黄瓜蜡质合成调控基因CsWIN1的克隆与功能初步分析.pdf

园艺学报， 2018， 45 (2)： 359 370. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0736； http： /www. ahs. ac. cn 359 收稿日期 ： 2017 10 24； 修回日期 ： 2018 01 08 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（ 31471156） ；上海交通大学 Agri-X 基金项目（ Agri-X2015002） ；上海市研究生教育创新计划项目（园艺学） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： cairunsjtu.edu.cn） 黄瓜蜡质合成调控基因 CsWIN1 的克隆与功能初步分析 李 铖，潘 健，连红莉，王 刚，何欢乐，潘俊松，蔡 润*（上海交通大学农业与生物学院，上海 200240） 摘 要： 从黄瓜中同源克隆了拟南芥中具有调控蜡质合成与代谢功能的基因 WIN1/SHINE1，命名为CsWIN1。荧光定量 PCR 结果表明： CsWIN1 在黄瓜植株的叶片和幼果中高表达；通过在拟南芥中过表达CsWIN1，发现其与已报道的 WIN1/SHINE1 过表达株系表型相似。通过对 CsWIN1 转基因株系的基因表达分析发现， 蜡质合成相关基因的表达受到了调控。 根据以上研究结果， 推测 CsWIN1 与拟南芥 WIN1/SHINE1在表皮蜡质合成调控上的功能是保守的，通过调控下游蜡质合成相关基因的表达从而影响蜡质的合成与代谢。 关键词： 黄瓜；表皮蜡质； CsWIN1；功能分析 中图分类号： S 642.2 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 02-0359-12 Cloning and Functional Analysis of CsWIN1， a Transcription Factor Regulated the Wax Synthesis in Cucumber LI Cheng， PAN Jian， LIAN Hongli， WANG Gang， HE Huanle， PAN Junsong， and CAI Run*（ School of Agriculture and Biology， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China） Abstract： In Arabidopsis， WIN1/SHINE1 gene has the function of regulating wax synthesis and metabolism. In this study， a homologous gene of WIN1/SHINE1 was cloned from cucumber and named CsWIN1. The results of qRT-PCR showed that CsWIN1 expressed at high levels in the leaves and young fruits of cucumber. Subcellular localization analysis suggested that the CsWIN1 protein is located in the nucleus. The CsWIN1 overexpression in the transgenic plants of Arabidopsis thaliana caused a similar phenotype to WIN1/SHINE1 overexpressing lines of Arabidopsis. The expression analysis of CsWIN1 transgenic lines indicated that the expressions of the genes related to wax synthesis have been changed significantly. These results suggested that the function of CsWIN1 is conserved in the regulation of epidermal wax synthesis through regulating the expression of downstream genes related to wax synthesis to affect wax biosynthesis and metabolism. Keywords： cucumber； epicuticular wax； CsWIN1； functional analysis Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 360 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 359 370. 植物表皮由沉积的角质层和蜡质共同组成（ Juniper & Jeffree， 1983） 。