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园艺学报， 2018， 45 (2)： 371 379. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0370； http： /www. ahs. ac. cn 371 收稿日期 ： 2017 08 10； 修回日期 ： 2018 01 10 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（ 31672160） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： mmmiaoyzu.edu.cn） 遮光对黄瓜幼苗同化物代谢相关糖和酶的影响 张治平，王爱花，陆 慢，缪旻珉*（扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009） 摘 要： 试验中发现，黄瓜幼苗遮光叶片蔗糖含量略高于未遮光对照叶片，而棉籽糖、肌醇半乳糖苷和水苏糖含量显著低于对照叶片。叶片中肌醇半乳糖苷合成酶活性和基因转录水平变化趋势一致，遮光叶片显著低于对照叶片；棉籽糖合成酶活性差异不显著，但是遮光叶片棉籽糖合成酶基因转录水平显著低于对照叶片；遮光叶片水苏糖合成酶活性显著低于对照，且相关基因转录水平变化与酶活性变化一致；此外蔗糖非发酵相关蛋白激酶 1 基因（ SnRK1）表达水平在遮荫处理 6 h 时显著高于对照。表明在遮光胁迫下，黄瓜幼苗通过调控肌醇半乳糖苷合成酶、水苏糖合成酶和蔗糖非发酵相关蛋白激酶 1 相关基因表达和酶活性，维持叶片蔗糖含量，提供生长所需能量，保证叶片存活。 关键词： 黄瓜；肌醇半乳糖苷合成酶；棉籽糖合成酶；水苏糖合成酶；蔗糖非发酵相关蛋白激酶 1 中图分类号： S 642.2 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 02-0371-09 The Influence of Shading Stress on Assimilate Metabolism Related Sugars and Enzymes in Cucumber Seedlings ZHANG Zhiping， WANG Aihua， LU Man， and MIAO Minmin*（ School of Horticulture and Plant Protection， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009， China） Abstract： In this study， results of liquid chromatography analysis showed sucrose content in leaves of cucumber seedlings under shading treatment was slightly higher than control. While galactinol， raffinose and stachyose contents of shading leaves were lower than that of control. The change of galactinol synthase activity was consistent with galactinol synthase genes expression level， which of shading leaves were lower than control； the activity of raffinose synthase is not significantly different between shading leaves and control， while the transcription level of raffinose synthase genes under shading condition was significantly lower than control； the activity of stachyose synthase of shading leaves was lower than control， and the expression level of stachyose synthase genes was consistent with the activity. In addition，the expression level of SNF1-related protein