河南甘肃和新疆西瓜甜瓜病毒检测.pdf

河南、甘肃和新疆西瓜甜瓜病毒检测吴 洋 李俊香 彭 斌 古勤生*（中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）摘 要：从河南、甘肃和新疆等 3 个地区采集表现疑似病毒病症状的西瓜和甜瓜叶片样品共 132 份，采用双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA）法和反转录 PCR（RT-PCR）对其进行病毒检测，以期了解这 3 个地区的西瓜甜瓜病毒种类及分布，旨在为当地西瓜和甜瓜病毒病的防控提供参考。结果表明：瓜类蚜传黄化病毒（ Cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）的检出率最高，为57.1%，其次为小西葫芦黄花叶病毒（ Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和西瓜花叶病毒 （ Watermelon mosaic virus，WMV），检出率分别为 45.6%、38.9%，黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus，CMV）和甜瓜蚜传黄化病毒（ Melon aphid-borne yellows virus，MABYV）的检出率较低，分别为 20.0%、17.5%，而番木瓜环斑病毒西瓜株系（ Papaya ring spot virus-watermelon strain，PRSV-W）和南瓜花叶病毒（ Squash mosaic virus，SqMV）未检出，河南和新疆发现 MABYV 尚属首次。本试验发现在河南通许危害西瓜甜瓜的病毒有 ZYMV、WMV、CABYV、MABYV，在甘肃瓜州为ZYMV、CMV、CABYV，在新疆鄯善为 ZYMV、WMV、CMV、CABYV、MABYV。其中 21.2% 的样品受到 2 种病毒的复合侵染。另外，3 个地区的病毒优势种各不相同，鄯善县的优势种为 CABYV，通许县的优势种是 WMV，瓜州县的优势种是 CMV。关键词：西瓜；甜瓜；病毒；检测；复合侵染2002）。另外，瓜类蚜传黄化病毒（ Cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）自 1992 年在法国首次报道发生（Lecoq etal.，1992）以来，已陆续在全球主要瓜类种植区发现该病毒（Lemaire etal.，1993；Aboujawdah etal.，1997；Juarez etal.，2004；Kassemetal.，2007；Yard mc&nullzgnullnen，2007），我国大部分省份也有该病毒检出的报道（Shang etal.，2009）。甜瓜蚜传黄化病毒（ Melon aphid-borne yellows virus，MABYV） 是 与 CABYV 同 属的病毒，2008 年首次在中国发现（Xiang etal.，2008），目前在其他国家尚无报道，关于该病毒的研究较少。古勤生（2001）对河北、河南、山西、陕西地区的葫芦科作物进行检测，共发现了7种病毒，优势种为ZYMV和WMV；文朝慧和南志标（2013）在甘肃省河西地区的 37 份瓜类作物病毒病样品中检出30份阳性，其中WMV、CMV、ZYMV、PRSV-W、SqMV 检 出 率 分 别 为 40.5%、32.4%、21.6%、21.6% 和 8.1%。潘亚南等（2016）对侵染新疆哈密瓜的 8 种病毒进行 DAS-ELISA 和RT-PCR 检测，检出 CMV、WMV、ZYMV、TNV 等4 种病毒，其中 CMV 的检出率最高，为 70.2%。吴洋，男，硕士研究生，专业方向：分子植物病理学，E-mail：wy14530126.com* 通讯作者（Correspondingauthor）：古勤生，男，研究员，博士生导师，专业方向：植物病理学，E-mail：guqinshengcaas.cn收稿日期：2016-12-28；接受日期：2017-05-26基金项目 ：中国农业科学院创新工程“西甜瓜病虫害防控”项目（CAAS-ASTIP-2016-ZFRI），国家西甜瓜产业技术体系“病毒病害防控岗位” 项目（CARS-26-13）西瓜和甜瓜是我国重要的瓜类经济作物，瓜类病毒病一直是影响瓜果产量和质量的主要因素。1980 年 Lovisolo 首次总结出 25 种为害葫芦科作物的病毒（Lovisolo，1980），1993 年报道种类增加到29 种（Provvidenti，1993），2002 年葫芦科作物病毒确定种上升到38种，另外还有9种暂定种和1种类病毒确定种，此后又有不少新的病毒种出现。