而蜡质又可分为两层，其中一层为嵌入在角质层中的脂质的无定形混合物，称为内蜡质层；另一层是指形成晶体的表面脂质或在角质层外面的光滑膜，称为外蜡质层。 Barthlott 等（ 1998）调查了 13 000 多种植物表皮蜡质的形态结构，发现其微观形态不是固定的，在植物生长过程中因成分变化而相互转化，并且能自我组装成各种形态的蜡质晶体，如杆状、柱状、管状、丝状、片状、颗粒状等，一些植物在特定的生长时期会出现肉眼可观察到的白霜状表型。不同植物的蜡质成分和含量不同，同一植株不同器官及不同生长发育时期的蜡质分布和组分也存在差异（ Susan et al.， 1997；倪郁和郭彦军， 2008） 。植物表皮蜡质形成了植物地上器官的疏水层， 是保护其免受机械损伤和病原体入侵的第一道屏障 （ Sieber et al.， 2000） 。 此外， 其在植物中还起多重作用， 包括调节表皮渗透性和防止水分流失 （ Lu et al.， 2009） ，抵御非生物和生物胁迫（ Steinmller & Tevini， 1985； Seo & Park， 2010）等。 含有 AP2 结构域的转录因子最初发现于高等植物中 （ Jofuku et al.， 1994） 。 拟南芥 WIN1/SHINE1是一种具有 AP2 结构域的乙烯应答型转录因子， 也是第 1 个被鉴定为与植物脂质代谢途径紧密相关的转录因子（ Magnani et al.， 2004； Kannangara et al.， 2007） 。在拟南芥中过表达 WIN1/SHINE1 后会形成更加有光泽的叶表面，而且叶茎表皮蜡质积累量明显增加,产生类似平盘状、长约 1 2 m的蜡质结晶,在一定程度上渗透性增强，且蜡质积累量与 WIN1/SHINE1 在植株中的表达水平有关（ Broun et al.， 2004） 。有研究表明， WIN1/SHINE1 还能通过控制角质层脂质代谢，来改变果胶代谢和结构蛋白，从而改变表皮细胞壁结构（ Shi et al.， 2011） 。 黄瓜（ Cucumis sativus L.）表面覆盖的蜡质与植株生长和抗性关系密切。本研究中克隆了黄瓜中调控蜡质合成相关基因 CsWIN1， 并分析了其基因结构、 蛋白结构和表达模式， 初步预测了 CsWIN1在调控黄瓜表皮蜡质形成中的作用，为研究黄瓜表皮蜡质形成的分子机制提供新的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 供试黄瓜材料为华北类型 9930、欧美加工型 Gy14 和本实验室保存的华北型自交系 S94、欧洲温室型自交系 S06。材料于 2016 年 3 月 25 日种植于上海交通大学农业与生物学院温室内，自然光照条件。拟南芥品系哥伦比亚野生型（ Columbia-0， Col-0）由本实验室保存， gl2 无毛突变体（ CS65，gl2-1）购于 ABRC Stocks 网站。 TA-克隆载体 pEASY 购置于全式金公司。植物表达载体 pHB 与pHB-YFP 由复旦大学生命科学技术学院杨洪全老师馈赠。 1.2 CsWIN1 的克隆、测序及生物信息学分析 根据拟南芥 WIN1/SHINE1（ AT1G15360）编码区序列及其编码蛋白的氨基酸序列，从黄瓜基因组数据库（ http： /www.cucumber.genomics.org.cn）中 BLAST 比对，选序列相似性与得分最高的基因 Csa2G006270，命名为 CsWIN1。根据 CsWIN1 基因的编码区序列（ CDS）设计 PCR 引物。上游引物： 5-ATGGTGCCATCAAAGAAGTTTAGA-3，下游引物： 5-TTAGATTAGAGAGGGTAAAAAA GTTGGT-3。提取 9930 黄瓜叶片总 RNA（采用康为世纪 CWBIO OmniPlant RNA Kit） ，并反转录为cDNA（采用康为世纪 HiFiScript cDNA Synthesis Kit） ，将其作为模板进行 CsWIN1 片段 PCR 扩增。反应条件： 94 预变性 5 min； 94 变性 30 s， 58 复性 30 s， 72 延伸 90 s， 35 个循环； 72 10 min。 PCR 扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后,用 DNA 凝胶回收试剂盒（天根）进行回收纯李 铖，潘 健，连红莉，王 刚，何欢乐，潘俊松，蔡 润 . 黄瓜蜡质合成调控基因 CsWIN1 的克隆与功能初步分析 . 园艺学报， 2018， 45 (2)： 359 370. 361 化获得所需的目的片段。将基因片段与全式金 pEASY 载体连接，根据试剂盒说明书筛选阳性克隆，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。 在 NCBI（ http： /www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，使用 Blast 程序在 GenBank 搜索与 CsWIN1 蛋白同源性高的植物蛋白序列。通过 EMBOSS6.5.7 工具 sigcleave 预测信号肽，通过 BLASTp 获得与CsWIN1 序列相似性较高的蛋白序列构建系统发育树。用 Clustal W 程序（ Wang et al.