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南 京 农 业 大 学 学 报 ，(): :/. :./. 收 稿 日 期: 基 金 项 目: 江 苏 省 农 业 科 技 自 主 创 新 项 目()； 江 苏 省 科 技 支 撑 计 划 项 目() 作 者 简 介: 董 慧 杰， 硕 士 研 究 生。 通 信 作 者: 胡 春 梅， 副 教 授， 研 究 方 向 为 蔬 菜 分 子 生 物 学 与 遗 传 育 种，-:.。 董慧杰， 侯喜 林， 韩 克， 等. 不结球白 菜花青苷合 成负调控基 因 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源- 的 响 应. 南 京 农 业 大 学 学 报， ，():. 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 负 调 控 基 因 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源- 的 响 应 董 慧 杰， 侯 喜 林， 韩 克， 张 志 硕， 胡 春 梅 ( 南 京 农 业 大 学 园 艺 学 院/ 作 物 遗 传 与 种 质 创 新 国 家 重 点 实 验 室， 江 苏 南 京) 摘 要: 目 的 本 文 旨 在 探 究 基 因 在 不 结 球 白 菜 紫 色 和 绿 色 材 料 中 的 特 性 及 其 对 外 源- 的 响 应， 为 花 青 苷 调 控 机 制 奠 定 理 论 基 础。 方 法 以 不 结 球 白 菜 紫 色 自 交 系- 及 其 绿 色 突 变 体- 为 材 料， 同 源 克 隆 基 因 的 全 长， 应 用 生 物 信 息 学 方 法 分 析 其 核 酸 和 蛋 白 序 列 及 其 进 化 关 系， 并 在 线 预 测 蛋 白 质 二 级 和 三 级 结 构。 采 用 外 源- 处 理 后 测 定 叶 片 中 花 青 苷 含 量， 并 通 过 实 时 荧 光 定 量 技 术 测 定 了 基 因 在 外 源- 处 理 后 的 表 达 水 平。 结 果 在 个 不 同 材 料 中 克 隆 获 得 的 基 因 完 全 相 同， 序 列 长 为， 包 含 编 码 区( 长 为) 及 非 编 码 区( 长 为)。 其 编 码 区 序 列 含 有 个 长 为 的 开 放 阅 读 框()， 编 码 个 氨 基 酸， 将 该 基 因 命 名 为。 亚 细 胞 定 位 预 测 该 蛋 白 分 布 在 细 胞 核 中， 蛋 白 相 对 分 子 质 量 为. ， 等 电 点 为.。 进 化 树 分 析 表 明， 蛋 白 序 列 与 大 白 菜 相 似 性 为， 其 次 与 油 菜 和 甘 蓝 关 系 最 近， 相 似 性 分 别 为 和。 外 源- 处 理 以 后 紫 色 材 料 - 叶 片 中 花 青 苷 含 量 均 高 于 对 照， 而 绿 色 突 变 体 叶 片 基 本 不 含 花 青 苷； 基 因 在 个 材 料 中 具 有 相 似 的 表 达 模 式， 即 先 下 降 后 上 升 而 后 又 下 降， 其 中 在 处 理 后 时 基 因 表 达 量 急 剧 增 加， 在 紫 色 和 绿 色 材 料 中 增 量 分 别 为 . 和.。 此 外， 表 达 量 在 绿 色 材 料 中 明 显 高 于 紫 色 材 料。 结 论 不 结 球 白 菜 中 花 青 苷 负 调 控 基 因 既响应 外 源-， 又 与 叶 片 中 花 青 苷 的 积累 密 切相 关， 在 花青苷 的生物 合成 过程中 起着 重要的 调控 作 用。 关 键 词: 不 结 球 白 菜； 同 源 克 隆； 序 列 分 析； 基 因 表 达 中 图 分 类 号:. 文 献 标 志 码: 文 章 编 号:() - - ， (/， ，) :- ，.， -，- -.， .-， -. ，-，() ().() ，. . .， ，. -，- ，-.