kinase 1 gene（ SnRK1） of shading leaves was higher than control at 12： 00 am of first day under 6 h shading treatment， which indicated that SnRK1 occurred in response of shading stress. Together， these results suggested that under shading stress the gene expression and activities of galactinol synthase， stachyose synthase， and SnRK1 in cucumber were regulated to maintain the content of sucrose， provide the energy for growth， and ensure the survival of leaves. Keywords： Cucumis sativus； galactinol synthase； raffinose synthase； stachyose synthase； SNF1- Zhang Zhiping， Wang Aihua， Lu Man， Miao Minmin. The influence of shading stress on assimilate metabolism related sugars and enzymes in cucumber seedings. 372 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 371 379. related protein kinase 1 黄瓜在设施栽培中，由于弱光逆境的存在，常表现出诸如叶片增大、变薄，茎变细，植株徒长等形态变化，以及光合作用、碳和氮的代谢，酶活性和干物质积累等生理方面的变化，致使其产量和品质降低（毕焕改 等， 2015； Wang et al.， 2016） 。黄瓜经弱光处理后，净光合速率呈直线下降，光合同化产物减少（ Halford， 2010；周超凡 等， 2016） 。 黄瓜属于棉籽糖寡糖家族（ Raffinose family oligosaccharides， RFOs）运输型植物，其韧皮部中运输的同化物主要形式是水苏糖（ Gross & Pharr， 1982） 。光合作用合成的蔗糖需要经过三步反应才能合成水苏糖，即蔗糖与肌醇半乳糖苷在棉籽糖合成酶（ Raffinose synthase， RS）作用下合成棉籽糖，进一步在水苏糖合成酶（ Stachyose synthase， STS）作用下合成水苏糖，肌醇半乳糖苷合成主要依靠肌醇半乳糖苷合成酶（ Galactinol synthase， GolS）作用（ Chrost & Schmitz， 1997） 。目前关于遮光对蔗糖运输型植物叶片同化物代谢影响的研究较多，但对 RFOs 运输型植物的研究相对较少，尤其关于 GolS、 RS 和 STS 的研究尚未见报道。本试验中采用四叶一心期黄瓜幼苗作为试材，对其进行遮光处理，研究叶片中同化物代谢相关糖和酶变化，探究黄瓜对遮光胁迫的响应机制，进而为黄瓜的保护地栽培技术提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料处理 试验于 2016 年 4 月在扬州大学园艺试验站进行。本试验以黄瓜（ Cucumis sativus L.）品种津春 4 号为材料。种子经 50 灭菌 10 min， 30 恒温箱中催芽 2 d，种子露白时播种于穴盘中，放置于塑料大棚中育苗。这一时期大棚内最高温度 25 ，最低温度 12 ，自然光照。 幼苗长至四叶一心期，选取生长一致的植株放置在步入式植物生长箱（ GBC-1600K 型培养箱，宁波江南仪器厂）内进行遮光处理（只对一片叶进行遮光） ，生长箱温度设定为（ 25 1） /（ 18 1）（昼 /夜） ，光照时间约为 6： 00 到 18： 00，最大光照强度为 700 mol m-2 s-1。从第 1 天上午6： 00 开始用锡箔纸遮住黄瓜幼苗的第 2 片真叶（由下至上数） ，直至试验结束，并以不遮光的幼苗为对照。分别于第 1 天 6： 00（遮光 0 h） 、 12： 00（遮光 6 h） 、 18： 00（遮光 12 h） 、第 2 天 18：00（遮光 36 h） 、第 3 天 18： 00（遮光 60 h）取第 2 片真叶，并用剪刀快速去除主叶脉后立即投入液氮中保存备用。试验设 3 次重复，每次重复取 3 株苗。 