， 2014）和Geneious 9.14 软件进行序列的比对分析,用 Geneious 9.14 软件构建系统进化树（参数为： “ observed divergency” ， “ toss gaps” ，使用 1 000 次的 bootstrap 校验） 。 1.3 实时荧光定量 PCR（ qRT-PCR） 从 9930 黄瓜植株上采集 2、 5 和 10 mm 长幼果、子叶，开花前一天的雌蕊、雄蕊、果肉、果皮、花瓣和萼片，四叶一心时期的真叶、根、茎、卷须等，分别提取总 RNA。取欧洲温室型黄瓜 S06植株的完全伸展开真叶、 5 mm 长幼果和成熟果皮，分别提取总 RNA。所有样品均设 3 个生物学重复。荧光定量 PCR 仪采用 Rotor-Gene Q（ Qiagen） ，试剂盒为 FastStart Essential DNA Green Master（ Roche） 。 CsWIN1 上游引物： 5-TCAAGCGGCCGTGTTAATGAGC-3，下游引物： 5-CGTTTGGCT CATCGGAAAGTTGG-3。所用内参基因为 CsActin3，上游引物： 5-TCGTGCTGGATTCTGGTG-3，下游引物： 5-GGCAGTGGTGGTGAACAT-3。 PCR 反应体系为： 2 mix 10 L，上游引物（ 10 mol L-1） 0.5 L， 下游引物 （ 10 mol L-1） 0.5 L， cDNA 模板 2 L， 最后加灭菌去离子水至 20 L。PCR 扩增程序为： 95 预变性 10 min； 95 变性 10 s， 55 复性 10 s， 72 延伸 20 s， 40 个循环。所有样品设置 3 个技术重复， 3 个生物学重复。 CsWIN1 在不同发育时期、不同组织的相对表达量以在 2 mm 长幼果中的表达量为参照； CsWIN1 在不同黄瓜品种中的相对表达量以在 9930 成熟果皮中的表达量为参照。 1.4 CsWIN1-YFP 融合蛋白在烟草中的亚细胞定位及 CsWIN1 启动子元件分析 将 CsWIN1 的 PCR 产物与 pHB-YFP 载体连接。 将构建完毕的融合载体转入农杆菌 GV3101 中，对幼嫩烟草叶片进行瞬时转化，参照 Yang 等（ 2000）的方法。将处理过的烟草置于适宜条件下暗处理 48 h。通过 Leica TCS SP5II 激光共聚焦显微镜的 YFP 通道观察 CsWIN1-YFP 融合蛋白的亚细胞定位信号。 在黄瓜全基因组网站（ http： /www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/index.cgi）和 TAIR（ http： /www. arabidopsis.org/）上搜索 CsWIN1 和 WIN1/SHINE1 基因，获得它们的启动子序列（转录区前约 2 kb） ，然后用获得的启动子序列在转录调控元件分析网站（ http： /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）上得到每个基因启动子区域所含的转录调控元件。 1.5 过表达载体构建及遗传转化拟南芥 选取测序正确的 pEASY-CsWIN1 菌液提取质粒，用 BamH和 Sac进行双酶切，同时植物表达载体 pHB 也用 BamH和 Sac进行双酶切。酶切产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳,分别切取含外源目的基因 CsWIN1 片段和 pHB 酶切产物大片段的凝胶， DNA 回收纯化后用 T4 连接酶连接，参照试剂盒说明书（唯地生物）转化至大肠杆菌 DH5 感受态细胞， PCR 鉴定后的阳性菌液送生工测序。经测序确认， 从含 pHB-CsWIN1 的菌液中提取质粒， 用热激的方法转化农杆菌 GV3101 感受态细胞，PCR 方法鉴定后用携带 pHB-CsWIN1 的农杆菌参照骆倩（ 2014）的转化拟南芥方法对拟南芥野生型与 gl2 突变体进行转化。 Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 362 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 359 370. 收获农杆菌侵染过的 T0代拟南芥种子，进行阳性植株的筛选（骆倩， 2014） 。筛选至 T2代，获取纯合转基因植株进行表型分析， 野生型与 gl2 转化体分别记为 35S:CsWIN1-WT 和 35S:CsWIN1-gl2。 1.6 CsWIN1 对其他蜡质相关基因的调控 对拟南芥野生型、 gl2 突变体、 35S:CsWIN1-WT 和 35S:CsWIN1-gl2 4 种材料的整株幼苗和成熟莲座叶进行 qRT-PCR 分析，鉴定蜡质合成相关基因的表达量差异。拟南芥内参基因及蜡质合成相关基因的名称与引物序列均参照 Oshima 等（ 2013）的。转基因拟南芥相对野生型的表达差异倍数根据 2-CT法进行计算，差异倍数取对数后，导入热图（ heatmap）生成工具（ http： /www. omicshare. com/tools/index.php/）进行热图绘制。 2 结果与分析 2.1 CsWIN1 的结构及编码氨基酸序列分析 序列比对结果显示，在黄瓜基因组中与拟南芥 WIN1/SHINE1 序列相似性最高的基因为Csa2G006270，将其命名为 CsWIN1。