， -，. 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 ，. . ， .，-. - -，. :-；-； 不 结 球 白 菜(.) 是 一 类 十 字 花 科 蔬 菜， 其 营 养 丰 富， 深 受 人 们 喜 爱。 紫 色 不 结 球 白 菜 是 近 年 来 培 育 的 新 品 种， 叶 片 呈 紫 色， 富 含 花 青 苷。 花 青 苷 是 一 种 水 溶 性 色 素， 广 泛 存 在 于 植 物 液 泡 中， 使 植 物 呈 现 出 不 同 的 色 彩， 且 具 有 协 助 植 物 抵 抗 生 物 胁 迫 和 非 生 物 胁 迫 的 作 用 。 花 青 苷 不 仅 对 植 物 本 身 有 重 要 的 作 用， 对 人 类 健 康 也 有 非 常 重 要 的 医 疗 保 健 功 能， 具 有 抗 氧 化 和 抗 癌 作 用 。 花 青 苷 生 物 合 成 的 调 控 主 要 是 通 过 转 录 因 子 对 结 构 基 因 转 录 水 平 的 调 节 来 完 成 的。 其 中 正 调 控 基 因 主 要 包 括-(-)、(-) 和 类 转 录 因 子， 以 三 元 转 录 调 控 复 合 体() 激 活 结 构 基 因 来 促 进 花 青 苷 的 生 物 合 成 。 负 调 节 基 因 主 要 有 两 类: 一 类 是 转 录 因 子- ， 另 一 类 是 受 氮 或 硝 酸 盐 诱 导 的( ) 转 录 因 子 家 族， 包 括、 和 基 因 。 目 前， 对 花 青 苷 合 成 调 控 因 子 的 研 究 大 多 集 中 在 正 调 控 因 子-、 和 类 转 录 因 子 上， 对 负 调 控 基 因 特 别 是 基 因 的 研 究 较 少。 本 试 验 以 紫 色 叶 自 交 系- 及 其 绿 色 突 变 株 系- 为 材 料， 利 用 同 源 克 隆 的 方 法 分 离 得 到 基 因 的。 运 用 生 物 信 息 学 分 析 基 因 序 列， 比 较 在 种 不 同 材 料 中 的 相 对 表 达 量 以 及 外 源- 对 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 的 影 响， 为 进 一 步 研 究 基 因 的 功 能、 调 控 机 制 及 紫 色 不 结 球 白 菜 中 花 青 苷 合 成 的 分 子 调 控 机 制 奠 定 生 物 学 基 础。 材 料 与 方 法 . 试 验 材 料 供 试 材 料 不 结 球 白 菜 来 源 于 南 京 农 业 大 学 白 菜 系 统 生 物 学 实 验 室。 其 中 紫 色 叶 自 交 系- 经 秋 水 仙 素 诱 导 后 筛 选 出 可 稳 定 遗 传 的 绿 色 突 变 系-。 将- 与 绿 色 突 变 系- 杂 交 后 得 到 的 代 全 为 紫 色， 自 交 后 得 到 的 后 代 植 株 中 紫 色 叶 与 绿 色 叶 的 比 例 约 为。 取 紫 色 叶 和 绿 色 突 变 植 株 自 交 系 植 株 作 为 试 验 材 料( 图)。 将 种 子 用 蒸 馏 水 冲 洗 干 净， 室 温 催 芽 左 右， 播 种 至 穴 盘 并 移 至 温 室。 图 不 结 球 白 菜 紫 色 自 交 系- 和 绿 色 突 变 系- 表 型 . - . 的 合 成 用 提 取 试 剂 盒() 分 别 提 取- 和- 叶 期 叶 片 的 总。 使 用 反 转 录 试 剂 盒() 合 成 第 一 链 用 于 基 因 克 隆。 用 提 取 试 剂 盒 分 别 提 取 经- 溶 液 处 理 后 的 不 结 球 白 菜- 和- 总， 使 用 反 转 录 试 剂 盒() 合 成 单 链。 . 不 结 球 白 菜 基 因 克 隆 利 用 大 白 菜 数 据 库(，:/./) 中 同 源 基 因() 设 计 引 物( 表)， 以 反 转 录 得 到 的 第 一 链 为 模 板。 