这些病毒中，危害严重且普遍发生的病毒主要有小西葫芦黄花叶病毒（ Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、西瓜花叶病毒（ Watermelon mosaic virus，WMV）、黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus，CMV）、番木瓜环斑病毒西瓜株系（ Papaya ring spot virus-watermelon strain，PRSV-W）、南瓜花叶病毒（ Squash mosaic virus，SqMV）（古勤生 等，31新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES2017（8）：31-35网络出版时间：2017-08-03 22:46:30网络出版地址：http:/kns.cnki.net/kcms/detail/11.2326.S.20170803.2246.030.html近年来，随着瓜类种植面积的扩大和品种的更新，病毒种类越来越多，症状也愈加多样，病毒病的发生日益严重。我国中部和西北地区是西瓜甜瓜的主要种植区，本试验从河南通许、甘肃瓜州和新疆鄯善3个地区采集表现疑似病毒病症状的西瓜甜瓜叶片样品，采用双抗夹心酶联免疫（DAS-ELISA）法和反转录 PCR（RT-PCR）技术进行检测，以期了解这些地区的西瓜甜瓜病毒种类及分布，旨在为当地瓜类作物病毒病的防控提供 参考。1 材料与方法1.1 样品采集2015年7月，从河南通许县西水沃村、甘肃瓜州县瓜州乡四工村、新疆鄯善县后梁村采集表现疑似病毒病症状的西瓜甜瓜叶片样品共 132 份：河南通许 60 份、甘肃瓜州 47 份、新疆鄯善 25 份（表1）。样品保存于 -80冰箱备用。表 1 采集样品信息采样地点 采样时间 （月-日） 作物 样品数 症状河南通许 07-09 甜瓜 26 黄化、花叶、畸形、无籽西瓜 20 蕨叶有籽西瓜 14甘肃瓜州 07-24 甜瓜 42 黄化、花叶、畸形、西瓜 5 斑驳新疆鄯善 07-30 甜瓜 25 黄化、花叶、褪绿1.2 主要试剂抗体包被缓冲液：碳酸钠 1.59g，碳酸氢钠 2.93g，用 1L 蒸馏水溶解，调节 pH 至 9.6。10磷酸盐缓冲液：氯化钠80 g，磷酸二氢钾 2 g，氢二钠正磷酸盐 11.5 g，氯化钾 2 g，用 1 L蒸馏水溶解，调节 pH 至 7.2。洗涤缓冲液：磷酸盐缓冲液 1 L，吐温 20 0.5mL。提取缓冲液：PBST 1L，聚乙烯吡咯烷酮 PVP20g。酶标抗体稀释缓冲液：牛血清白蛋白 BSA 0.2g，PBST100mL。底物缓冲液：二乙醇胺 10mL，氯化镁 0.11g，用 80mL 蒸馏水溶解，用浓 HCl 调节 pH 至 9.8。所用的酶联检测试剂盒均购自安德珍（ADGEN）生物技术有限公司，阳性对照样品为中国农业科学院郑州果树研究所生物技术实验室温室培养的接种毒源的甜瓜植株。植物总 RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，RNA反转录试剂盒及 TaqDNA 聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司，pTOPO 载体购自北京艾德莱生物科技有限公司，大肠杆菌 TOP10 感受态由本实验室自制。1.3 病毒样品的检测对表现花叶、畸形或蕨叶症状的样品采用DAS-ELISA 方法检测。取出样品，按 1 g10 mL的比例用提取缓冲液研磨提取组织样品。然后离心取上清，即为待检样品。分别检测ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W、SqMV 共 5 种病毒，检测步骤参考试剂盒说明书进行。以健康的甜瓜叶片为阴性对照，感病的叶片为阳性对照，缓冲液为空白对照。对部分 DAS-ELISA 阳性样品，使用已报道的 ZYMV、WMV 和 CMV 特异性引物（赵丽 等，2008）进一步进行分子鉴定。引物序列详见表 2。对表现黄化症状的叶片，采用RT-PCR进行表 2 本文使用的引物及其序列引物名称 引物序列（5-3） 参考文献WMV-F/WMV-R CGGGGGCCCTCGAATACAAGCCCAATC/CGGGGTACCGCGGCCTTCATCTGTGC 赵丽等，2008CMV-F/CMV-R CCCGGATCCTCCGCGGATGCTAACTTT/TGTCGACTCAGACTGGGAGCACC 赵丽等，2008ZYMV-F/ZYMV-R CCCGGATCCTCGGGCACTCAGCAAAC/CCCGTCGACTTACTGCATTGTATTCACAC 赵丽等，2008PoconF/PococpR TGYTCYGGTTTTGACTGG/CGTCTACCTATTTSGGRTTN Robertsonetal.，1991CA3414F/MA3669F GGATTTTCTAGCGGTCTA/CGACGACGACGAAATCCAA Shangetal.，2012检测。称取表现症状的叶片 0.1 g，加液氮迅速彻底研磨，然后按照 RNA 提取试剂盒的说明书提取植物总 RNA。以提取的总 RNA 为模板，Random 6mers 为引物进行反转录，然后利用已报道的马铃薯卷叶病毒属（ Polerovirus）通用引物 Pocon F/PococpR（Robertson etal.，1991）进行 PCR 扩增。PCR 为阳性的样品再使用特异性引物 CA3414F/MA3669F/PococpR（Shang etal.，2012）进行检测。引物序列32新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES详见表 2。