干制辣椒雄性不育系与保持系间多态性InDel标记的筛选

北方园艺（）： 研究论文第一作者简介：姜童（），男，硕士研究生，研究方向为蔬菜遗传育种。：责任作者：林多（），女，博士，教授，研究方向为蔬菜营养生理与品质育种。：基金项目：山东省农业重大应用技术创新资助项目（）；山 东 省 农 业 良 种 工 程 资 助 项 目（）；青岛农业大学应用型人才培养特色名校建设工程教学研究资助项目（，）；青岛农业大学高层次人才科研基金资助项目（）；山东省自然科学基金资助项目（）。收稿日期：干制辣椒雄性不育系与保持系间多态性标记的筛选姜童，王辉，杨 延 杰，林多（青岛农业大学 园艺学院，青岛市遗传改良与育种重点实验室，山东 青岛）摘要：以对干制辣椒雄性不育系以及相应保持系（，；，；，）为试材，采用标记的方法对干制辣椒雄性不育系与保持系间进行检测，以期筛选出干制辣椒雄性不育与保持系间存在多态性的标记。结果表明：在个标记中，仅有一个标记在对不育系和保持系间存在一致的多态性，该标记在不育系中分别扩增出约为和左右的片段，而在相应保持系中均未扩增出相应条带。初步认为，分子标记可用于干制辣椒雄性不育系与保持系间的分子标记辅助鉴定。关键词：干制辣椒；雄性不育；标记中图分类号： 文献标识码： 文章编号：（）辣椒（ ）属茄科辣椒属一年生或有限多年生植物，因其维生素含量高而深受消费者欢迎。辣椒雄性不育是指植物花药不能产生正常有功能的花粉的现象，通常包括花药无法产生花粉，花粉败育以及花药无法开裂这几种现象。由于辣椒杂交优势明显，目前市场上所用的大部分种子是杂交一代，但是随着国内农资以及劳动力等价格的提高，杂种一代的生产成本也逐渐增高，而雄性不育是迄今为止能够降低这一成本的有效途径之一。即插入缺失，是针对基因组中插入缺失位点而设计的标记，广泛分布于基因组，数目众多，经扩增、电泳分离以及相应的染色技术检测，得到的多态性片段即为标记，具有分布广、重复性好、检测方便、呈共显性 ， ， ：（ ）； ； ； ； 遗传等优点，被广泛用于植物遗传多样性分析、高密度遗传图谱构建、基因定位、种子纯度鉴定和分子标记辅助育种等研究领域。近年来，应用标记进行基因定位受到许多学者关注，在种质资源遗传多样性和亲缘关系等领域已有大量研究，但对于干制辣椒标记的研究尚鲜见报道。该研究以对干制辣椒雄性不育系以及相应保持系为试料，采用标记的方法对干制辣椒不育系与保持系相关标记进行筛选，以期筛选出标记，为干制辣椒不育系与保持系相关分子标记辅助选择方面提供一定参考。 材料与方法 试验材料对辣椒材料雄性不育系和相应保持系材料（，；，；，；其中和分别表示雄性不育系和保持系）由青岛农业大学园艺学院干制辣椒育种课题组提供；分布于辣椒条染色体上的对引物为等开发的辣椒标记（表），引物由上海生物工程公司合成。 试验方法 干制辣椒基因组的提取采用改良法和植物基因组提取试剂盒种方法，分别提取干制辣椒材料。改良法具体步骤如下，取样：新鲜叶片取直径的小片，加入离心管中。研磨：向离心管中加入液氮用玻璃棒充分研磨至粉末状。植物基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，按试剂盒说明书步骤，提取干制辣椒叶片基因组。 琼脂凝胶电泳检测取样品与 混匀后上样，琼脂糖凝胶（含荧光染料）电泳检测质量。电泳条件：电泳，凝胶成像系统下观察照相。 扩增利用干制辣椒引物对份样品进行扩增。反应体系为：模板（约），正反引物各， ，加至终体积；循环体系为：预变性；变性，退火，延伸，共个循环；总延伸；保存扩增产物，退火温度不是固定不变的，不同引物有不同的退火温度，将这对引物按照相近温度分为类：、。 聚丙烯酰胺凝胶电泳取扩增产物于非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，分子量大小为 的 ，电压下电泳。电泳结束后，清水冲洗玻璃板两面，使凝胶冷却，然后进行银染和显色，置于灯箱上照相。