTT2 SlGSTT4 SlGSTZ2 SlGSTU19 和 SlGSTU20 在根系中的表达量增加 29 Lambda theta

展开阅读全文