通过 RT-PCR 扩增产物的测序，获得 9930 中 CsWIN1 的 cDNA编码区序列。该基因序列全长为 1 456 bp，包含 2 个外显子， 1 个内含子， CDS 全长 741 bp，编码247 个氨基酸（图 1） 。氨基酸序列含有一个保守的 AP2 结构域，无跨膜结构域或信号肽，分子量27 kD。 图 1 CsWIN1 基因结构示意图 Fig. 1 CsWIN1 gene structure diagram 通过对欧洲温室型自交系 S06、华北型 S94 和 9930 以及欧美加工型 Gy14 黄瓜材料的 CsWIN1基因扩增并测序，发现该基因在这 4 个果实表皮差异较大的黄瓜材料中无序列多态性。 2.2 系统进化树分析 进化树分析显示，与黄瓜同为葫芦科的甜瓜（ Cucumis melo， XP_008457550） 、苦 瓜（ Momordica charantia， XP_022143192）的 WIN1 基因与 CsWIN1 的亲缘关系较近（图 2） ，但尚未见生物学功能鉴定的报道。拟南芥的 WIN1/SHINE1 是功能研究较为深入的蜡质合成调控基因。黄瓜 CsWIN1 与AtWIN1 的氨基酸序列相似性为 59%（图 3） ，其中位于序列 N 端的 AP2 结构域，以及位于基因中间和 C 端的两个未知的结构域（图 3） ，在二级结构上都很保守（图 4） 。根据基因结构决定功能的原则，推测 CsWIN1 与拟南芥 WIN1/SHINE1 的基因功能可能相似。 李 铖，潘 健，连红莉，王 刚，何欢乐，潘俊松，蔡 润 . 黄瓜蜡质合成调控基因 CsWIN1 的克隆与功能初步分析 . 园艺学报， 2018， 45 (2)： 359 370. 363 图 2 黄瓜 CsWIN1 与其他物种 WIN1 同源蛋白进化树分析 数值代表氨基酸序列同源性的百分比。 Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of CsWIN1 and WIN1 homologs from other species The value represents the percentage of amino acid sequence homology. 图 3 黄瓜 CsWIN1 与其他物种 WIN1 蛋白序列对比 图中显示的是 CsWIN1 的 1 225 个氨基酸序列，省略号部分为与多数序列相比该序列缺少的部分， AP2 结构域标注在蛋白序列下方， Domain II、 Domain III 为两个未知结构域。 Pe：胡杨； Pt：毛果杨； Cm：甜瓜； Cs：香橙； Mc：苦瓜； At：拟南芥； Pb：白梨； Gh：陆地棉； Gr：棉花； Cc：柑橘； Cs：黄瓜； Hb：橡胶树； Me：木薯； Rc：蓖麻； Jc：麻风树； La：狭叶羽扇扁豆； Jr：胡桃； Cc：木豆。 Fig. 3 Sequence alignment of WIN1-like proteins in CsWIN1 and other species The figure shows the 1 225 amino acid sequence of CsWIN1. The ellipsis is part of the sequence that is missing from the sequence， and the AP2 domain is labeled below the protein sequence. Domain II and Domain III are two unknown domains. Pe： Populus euphratica； Pt： Populus trichocarpa； Cm： Cucumis melo； Cs： Citrus sinensis； Mc： Momordica charantia； At： Arabidopsis thaliana；Pb： Pyrus bretschneideri； Gh： Gossypium hirsutum； Gr： Gossypium raimondii； Cc： Citrus clementina； Cs： Cucumis sativus； Hb： Hevea brasiliensis； Me： Manihot esculenta； Rc： Ricinus communis； Jc： Jatropha curcas； La： Lupinus angustifolius； Jr： Juglans regia； Cc： Cajanus cajan. Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 364 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 359 370. 图 4 黄瓜 CsWIN1 的蛋白序列分析 Fig. 4 Analysis of protein sequence of cucumber CsWIN1 2.3 CsWIN1 在黄瓜中的表达模式分析 黄瓜果实在表皮光泽上存在很大差异，选取 9930、 S06（欧洲温室型自交系） 2 种表皮光泽差异较大的材料（图 5） ，通过 qRT-PCR 进行基因表达分析，发现在叶片和果皮中 CsWIN1 基因表达无显著差异（图 6） ，说明欧洲温室型黄瓜 S06 与华北型黄瓜 9930 果实表皮光泽差异很可能是由其他基因造成的。 