总 体 系: 模 板， 正、 反 引 物 各 ， 。 扩 增 条 件 为:；， 个 循 环；。 扩 增 产 物 经 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离， 回 收 目 的 片 段， 经 转 化， 挑 第 期 董 慧 杰， 等: 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 负 调 控 基 因 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源- 的 响 应 选 阳 性 克 隆 菌 液 测 序。 表 引 物 序 列 引 物 对 名 称 引 物 对 序 列() 用 途 -/ / 扩 增 保 守 片 段 -/ / 检 测 的 表 达 -/ / 检 测 内 参 基 因 的 表 达 . 基 因 序 列 及 其 蛋 白 的 生 物 信 息 学 分 析 用. 软 件 查 找 基 因 的 开 放 阅 读 框() 并 推 导 其 氨 基 酸 序 列； 利 用 在 线 软 件 (:/./.) 分 析 基 因 编 码 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成， 推 测 其 相 对 分 子 质 量 和 等 电 点； 利 用(:/. . /) 预 测 所 编 码 蛋 白 质 的 信 号 肽； 用 .(:/./) 和(:/./.) 分 别 对 其 跨 膜 结 构 域 和 亚 细 胞 定 位 进 行 预 测 分 析； 用 中 在 线 工 具(:/. ./.) 和(:/./) 分 析 其 编 码 蛋 白 的 结 构 域； 采 用 和 软 件 进 行 蛋 白 质 多 序 列 比 对， 用. 软 件 构 建 系 统 进 化 树； 通 过 在 线 软 件(:/./ ? ) 和(:/ ./) 分 析 其 蛋 白 质 序 列 的 二 级 结 构 并 进 行 三 级 结 构 建 模 预 测。 . 外 源- 处 理 不 结 球 白 菜 待 不 结 球 白 菜 植 株 长 到 叶 期 时， 叶 面 喷 施 质 量 浓 度 为 的- 溶 液， 并 于 喷 前 及 喷 后、 、 和 剪 取 叶 片.， 置 保 存 备 用。 每 个 处 理 个 重 复。 为 了 增 强- 的 吸 收 效 果， 喷 施 液 中 加 入. 的 吐 温， 以 喷 施 等 量 清 水 加. 吐 温 作 为 对 照。 喷 施 时 间 为 :。 . 不 结 球 白 菜 总 花 青 苷 含 量 的 测 定 总 花 青 苷 的 提 取 参 照 王 小 青 等 的 方 法 并 略 有 改 动。 取 冷 冻 干 燥 叶 片.， 用 液 氮 研 磨 后， 加 入 . 酸 化 甲 醇( 其 中 含 体 积 分 数 为 的)， 在 适 当 摇 晃 的 条 件 下 室 温 浸 提。 因 提 取 液 中 花 青 苷 见 光 易 分 解， 试 验 过 程 中 应 注 意 避 光 。 花 青 苷 含 量( . )/， 其 中: 和 表 示 花 青 苷 提 取 液 分 别 在 和 下 的 吸 光 值； 表 示 叶 片 鲜 质 量()。 每 个 反 应 设 次 重 复。 . 实 时 荧 光 定 量 表 达 分 析 根 据 克 隆 所 得 基 因 的 全 长 序 列， 采 用 软 件 设 计 正、 反 引 物( 表)， 基 因 作 为 内 参。 试 验 参 照 () 试 剂 盒 的 说 明 书， 采 用 标 准 的 两 步 法 程 序， 在 实 时 荧 光 定 量 仪( 美 国) 上 完 成 定 量 分 析。 反 应 体 系: 模 板 ( 稀 释 倍)， 正、 反 引 物 各.， .。 相 对 定 量 使 用 参 照 基 因 的 法 ， 表 达 差 异 等 于 ， 目 标 基 因 。 每 个 反 应 设 次 生 物 学 重 复。 结 果 与 分 析 . 