表 试验所用的引物 编号标记名称 编号标记名称 编号标记名称 编号标记名称 第期北方园艺 结果与分析 基因组质量检测将提取的干制辣椒材料基因组进行了琼脂糖电泳检测，采用种方法提取的完整性好，而且点样孔干净。但采用改良法（图）提取的纯度、质量浓度均没有植物基因组提取试剂盒（图）的高，该研究采用植物基因组提取试剂盒提取的进行了后续试验。 不育系和保持系基因组多态性引物筛选针对每对不育系和保持系均进行了对引物的检测，其中，的检测结果如图所示，在这对引物中有对（、）在不育系和保持系间存在多态性。对其它对材料也进行相同的筛选过程，其中与间有对引物（和）存在多态性；与间也有对引物（和）存在多态性。所选对引物在对不育系和保持系间的多态性比例分别为、和；而且有一对引物在对不育系和保持系间存在一致的多态性，多态性比例为。注：为；依次为编号、。下同。：；， ， ， 图改良法提取辣椒基因组电泳检测 图植物基因组提取试剂盒提取辣椒基因组电泳检测 在对干制辣椒雄性不育系与保持系间的扩增情况通过对对不育系和保持系进行的多态性引物的筛选可知（图），标记在对不育系和保持系间均存在一致的多态性，在份不育系中可同时扩增出条片段，其中条大小约为和的片段是在不育系中所特有的；而在份保持系中均扩增出条条带。可见该标记在供试的不育系和保持系间表现为显性标记。北方园艺月（上）注：为；为对引物。：； 图亲本，的聚丙烯酰胺凝胶电泳 ，图标记在不育系和保持系中的扩增结果 结论与讨论该研究以对干制辣椒雄性不育系以及保持系为试验材料，利用均匀分布于辣椒条染色体上的对引物进行了干制辣椒雄性不育系与保持系间的检测，结果筛选到对引物在供试的干制辣椒雄性不育系和保持系间存在一致的多态性。近年来，许多辣椒育种研究者在品种选育、辣椒不育机理探寻和不育基因定位上开展了大量工作。王得元等以辣椒细胞质雄性不育系及其保持系为材料开展了标记研究，并获得了个细胞质雄性不育基因相关的标记和，同时认为标记可能与保持系中的保持基因相关。 第期北方园艺王述彬等也利用技术对辣椒细胞质雄性不育系与其相应保持系的基因组进行了比较分析，并获得了不育系基因组特异的片段。魏兵强等也利用类似的方法获得了与不育基因相关的标记。这些标记对于分子辅助育种有实践意义和一定的利用价值。该试验中，利用基因组锚定标记对对干制辣椒不育系和相应保持系开展了多态性引物筛选，并从中筛选到了个稳定的多态性标记。等研究认为该标记在第号染色体上，且目的片段为；该试验中份材料在目的条带处均未表现多态性，但存在左右的多态性片段，可见该处的扩增片段为非特异性扩增。尽管该标记在对不育系和保持系间存在一致的多态性，该多态性用于区分不育系和保持系。但对于该 标记的应用范围及多态性片段的序列信息等尚需进一步研究。参考文献傅鸿妃，柴伟国，吕晓菡，等雄性不育在我国辣椒品种选育中的应用及不育基因定位研究进展现代农业科技，（）：张志刚，赵智中，李巧云，等大白菜标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用农业生物技术学报，（）：姚国新，黄文超利用水稻籼粳分化标记鉴定育种材料的籼粳属性杂交水稻，（）：葛敏，蒋璐，张晓林，等利用（）分子标记检测玉米互交种混杂的原理及应用分子植物育种，（）：申璐，沈炎林，柴敏，等采用和标记分析番茄品种基因组 多态性中国农业大学学报，（）：李斯更，沈镝，刘博，等基于黄瓜基因组重测序的标记开发及其应用植物遗传资源学报，（）： ， ， ， （ ） ，（）：谢立波，郭亚华，孟凡娟，等辣椒扩增体系的建立安徽农业科学报，（）：王得元，王鸣，郑学勤，等用分析辣椒细胞质雄性不育基因核农学报，（）：王述彬，刘金兵，潘宝贵，等辣椒细胞质雄性不育系与其保持系基因组的分析上海农业学报，（）：魏兵强，王兰兰，陈灵芝，等辣椒胞质雄性不育基因的分子标记西北农业学报，（）：， ， ， ， （ ， ， ）： （，；，；，） ， ， ， ：； ； 北方园艺月（上）