选取华北型黄瓜 9930 的 2、 5 和 10 mm 长幼果，分析 CsWIN1 在这 3 个不同发育时期的表达差异。结果（图 7）显示， CsWIN1 在发育初期随着果实的成熟表达量逐渐上升，但在开花前的各花器官相对低表达，说明 CsWIN1 可能在果实发育初期发挥功能，参与调控蜡质代谢从而影响角质层的形成。对其他组织部位的表达分析显示 CsWIN1 在叶片中表达量最高；而在子叶、根、卷须、果刺中几乎不表达。叶片的特异高表达说明 CsWIN1 可能在叶片表皮细胞发育过程中起重要作用。 图 5 9930 与 S06 黄瓜果实 Fig. 5 Fruits of cucumber lines 9930 and S06 图 6 CsWIN1 在不同黄瓜品种中的表达 Fig. 6 Expression of CsWIN1 in different cucumber cultivars 李 铖，潘 健，连红莉，王 刚，何欢乐，潘俊松，蔡 润 . 黄瓜蜡质合成调控基因 CsWIN1 的克隆与功能初步分析 . 园艺学报， 2018， 45 (2)： 359 370. 365 图 7 CsWIN1 在 9930 黄瓜果实不同发育时期和不同组织的表达 1：根； 2：茎； 3：卷须； 4：果刺； 5：子叶； 6：叶片； 7： 2 mm 幼果； 8： 5 mm 幼果； 9： 10 mm 幼果； 10：果肉； 11：果皮； 12：雌蕊； 13：雄蕊； 14：花瓣和萼片。 Fig. 7 Expression of CsWIN1 in different fruit developmental stages and different tissues of 9930 cucumber 1： Root； 2： Stem； 3： Tendril； 4： Fruit thorn； 5： Cotyledon； 6： Leaf； 7： 2 mm fruitlet； 8： 5 mm fruitlet； 9： 10 mm fruitlet； 10： Pulp； 11： Peel； 12： Pistil； 13： Stamen； 14： Petals & sepal. 2.4 CsWIN1 的亚细胞定位和启动子元件分析 亚细胞定位结果显示， CsWIN1-YFP 融合蛋白在本氏烟叶表皮细胞中定位于细胞核（图 8） ，说明 CsWIN1 蛋白符合转录因子特性，即作为一个相对较上游的转录因子在细胞核内调控基因转录。 图 8 CsWIN1-YFP 融合蛋白在烟草中的亚细胞定位 A： CFP 通道； B： YFP 通道； C：白光通道； D：重叠通道。 Fig. 8 Subcellular localization of CsWIN1-YFP fusion proteins in tobacco A： CFP channel； B： YFP channel； C： The white light channel； D： Overlapping channel. Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 366 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 359 370. 启动子元件分析结果显示，在 CsWIN1 启动子区域中找到 25 个启动子元件，与 WIN1/SHINE1基因的启动子区域有 13 个相同的启动子元件，即 5UTR Py-rich stretch、 ABRE、 Box4、 CAAT-box、G-Box、 G-box、 GAG-motif、 GCN4-motif、 GT1-motif、 MRE、 O2-site、 TATA-box、 Circadian。其中 ABRE 与脱落酸信号的响应以及植物的抗逆性相关（孙晓丽 等， 2011） ； G-box 具有多重功能，包括接收与传导光信号、调控厌氧代谢反应、响应乙烯、脱落酸、茉莉酸等植物激素信号等（萨其拉 等， 2003）。 2.5 CsWIN1 对其他蜡质合成相关基因的影响 CsWIN1 过表达拟南芥植株的叶表面比野生型的更加有光泽（图 9） ，这与拟南芥 WIN1/SHINE1过表达植株表型一致。 图 9 拟南芥 35S:CsWIN1-WT 转化植株表型 A：转基因植株； B：野生型植株； C：拟南芥莲座叶片。 Fig. 9 Phenotypes of 35S:CsWIN1-WT transgenic plants in Arabidopsis A： 35S:CsWIN1 transgenic plant； B： Arabidopsis wild-type plant（ Ecotype Columbia） ； C： Arabidopsis thaliana leaves. 在黄瓜中， CsWIN1 在叶片中相对表达量最高（图 7） ，证明其与叶片的发育相关，推测其在拟南芥叶片中行使着类似的功能。但是，在 gl2 无毛突变体中过表达 CsWIN1 则没有明显表型变化。 根据转基因株系的 qRT-PCR 结果，计算差异表达倍数的对数值构建热图（图 10）过表达CsWIN1 拟南芥株系与野生型（ oxCsWIN1 vs WT）的差异；过表达 CsWIN1 的 gl2 突变体株系与 gl2突变体（ oxCsWIN1-gl2 vs gl2）的差异； gl2 突变体与野生型（ gl2 vs WT）的差异。 