不 结 球 白 菜 基 因 的 克 隆 及 序 列 分 析 分 别 以 紫 色 叶 自 交 系- 及 其 绿 色 突 变 系- 叶 片 为 模 板， 用 特 异 性 引 物 对 -/ 扩 增 出 长 约 的 扩 增 产 物。 通 过 基 因 克 隆 分 别 获 得- 和- 中 基 因 序 列。 测 序 结 果( 图) 表 明， 克 隆 所 得 基 因 片 段 在 个 自 交 系 中 大 小 一 致， 长 度 均 为， 其 中 包 括 编 码 区()， 非 编 码 区()， 其 编 码 区 序 列 含 有 的 开 放 阅 读 框()， 编 码 个 氨 基 酸， 将 克 隆 片 段 命 名 为。 核 苷 酸 序 列 比 对 发 现 编 码 区 序 列 与 大 白 菜 的 完 全 一 致( 图)。 . 不 结 球 白 菜 蛋 白 的 特 征 分 析 蛋 白 等 电 点 为.， 蛋 白 相 对 分 子 质 量 为. ， 氨 基 酸 组 成 中 丝 氨 酸() 所 占 比 例 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 图 不 结 球 白 菜 中 基 因 的 核 苷 酸 序 列 及 其 编 码 的 氨 基 酸 序 列 . - 表 示 终 止 密 码 子。 . 图 不 结 球 白 菜 和 大 白 菜 中 基 因 的 核 苷 酸 序 列 比 对 . - 最 大。 蛋 白 中 含 有 酸 性 氨 基 酸 个， 碱 性 氨 基 酸 个。 生 物 信 息 学 分 析 表 明 蛋 白 位 于 细 胞 核 中， 为 亲 水 性 蛋 白， 无 跨 膜 区。 保 守 域 分 析 结 果 表 明， 蛋 白 属 于 超 家 族。 运 图 不 结 球 白 菜 基 因 编 码 蛋 白 的 二 级 结 构 . -: 结 合 区 域；: 蛋 白 结 合 区 域；: 螺 旋；: 延 伸 链；: 外 露 的 蛋 白 质；: 隐 藏 的 蛋 白 质。 :-；:；:-；:；:；:. 用 软 件 预 测 蛋 白 的 二 级 结 构 结 果( 图) 显 示: 该 蛋 白 含 有 个 结 合 位 点， 个 蛋 白 质 结 合 位 点， 其 二 级 结 构 由. 的 螺 旋、. 的 延 伸 链 以 及. 的 随 机 卷 曲 组 成。 此 外， 蛋 白 结 构 中 暴 露 在 外 的 氨 基 酸 占.， 隐 藏 在 内 的 氨 基 酸 占.， 其 余. 的 氨 基 酸 居 中。 其 无 序 蛋 白 含 量 占.， 表 明 该 蛋 白 结 构 灵 活 性 较 强。 预 测 的 蛋 白 的 三 级 结 构( 图) 与 其 二 级 结 构 预 测 结 果 基 本 相 符。 第 期 董 慧 杰， 等: 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 负 调 控 基 因 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源- 的 响 应 图 不 结 球 白 菜 蛋 白 三 级 结 构 的 预 测 . -: 螺 旋-；: 延 伸 链；: 随 机 卷 曲 . . 蛋 白 的 同 源 性 比 较 及 进 化 树 分 析 利 用 对 编 码 的 蛋 白 序 列 进 行 同 源 检 索， 结 果( 图) 表 明， 蛋 白 与 大 白 菜 ( .) 中 的 同 源 性 高 达， 其 次 与 油 菜(.)、 甘 蓝( .) 的 同 源 性 较 高， 分 别 为 和。 利 用 及 软 件 对 包 括 蛋 白 在 内 的 个 物 种 的 蛋 白 序 列 进 行 多 重 比 对 分 析， 结 果( 图) 显 示， 超 家 族 所 在 的 区 域( 第 个 氨 基 酸 序 列) 在 比 对 的 植 物 蛋 白 序 列 中 高 度 保 守， 表 明 编 码 的 蛋 白 可 能 与 其 他 物 种 的 蛋 白 具 有 相 同 的 功 能。 此 外， 由 个 保 守 的 半 胱 氨 酸 残 基 组 成 的-()-()-()- 基 序 也 存 在 于 蛋 白 的 高 保 守 区 域 中。 