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书北方园艺（）： 研究论文第一作者简介：王书珍（），女，博士，副教授，现主要从事植物遗传学等研究工作。： 责任作者：汪爱华（），女，博士，高级农艺师，现主要从事叶类蔬菜品种筛选和种质改良等研究工作。：基金项目：湖北省自然科学基金资助项目（）；国家大宗蔬菜产业技术体系试验站资助项目（）；大别山特色资源开发湖北省协同创新中心团队资助项目（）。收稿日期：生菜资源表型性状变异及其与标记的关联分析王 书 珍，王 斌 才，黄 兴 学，李 志 良，周 国 林，汪 爱 华（经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，黄冈师范学院 生命科学学院，湖北 黄冈；武汉市农业科学技术研究院 蔬菜科学研究所，湖北 武汉）摘要：从世界范围内搜集的多份生菜资源中筛选份优质资源作为研究对象，调查个表型性状变异，并进行分子标记分析，探究表型性状与标记之间的相关关系，以期为生菜分子标记辅助育种提供参考依据。结果表明：调查的份资源表型性状均存在极显著差异，平均变异系数最大的为株幅（）。个表型性状将份生菜资源分成两大类，份资源的遗传距离变化范围为。个多态性标记在份生菜资源中扩增的条带数为，和的平均值分别为和，值变化范围为。同样，个标记将份资源分成两大类，份资源间的遗传距离为，表型性状聚类结果与标记聚类结果不相关。以单一性状聚类结果与标记聚类结果进行相关性分析，大部分标记均与表型性状有相关性，且大部分引物组合表现为累积效应。关键词：生菜；表型性状；标记；关联分析；种质改良中图分类号： 文献标识码： 文章编号：（）生菜（ ）属菊科莴苣属一二年生草本，别名叶用莴苣，包括散叶生菜、半结球生菜、结球生菜等，是世界范围内广泛种植食用的低糖、低脂类蔬菜。生菜营养价值极高，富含多种维生素、矿物质、有机酸、核黄素等活性成分，以及具有减肥功效的膳食纤维，能够分解食物中亚硝胺等致癌物质而被誉为“抗癌蔬菜”。随着对生菜保健功能认识的深入，人们对其品质的要求逐渐提高，尤其是表型性状。表型性状多为数量性状且受多基因互作影响，且形态学特征与分子标记具有紧密联系。（ ）是从功能基因内开发的标记，具有重复性强、共显性等特点，能够缩小目标性状相关联的分子标记的筛选范围，在动植物的遗传多样性检测、和目标基因定位、遗传连锁图的构建、杂种优势的预测、分子标记辅助育种（ ，）等领域作用重大。该研究以份生菜资源为研究对象，将叶形、株型等数据与分子标记进行关联分析，以期筛选与表型性状紧密关联的标记位点，为相关基因的克隆和分析做铺垫，也为生菜的种质改良提供参考依据。 材料与方法 试验材料武汉市蔬菜科学技术研究所年开始从世界各地引入份生菜资源，在前期温室栽培及田间试验的研究基础上，将形态及培育周期差异明显的份资源作为研究对象。在试验基地（东经，北纬）种植两季，定植株行距为，每个品种种植株，常规日常管理。年秋季，每个品种随机选株健康叶片，放入硅胶中干燥，自封袋封存后于保存并用于标记分析。 试验方法 表型形状的调查份生菜资源（标号），除去病害植株，选取长势一致的植株，每个品种选取株，连续个种植期田间观察叶色、叶型、叶形、叶缘、叶边、结球与否、株型、长势。测量株高、株幅，统计叶片数，测定最大叶面积，每份资源统计个个体的平均值。 基因组提取及扩增采用改良的法提取生菜基因组，琼脂糖凝胶电泳检测完整度，经紫外分光光度计测定的浓度，并将浓度稀释至，于保存备用。引物是前期基于数据库登陆的生菜序列设计合成的，挑选其中对进行扩增，经凝胶电泳分析后，最终筛选出对多态性高、谱带清晰、重复性好的引物进行试验（表）。采用的反应体系进行扩增，体系含的 ，基因组，正反向引物，灭菌去离子水补足剩余体积。扩增程序为预变性，个扩增循环（变性，最适退火温度下退火，延伸），最后增加一个的延伸阶段。扩增产物采用的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，统计不同个体的基因型。表多态性引物信息 位点正向引物（） （）反向引物（） （）退火温度（）重复基序 等位基因观察杂合度期望杂合度多态性信息含量 （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） 平均值 标准差 标记与品质性状的关联分析对个表型性状进行方差分析和聚类分析，计算各性状的平均值、变异系数及重复力（）。根据电泳图谱条带的有无建立“”二元矩阵：有带为，无带为。采用并用软件计算遗传多样性和连锁不平衡。利用 软件北方园艺月（上）计算每个标记的多态性信息含量。采用软件计算距离系数，聚类分析并建立聚类树状图。根据遗传距离矩阵分析标记位点与形态性状的相关性。 结果与分析 生菜表型性状变异分析和聚类分析方差分析表明，个表型性状在份生菜资源间差异达到极显著水平，表明生菜表型变异大，遗传多样性丰富。株高、株幅、叶片数、最大叶等个表型性状的变异系数（）在，变异最大的为株幅，最小的为叶片数。这个性状的重复力（）均比较高，变化范围为，其中重复力最低的是叶片数，最高的是株幅（表）。表各品种间表型性状变异 编号表型性状平均值 最大值 最小值 标准差 变异系数（） 重复力 株高 株幅 叶片数 最大叶面积 叶色多为深绿、绿色、浅绿，其次还有翠绿、暗绿、绿白、深紫红色；叶型多为扇形、长圆形、近圆形，其次为圆形、长扇形、狼耳尖形叶；叶形多为皱缩、微皱、较光滑、特皱缩，其次还有近全缘、近光滑、较皱缩。