1.2 可溶性糖含量测定 黄瓜叶片中可溶性糖的提取和测定参照 Miao 等（ 2007）的方法。称取 0.3 g 左右经过冷冻的样品，在研钵中研磨均匀，加入 10 mL 80%乙醇提取液，经过 10 min 匀浆后在 6 000 g 下离心 15 min（离心机型号： Eppendorf Centrifuge 5430R） ，取上清液，重复 3 次。合并上清液，将其在旋转蒸发仪中 40 减压蒸发干燥后，加入 5 mL 去离子水溶解并进行洗脱，再移入 15 mL 离心管中，加入2.5 mL 氯仿进行萃取，振荡离心，去掉有机相，重复 3 次，以去除提取物中的磷脂。将剩下的水相用 0.1 mol L-1的 NaOH 调节至 pH 7.0，再置于旋转蒸发仪上蒸干，最后用 1 mL 去离子水溶解，经0.45 m 针式过滤器过滤。在与标准品相同的色谱条件下进样，利用外标法计算可溶性糖的含量。 色谱柱为 Agilent Hi-Plex Ca（ Duo）柱（ 300 mm 6.5 mm） ，流动相为超纯水，柱温 80 ，流张治平，王爱花，陆 慢，缪旻珉 . 遮光对黄瓜幼苗同化物代谢相关糖和酶的影响 . 园艺学报， 2018， 45 (2)： 371 379. 373 速 0.5 mL min-1，进样体积 5 L，以保留时间定性，以峰面积定量。 1.3 糖代谢相关酶提取及酶活测定 称取 0.5 g 冷冻研磨好的叶片样品，在 2 mL 50 mmol L-1HEPES-NaOH 缓冲液（ pH 7.0） 、 2 mmol L-1DTT、 10 mg mL-1 PVP 提取液中匀浆，静置 15 min 后，在 18 000 g 下离心 30 min，保留上清液，用含有 25 mmol L-1HEPES-NaOH 和 1 mmol L-1DTT 的提取缓冲液透析过夜。 肌醇半乳糖苷合成酶（ GolS）活性的测定：参照 Li 等（ 2011）和 Saravitz 等（ 1987）的方法。200 L 反应体系中包含 100 mmol L-1HEPES-NaOH 缓冲液（ pH 7.0） ， 20 mmol L-1 巯基乙醇，40 mmol L-1蔗糖， 20 mmol L-1肌醇， 5 mmol L-1UDP半乳糖， 5 mmol L-1MgCl2， 4 mmol L-1DTT，加入 50 L 酶液，在 30 下水浴 3 h，沸水中煮沸 5 min，冷却后， HPLC 进样，以生成肌醇半乳糖苷量表示酶活性。 棉籽糖合成酶（ RS）的测定：参照 Li 等（ 2011）的方法。 200 L 反应体系中包含 100 mmol L-1HEPES-NaOH 缓冲液（ pH 7.0） ， 20 mmol L-1 巯基乙醇， 40 mmol L-1蔗糖， 20 mmol L-1肌醇半乳糖苷， 5 mmol L-1MgCl2， 4 mmol L-1DTT，加入 50 L 酶液，在 30 下水浴 3 h，沸水中煮沸 5 min，冷却后， HPLC 进样，以生成的棉籽糖量表示酶活性。 水苏糖合成酶 （ STS） 的测定： 参照 Wang 等 （ 2012） 的方法。 200 L 反应体系中包含 100 mmol L-1HEPES-NaOH 缓冲液（ pH 7.0） ， 20 mmol L-1巯基乙醇， 40 mmol L-1棉籽糖， 20 mmol L-1肌醇半乳糖苷， 5 mmol L-1MgCl2， 4 mmol L-1DTT，加入 50 L 酶液，在 30 下水浴 3 h，沸水中煮沸 5 min，冷却后， HPLC 进样，以生成的水苏糖量表示酶活性。 1.4 碳水化合物代谢相关酶基因表达量测定 利用 RNAisoTMPlus（ TaKaRa，大连）试剂盒并按照说明书对黄瓜叶片进行总 RNA 提取。反转录使用 PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time）试剂盒（ TaKaRa，大连） ，参照试剂盒说明书进行 cDNA 合成。 利用荧光定量 PCR 测定相关基因表达。所用引物如表 1 所示。 