分析热图可以得出以下结果：蜡质合成相关基因 CER1、 CYP86A4、 CYP86A7 在拟南芥无毛突变体 gl2 突变体中的表达量明显比野生型低； CsWIN1 过表达的拟南芥莲座叶（ oxCsWIN1）中各蜡质合成相关基因较其野生型（ WT）中均呈上调表达，而在幼苗中则呈下调表达；在拟南芥 gl2 突变体幼苗中， CsWIN1 过表达后， GDSL、 CYP86A4、 CYP86A7 的表达被上调，而生长一段时间后，在成熟莲座叶中，只有 CYP86A4 上调表达；在拟南芥野生型（ WT）中过表达 CsWIN1，发现莲座叶中 CER1、 CER2、 KCS1 均上调表达。 这一结果与拟南芥 WIN1/SHINE1 过表达时 （ Oshima et al.， 2013）一致，即 CsWIN1 与拟南芥 WIN1/SHINE1 功能上是保守的。 李 铖，潘 健，连红莉，王 刚，何欢乐，潘俊松，蔡 润 . 黄瓜蜡质合成调控基因 CsWIN1 的克隆与功能初步分析 . 园艺学报， 2018， 45 (2)： 359 370. 367 图 10 转基因拟南芥植株与野生型及 gl2 突变体拟南芥植株中蜡质合成相关基因的表达量变化 oxCsWIN1 vs WT：过表达 CsWIN1 野生型拟南芥株系与野生型幼苗（莲座叶）的蜡质合成相关基因表达差异。 oxCsWIN1-gl2 vs gl2：过表达 CsWIN1 的 gl2 突变体株系与 gl2 突变体幼苗（莲座叶）的蜡质合成相关基因表达差异。 gl2 vs WT： gl2 突变体与野生型幼苗（莲座叶）的蜡质合成相关基因表达差异。 正数表示基因表达水平被上调；负数表示基因表达水平被下调。 Fig. 10 Fold changes of cuticle biosynthesis-related genes expression in transgenic Arabidopsis thaliana plants and wild-type（ WT） and gl2 mutant Arabidopsis plants oxCsWIN1 vs WT： The differences in expression of genes（ fold change） related to cuticle biosynthesis in 35S:CsWIN1 plants and wild-type seedlings（ rosette leaves） . oxCsWIN1-gl2 vs gl2： The differences in expression of genes（ fold change） related to cuticle biosynthesis in 35S:CsWIN1-gl2 plants and gl2 seedlings（ rosette leaves） . gl2 vs WT： The differences in expression of genes（ fold change） related to cuticle biosynthesis in gl2 and wild-type seedlings（ rosette leaves） . A positive number indicates that the gene expression level is up-regulated； a negative number indicates that the gene expression level is down-regulated. 3 讨论 WIN1/SHINE1 与其同源基因已在多个物种中被报道具有保守的功能，如拟南芥（ Broun et al.，2004） 、番茄（ Shi et al.， 2013） 、大麦（ Taketa et al.， 2008） 、小麦（ Bi et al.， 2016） 、夏堇（ Oshima et al.， 2013） 、苹果（ Lashbrooke et al.， 2015）等。目前在黄瓜中尚无 CsWIN1 基因突变体报道。采用同源克隆的方式对 CsWIN1 的基因功能进行研究， 在所选的 9930 和 S06 两个材料中 CsWIN1 表达无差异，说明两者果实表皮光泽差异很可能不是由 CsWIN1 造成，涉及其他基因。通过同源克隆与拟南芥转基因功能验证，初步证实 CsWIN1 具有 WIN1/SHINE1 类基因的功能，即通过调控下游蜡质合成相关基因对植物表皮角质层产生影响。但与 CsWAX1 和 CsCER2（王文娇， 2015）等基因不同，CsWIN1 作为转录因子，其直接或间接调控着很多下游基 因，调控模式的保守性在自然群体中该基因的编码区和表达稳定性上有所体现。 通过基因表达分析证实 CsWIN1 在转基因拟南芥中具有保守的调控模式，在此基础上， CsWIN1Li Cheng， Pan Jian， Lian Hongli， Wang Gang， He Huanle， Pan Junsong， Cai Run. Cloning and functional analysis of CsWIN1， a transcription factor regulated the wax synthesis in cucumber. 368 Acta Horticulturae Sinic