份生菜资源的叶缘为全缘，其余份为近全缘。份为半结球资源，份不结球，份为结球。叶边有折叠、波浪折叠、稀锯齿波浪、稀波浪、密尖刺波浪折叠、微波浪、锯齿波浪、尖刺状、钝齿状、钝尖状波浪折叠等类型。株型份为散状，份为紧凑型，份为较紧凑型。份资源长势中等，份长势旺盛，份特旺盛，份长势较弱。图个表型性状聚类结果 份生菜资源被分为两大类，、等份生菜被分到第一类中，第二大类仅仅包括、等份资源（图）。在相关系数为处，第一类的份资源被分为类，分别包 第期北方园艺括份和份资源。表型性状相似的资源被聚到一起，聚类结果与地理起源并不完全一致。 引物多态性分析在所设计合成的个标记中，个标记是多态性的，扩增条带数为，平均每个位点为（表）。引物和扩增的等位基因最多，均为个等位基因。、标记扩增的等位基因最少，仅为个。观察杂合度（）和期望杂合度（）的变化范围分别为和，平均值分别为和。多态性信息含量值变化范围为，平均为，值最高的是位点，最低的是位点。个标记将份资源分成两大类，第一大类仅包括和等份资源，其余的份被聚成第二大类。在相关系数处，第二大类又被分为类，分别包括份和份生菜资源（图）。图生菜资源标记的聚类结果 表型性状与标记关联分析将表型性状的距离矩阵与分子标记聚类的距离矩阵进行相关性分析，得到拟合方程 ，二者的相关系数为 ，即相关性不显著，个微卫星位点反映的差异与各材料的表型性状无相关性。将每个表型性状进行聚类，每对引物也进行单独聚类，再将每个表型性状距离矩阵与每对引物聚类的距离矩阵进行相关性分析。在进行的个两两相关分析中，各表型性状与引物达到极显著相关（）水平的引物数在对，相关系数范围为。标记与叶色的相关系数最大，达到。与叶形和株高性状达到显著相关水平的引物最多，均为对，分别是、和、（表）。仅发现个标记分别与叶色（）、结球（）、叶片数（）等表型性状显著相关。引物与叶型、叶形、叶缘、叶边、结球等个表型性状相关，同样引物也与叶缘、叶边、株型、株幅、最大叶面积等个性状相关联。然而，、等个引物与个表型性状均无相关性。 讨论与结论连锁不平衡（ ，）是不同基因座位上等位基因的非随机组合，关联分析以连锁不平衡为基础，无须构建作图群体，鉴定群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法。关联分析已经广泛用于水稻、玉米、大北方园艺月（上）表单一叶形性状与各引物的相关性分析 表型性状相关的引物 相关引物数 单个引物最大相关系数 叶色 叶型 、 叶形 、 叶缘 、 叶边、 结球 株型 、 长势、 株高 、 株幅 、 叶片数 最大叶面积 、 麦、鸭、猪等经济物种性状基因的定位研究。例如，赖勇等采用连锁不平衡分析在大麦中找到了与株高、穗长、芒长、穗粒数等表型性状紧密联系的位点。然而，对于生菜品质性状与分子标记的关联分析尚鲜见报道。植物数量形状受环境影响较大，表型性状难以准确测量其遗传变异。根据叶色、叶型、叶形、叶缘、叶边、结球与否、株型、长势、株高、株幅、叶片数、最大叶面积的分类，从生菜种质库中抽取表型性状差异显著的份生菜资源作为参考材料，种植在环境条件一致的苗圃地，且采用完全随机区组设计，最大程度地消除了环境因素造成的个体表型差异。所选生菜资源的表型性状存在丰富的遗传多样性，其中株高、株幅、叶片数、最大叶面积等个表型性状的变异系数为，且各性状在不同功能材料间存在极显著差异，个性状的重复力（）均大于，即此个性状中遗传因素占主导地位。个位点的等位基因数平均为，值变化范围较大（），即所检测的生菜资源遗传变异比较丰富。刘超采用个标记与个表型性状的关联研究中，相关系数达到 ，即极显著相关性。该研究中，叶形和株高个性状均与点紧密关联，且表现为累积效应，表明该性状受多基因共同作用。叶色性状与标记的相关系数达到，因此开发更多的额标记进行范围的基因组扫描和表型性状关联分析仍需进行。该研究对于生菜表型性状目的基因的克隆，以及生菜种质资源的育种和品质性状改良意义重大。然而，关联位点与性状间关系及作用机理和方式尚不清楚，需后续的深入研究。参考文献 ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：左力辉，张文林，邱彤，等新疆野苹果叶形性状变异及其与标记关联分析园艺学报，（）： ， ， ， ，： ， ， ， （ ） ，（）： ， ， ， （ ） ，（）： ， ， ， 第期北方园艺（） ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ： ，： ， ， ， ，（）：方梅霞，李莹，徐海平，等及其受体基因多态性与鸭生长及屠体性状的关联性畜牧兽医学报，（）：覃立立，蔡更元，张豪，等猪骨和皮脂性状相关的筛查与关联分析中国农业科学，（）： 赖勇，王鹏喜，范贵强，等大麦标记遗传多样性及其与农艺性状关联分析中国农业科学，（）：刘超籽用南瓜种质资源遗传多样性研究哈尔滨：东北农业大学， ， ， ， ， ， （ ， ， ； ， ， ）： ， ， ， （） ， ， ， ， ， ， ， ： ； ； ； 北方园艺月（上）
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