表 1 试验所用引物序列 Table 1 The sequences of primers 基因名称 Gene name 正向引物 Forward primer 反向引物 Reverse primer 登录号 Accession No. STS1 GCAATGATTTCTTCTACCTTGGC GGATACACGAGCTGCTTTATGA EU096496 STS2 GGATTGAAGAAGCTGGTGGAGT GCGGTGAAAAATACAAAAATAGT EU096497STS3 GTGACATGTGTGCTAAGGA CGCGTATAATTTCCCTCTTTC EU096498Gols1 CAACCACAGCTTTCCACCAC TCTCCTTAACAATACATCCCTG AY237112 Gols2 GCCTCTGCTGCAAGTTCGGA GGCCATCTTCTTCCTCGA XM_004150790 Gols3 GATGCTCGTCAAGAAATGG CCACAACAAACAATCTCCTC XM_004172882 Gols4 CCACATCACAGCTCCTTCTG ACACACACATCCCCCAACCA XM_004135204 RS GATTCTGGTCGACCGTATGTTCTCC CAACAACTTTCGACGAACCACTCT AAD02832 SnRK1 ATGACTGAAGTTCTTAAGGCCCTA CCTTCATGATGGCC TGGAATTCC CAA71142 18S rRNA GCTGATTGCTGATTGGATGTGACAT TCCATAGAACCACAGCGACTCTTT 利用 SYBRPremix Ex TaqTM试剂盒并按产品说明书操作。反应体系为 SYBRPremix Ex TaqTM 12.5 L， cDNA 2.0 L， 10 mol L-1的上、下游引物各 1 L，灭菌蒸馏水 8.5 L，总体系为 25 L。使 用 CFX96TM实时定量 PCR 仪（ Bio-Rad，美国） ， qPCR 程序为： 94 2 min； 94 10 s， 60 5 s， 35 个循环； 然后以 0.5 min-1的速率从 65 缓慢升温至 95 。 数据处理按 Kenneth Zhang Zhiping， Wang Aihua， Lu Man， Miao Minmin. The influence of shading stress on assimilate metabolism related sugars and enzymes in cucumber seedings. 374 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 371 379. & Thomas（ 2001）的方法，采用相对定量的 2-Ct方法，基因表达水平以各组织部位之间的比值表示。 1.4 数据处理 所有数据采用 Microsoft Excel 软件进行整理和绘图，运用 SPSS19.0 统计软件进行差异显著性分析，试验数据采用双因素方差分析， LSD 法多重比较。 2 结果与分析 2.1 遮光对黄瓜幼苗可溶性糖含量的影响 遮光胁迫对黄瓜幼苗同化代谢过程中可溶性糖含量的影响如图 1 所示。遮光胁迫下，黄瓜幼苗遮光叶片蔗糖含量在遮光后 6 h 和 12 h 显著高于对照叶片。遮光处理叶片肌醇半乳糖苷含量在遮光处理 6 h 后含量最高，遮光 12 h 时以后逐渐降低；除遮光 0 h，遮光各检测点肌醇半乳糖苷含量均显著低于对照。黄瓜幼苗中棉籽糖的积累量在正常条件下和遮光条件下变化趋势一致，呈现逐渐上升趋势，在遮光 6 h 和遮光 60 h 显著低于对照。在遮光胁迫下，黄瓜幼苗叶片水苏糖含量也在遮光6 h 达到最高，随后逐渐降低；除了遮光 0 h，遮光叶片水苏糖含量均显著低于未遮光叶片。 正常光照条件（ 12 h 光照 /12 h 黑暗，光照时间为 6:00 18:00）下，黄瓜叶片通过光合作用合成蔗糖，肌醇半乳糖苷也大量合成，合成棉籽糖进一步合成水苏糖，向外运输；遮光处理（遮光时间 0、 6、 12、 36 和 60 h）后，光合作用受阻，同时叶片也停止合成肌醇半乳糖苷，含量显著减少，叶片停止将蔗糖合成水苏糖。因此，在遮光条件下，叶片水苏糖大量降低，而蔗糖含量降低不明显，反而轻微升高，可能是水苏糖降解形成蔗糖；随着遮光的延续，遮光后 60 h，叶片中可用水苏糖减少，叶片直接利用棉籽糖合成蔗糖，因此遮光 60 h 的棉籽糖含量也显著低于对照。 图 1 黄瓜幼苗在遮光条件下可溶性糖含量变化 Fig. 1 The changes of soluble sugar content in cucumber seedings under shading condition 张治平，王爱花，陆 慢，缪旻珉 . 遮光对黄瓜幼苗同化物代谢相关糖和酶的影响 . 园艺学报， 2018， 45 (2)： 371 379. 375 2.2 遮光对 GolS 基因表达和酶活性的影响 GolS 是合成肌醇半乳糖苷的关键酶。在黄瓜基因组中 （ http： /www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/ index.cgi）发现了 4 个与 GoLS 相关基因，分别是 GolS1、 GolS2、 GolS3 和 GolS4。 