图 蛋 白 和 其 他 植 物 已 知 蛋 白 同 源 性 比 较 . 黑 框( 第 个 氨 基 酸 序 列) 表 示 超 家 族 所 在 的 高 保 守 区 域， 黑 框( 第 个 氨 基 酸 序 列) 表 示-()-()-()- 基 序， 表 示 半 胱 氨 酸。 : 不 结 球 白 菜；: 大 白 菜( .)；: 油 菜(.)；: 甘 蓝( .)；: 拟 南 芥 ( .)；: 亚 麻 芥( .)；: 琴 叶 拟 南 芥( .)。 ()，() -()-()-()- ， .: . ；: . ( .)；:(.)；: ( .)；: ( .)； :( .)；:( .). 为 进 一 步 分 析 蛋 白 与 其 他 植 物 蛋 白 之 间 的 进 化 关 系， 在 多 重 比 对 的 基 础 上， 利 用 软 件. 对 上 述 植 物 与 荠 菜( .)、 天 蓝 遏 蓝 菜(.)、 山 葵( .) 和 萝 卜( .) 中 的 蛋 白 进 行 系 统 进 化 分 析。 由 图 可 见: 的 进 化 基 本 符 合 植 物 分 类 学 地 位， 且 具 有 明 显 的 种 属 特 性， 同 一 科 植 物 不 同 属 之 间 的 分 类 明 显， 同 属 植 物 在 进 化 树 上 处 于 同 一 分 支。 其 中， 拟 南 芥 属 的 拟 南 芥 和 琴 叶 拟 南 芥 聚 为 一 组； 同 为 芸 薹 属 的 大 白 菜、 油 菜 和 甘 蓝 聚 为 一 组； 而 不 结 球 白 菜 与 同 属 的 大 白 菜 关 系 最 近， 聚 为 一 组， 其 次 与 油 菜 和 甘 蓝 关 系 较 近。 南 京 农 业 大 学 学 报 第 卷 图 蛋 白 与 其 他 植 物 中 蛋 白 的 系 统 进 化 分 析 . . 外 源- 处 理 后 不 结 球 白 菜 花 青 苷 含 量 的 变 化 由 图 可 见: 在 紫 色 材 料- 中 检 测 到 大 量 花 青 苷， 外 源- 在 一 定 程 度 上 可 以 促 进 紫 色 不 结 球 白 菜 中 花 青 苷 的 积 累， 且 在 处 理 以 后 花 青 苷 含 量 均 高 于 对 照(.)。 而 绿 色 材 料- 中 则 基 本 不 含 花 青 苷。 图 外 源- 处 理 下 不 结 球 白 菜 中 花 青 苷 含 量 . - 不 同 大 写 字 母 表 示 在. 水 平 上 差 异 极 显 著。 下 同。 . 图 外 源- 处 理 下 不 结 球 白 菜 中 基 因 相 对 表 达 量 . - - . 外 源- 处 理 后 不 结 球 白 菜 基 因 的 表 达 分 析 由 图 可 见: 基 因 在- 和- 中 的 表 达 水 平 不 同 但 具 有 相 似 的 表 达 模 式， 即 先 降 低 后 急 剧 升 高， 时 表 达 量 达 到 最 高 而 后 又 急 剧 下 降。 在- 中，- 处 理 后， 时 基 因 表 达 量 降 低 了.， 而 时 基 因 表 达 量 比 对 照 增 加 了.， 在 时 表 达 量 又 急 剧 下 降。 在- 中，- 处 理 后， 时 基 因 表 达 量 降 低 了.， 时 基 因 表 达 量 与 对 照 相 比 增 加 了.。 此 外， 基 因 在 紫 色 叶 材 料- 中 的 表 达 量 明 显 低 于 绿 色 突 变 体 材 料 -。 第 期 董 慧 杰， 等: 不 结 球 白 菜 花 青 苷 合 成 负 调 控 基 因 的 克 隆 和 表 达 分 析 及 其 对 外 源- 的 响 应 讨 论 家 族 的 基 因 所 编 码 的 蛋 白 在 其 末 端 含 有 约 个 氨 基 酸 的 高 保 守 区 域， 其 中 保 守 基 序 -()-()-()- 存 在 于 所 有 的 蛋 白 中 。 有 研 究 表 明， 家 族 的 基 因 可 编 码 锌 指 转 录 因 子， 其 中 家 族
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