从图 2 可以看出，遮光胁迫下， GolS1 的转录水平变化趋势与对照趋势一致，在遮光处理 36 h和 60 h，遮光叶片 GolS1 的转录水平显著低于对照； GolS2 表达水平变化趋势与 GolS1 基本一致，遮光处理后 GolS2 转录在遮光 60 h 低于对照； GolS3 表达水平变化趋势与 GolS1 一致，遮光处理后GolS3 转录遮光 6 h 显著低于对照； GolS4 的转录水平在正常条件下在第 1 天 12： 00（遮光 6 h）达到最高，随后略微降低，遮光处理后 GolS4 转录水平均显著低于对照。 在正常光照条件下，黄瓜幼苗叶片中 GolS 酶活性在遮光 60 h 达到最大值，随后均维持在较高水平；遮光处理后， GolS 酶活均显著低于对照（图 2） 。 以上结果表明，遮光叶片中， GolS 酶活降低与不同遮荫时间点 GolS 基因转录水平降低有关，GolS 酶活降低影响了肌醇半乳糖苷合成，导致遮光叶片肌醇半乳糖苷含量降低。 图 2 遮光对黄瓜叶片 GolS 基因表达和酶活性的影响 Fig. 2 The effects of shading on the gene expression level and activity of GolS Zhang Zhiping， Wang Aihua， Lu Man， Miao Minmin. The influence of shading stress on assimilate metabolism related sugars and enzymes in cucumber seedings. 376 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 371 379. 2.3 遮光对 RS 基因表达和活性的影响 RS 是蔗糖转化棉籽糖的关键酶。 在正常条件下， RS 的转录水平随着时间的变化而逐渐升高 （图3） ；遮光处理后 RS 表达水平显著降低。遮光处理后黄瓜幼苗叶片中 RS 的活性与对照相比基本无明显差异，但在遮光 60 h 显著低于对照。 以上结果说明虽然遮光显著抑制 RS 基因表达，但只在遮光 60 h 抑制 RS 的活性。该结果与遮光叶片棉籽糖含量结果对应，说明在遮光早期，蔗糖和棉籽糖处于平衡状态，在遮光 60 h，遮光处理开始抑制棉籽糖合成。 图 3 遮光对黄瓜叶片 RS 基因表达和酶活性的影响 Fig. 3 The effects of shading on the gene expression level and activity of RS 2.4 遮光对 STS 基因表达和活性的影响 STS 是水苏糖合成关键酶，目前已经克隆出 3 个 STS 基因，命名为 STS1、 STS2 和 STS3（ Miao et al.， 2007） 。黄瓜幼苗中 STS1、 STS2、 STS3 的转录水平均在遮荫处理后 6 h 达到最高（图 4） ；遮 图 4 遮光对黄瓜叶片 STS 基因表达和酶活性的影响 Fig. 4 The effects of shading on the gene expression level and activity of STS 张治平，王爱花，陆 慢，缪旻珉 . 遮光对黄瓜幼苗同化物代谢相关糖和酶的影响 . 园艺学报， 2018， 45 (2)： 371 379. 377 图 5 遮光对黄瓜叶片 SnRK1 基因表达影响 Fig. 5 The effect of shading on the SnRK1 gene expression level 光处理后，遮光叶片 STS1 的转录在遮光 6 h 和 60 h 显著低于对照；遮光叶片 STS2 转录水平在遮光处理后均显著低于对照。遮光叶片 STS3 的转录水平在遮光 12， 36 和 60 h 显著低于对照。 STS 酶活性变化与其基因转录水平变化相似，遮光 6 h 后酶活性最高，遮光处理 6、 36 和 60 h叶片 STS 酶活性显著低于对照。 以上结果说明，遮光处理后，最早在第 1 天 12： 00（遮光 6 h）开始影响 STS 基因表达，并降低 STS 酶活性，从而抑制遮光叶片中水苏糖合成，避免碳水化合物外运。 2.5 遮光对黄瓜幼苗 SnRK1 表达水平的影响 蔗糖非发酵相关蛋白激酶 1（ Sucrose non-fermenting related protein kinase 1， SnRK1）在遮光胁迫下能够调节植物糖代谢（ Colleo et al.， 2012） 。为了检测 SnRK1 是否参与黄瓜遮荫胁迫反应，测定 SnRK1 基因表达水平。在遮光处理 6 h 后，遮光叶片 SnRK1 的表达水平显著高于对照（图 5） 。 以上结果说明， SnRK1 在转录水平上快速响应遮光胁迫。 3 讨论 与大多数高等植物不同，黄瓜是以水苏糖作为体内光合产物的主要运转形式。黄瓜体内的同化物在从源到库的运输过程中，需要经历蔗糖、肌醇半乳糖苷、棉籽糖和水苏糖之间的数次转化。与蔗糖运输型植物相比，水苏糖运转型植物的光合产物在输出之前尚需经历由蔗糖合成水苏糖的步骤。本研究中发现遮光处理后黄瓜幼苗叶片中蔗糖含量均高于对照，这与蔗糖运输型植株明显不同，如遮光可以降低长春花（唐中华 等， 2007）和甜玉米（赵福成， 2014）蔗糖含量。出现这种现象的原因可能与黄瓜是水苏糖运输型植物有关，遮光处理后光合作用中蔗糖合成减少，叶片停止将蔗糖转化成水苏糖向外运输，而将水苏糖降解为蔗糖，维持生理代谢，因此水苏糖含量在遮光处理后降低明显，且棉籽糖在遮光处理后第 3 天开始降低。 GolS 在合成棉籽糖和水苏糖中起重要作用，它催化合成肌醇半乳糖苷，以此为供体，在 RS 和STS 的作用下将蔗糖合成棉籽糖、水苏糖等寡糖。本研究中发现 4 个 GolS 基因转录水平在遮光胁迫下均有一定下调，并且 GolS 酶活性降低，最终导致遮光叶片肌醇半乳糖苷含量显著降低。说明黄瓜 GolS 基因能够响应遮光胁迫。研究表明其他植物 GolS 基因在遭受低温、干旱、盐害等非生物胁迫时表达上调（ Takahashi et al.， 1994； Taji et al.， 2002； Downie et al.， 2003； Sun et al.， 2013） ，而本研究中遮光胁迫下，黄瓜叶片 GolS 基因表达下调，这可能与黄瓜是水苏糖运转型植物有关。 遮光处理 6、 18 和 36 h，棉籽糖和 RS 活性变化不明显，说明在遮光早期，棉籽糖与蔗糖处于动态平衡状态；遮光处理第 3 天棉籽糖和 RS 活性降低明显，说明叶片开始抑制蔗糖转化为棉籽糖；与此同时， RS 基因转录水平在遮光条件下明显低于对照，说明遮光对叶片 RS 基因调控明显早于对其酶活性的调控。而 STS 相关基因在遮光处理后却显著下调，并且酶活力也显著降低，叶片中水苏糖含量也显著降低，说明遮光处理后，叶片抑制水苏糖合成，阻止同化产物外运，以保证叶片有足Zhang Zhiping， Wang Aihua， Lu Man， Miao Minmin. The influence of shading stress on assimilate metabolism related sugars and enzymes in cucumber seedings. 378 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 371 379. 够的同化产物，维持叶片生理活性。 SnRK1 在维持生物能量平衡方面起着关键作用（ Robaglia et al.， 2012） 。近年来在拟南芥、水稻、马铃薯等植物中的研究结果表明，当植物体处于“饥饿”状态时（如受到黑暗、低温等导致同化物供应不足的胁迫） ， SnRK1 被激活，继而促进分解代谢、抑制合成代谢，当“饥饿”缓解时，上述过程又可以被逆转（ Baena-Gonzalez et al.， 2007） 。有研究表明，植物细胞内的碳水化合物水平（同化物供应是否充足）能影响 SnRK1 的表达水平，其活性在一定范围内随着胞内蔗糖水平的提高而提高， 但随着葡萄糖、 葡萄糖 6磷酸和海藻糖 6磷酸水平的提高而降低 （ Rolland et al.， 2006；罗静静 等， 2017；王贵芳 等， 2017） 。已有研究表明， SnRK1 亦参与黄瓜能量代谢（ Zhang et al.，2015； Wang et al.， 2016） 。本研究中发现，遮光 6 h， SnRK1 表达水平显著高于对照，说明光合作用被抑制后， 黄瓜能量供应不足后能够激活 SnRK1 表达， 从而调控糖代谢路径， 维持叶片能量供给，避免植株因同化物供应不足而死亡。这与 Wang 等（ 2016）的研究结果一致。 本研究表明，在遮光胁迫下，光合作用受阻，同化物合成减少，激活 SnRK1 基因表达，并抑制GolS 相关基因表达和酶活性，以及 STS 基因表达和酶活性，从而抑制肌醇半乳糖苷和水苏糖合成，避免同化物外运，维持叶片蔗糖含量；当遮光胁迫持续， RS 酶活亦被抑制，从而阻止蔗糖合成棉籽糖，揭示了在遮光胁迫下黄瓜糖代谢变化的特点和遮光胁迫下叶片响应机制，为完善黄瓜的设施栽培提供理论依据。 References Baena-Gonzalez E， Rolland F， Thevelein J M， Sheen J. 2007. 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