取部分检测阳性样品的PCR产物连接到pTOPO 载体，转化 TOP 10 感受态细胞；通过菌液PCR 筛选阳性克隆。每个分离物至少选取 2 个克隆送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果通过 Blast 与 NCBI 上的序列进行比对。2 结果与分析2.1 花叶型疑似病毒病样的 DAS-ELISA 检测  结果对表现花叶症状的 40 份通许样品、25 份瓜州样品和 25 份鄯善样品进行 ZYMV、WMV、CMV、PRSV-W、SqMV 的 DAS-ELISA 检 测。90 份 样 品共检出 81 份阳性。河南通许县检出 17 份 ZYMV 阳性样品，检出率为 42.5%；23 份 WMV 阳性样品，检出率为57.5%；其余3种病毒未检出。甘肃瓜州县检出 7 份 ZYMV 阳性样品，检出率为 28.0%；16 份 CMV 阳性样品，检出率为 64.0%；其余 3 种病毒未检出。新疆鄯善县检出 17 份 ZYMV 阳性样品，检出率为 68.0%；12 份 WMV 阳性样品，检出率为 48.0%；2 份 CMV 阳性样品，检出率为 8.0%；PRSV-W 和 SqMV 未检出（表 3）。表 3 瓜类病毒的 DAS-ELISA检测结果采样地点样品检测数ZYMV WMV CMV PRSV-W SqMV检出数 检出率/% 检出数 检出率/% 检出数 检出率/% 检出数 检出率/% 检出数 检出率/%河南通许县 40 17 42.5 23 57.5 0 0 0 0 0 0甘肃瓜州县 25 7 28.0 0 0 16 64.0 0 0 0 0新疆鄯善县 25 17 68.0 12 48.0 2 8.0 0 0 0 0总计 90 41 45.6 35 38.9 18 20.0 0 0 0 0所检测样品中，ZYMV的检出率最高，三地平均为45.6%，是发生范围最广的流行病毒优势种；其次为 WMV、CMV，三地平均检出率分别为38.9%、20.0%。3 个地区中，鄯善县检出病毒种类最多，有 3种，其中 ZYMV 的检出率最高，为 68.0%，是当地流行病毒优势种；通许县有 ZYMV 和 WMV 2 种，其中 WMV 的检出率最高，为 57.5%，是当地流行病毒优势种；瓜州县有 ZYMV 和 CMV 2 种，其中CMV 的检出率最高，为 64.0%，是当地流行病毒优势种。为确证血清学检测结果，对部分ELISA检测阳性的样本进行 ZYMV、WMV 和 CMV 的 RT-PCR检测，从 ZYMV、WMV、CMV 阳性的样品中分别扩增出 841、458、580 bp 的特异条带，与预期的目标条带大小一致（赵丽等，2008）。2.2 黄化型疑似病毒病样的 RT-PCR检测结果对3个地区共63份表现黄化症状的样品进行 RT-PCR 检测，用通用引物 Pocon F/PococpR 进行检测时，有47份样品出现目的条带，表明为Polerovirus 病毒侵染；再使用特异性引物 CA3414F/MA3669F/PococpR 进行检测，36 份样品为 CABYV阳性，三地平均检出率为57.1%；11份样品为MABYV 阳性，三地平均检出率为 17.5%（表 4）。随机选取 25 份 CABYV 阳性和 11 份 MABYV阳性样品的 PCR 产物连接载体后，送样测序。测序结果经 Blast 与 NCBI 上的序列比对分析，结果表明这些序列与 NCBI 上的序列相似性在 98% 以上，证明检测到的是目的病毒，与RT-PCR检测结果 一致。表 4  CABYV 和 MABYV的 RT-PCR检测结果采样地点样本检测数CABYV MABYV检出数 检出率/% 检出数 检出率/%河南通许县 28 11 39.3 10 35.7甘肃瓜州县 20 12 60.0 0 0新疆鄯善县 15 13 86.7 1 6.7总计 63 36 57.1 11 17.52.3 检测结果汇总对 所 采 样 品 进 行 RT-PCR 和 DAS-ELISA检测，检测结果如下：河南通许检出ZYMV、WMV、CABYV 及 MABYV，检出率分别为 42.5%、57.5%、39.3%、35.7%； 甘 肃 瓜 州 检 出 ZYMV、CMV 及 CABYV，检出率分别为 28.0%、64.0%、60.0%； 新 疆 鄯 善 检 出 ZYMV、WMV、CMV、CABYV 及 MABYV， 检 出 率 分 别 为 68.0%、48.0%、8.0%、86.7%、6.7%。PRSV-W 和 SqMV 在33新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES三地均未检出。在检测呈阳性的样品中，94 个样品由单一病毒侵染，28 个样品为复合侵染。在通许县 60 份样品中，8 份为复合侵染，复合侵染率为 13.3%；瓜州县47份样品中，7份为复合侵染，复合侵染率为 14.9%；在鄯善县 25 份样品中，13 份为复合侵染，复合侵染率为 52.0%。三地平均复合侵染率为21.2%。3 结论与讨论病毒病一直是威胁西瓜甜瓜生产的重要因素，近年来，随着我国西甜瓜栽培面积和病毒种类的增加，病毒病危害程度愈加严重，了解不同地区病毒种类的分布以及流行病毒优势种，有助于防范地域性病毒病和新病害的扩散。魏宁生等（1991）在甘肃、新疆共186个厚皮甜瓜样品中检出CMV、WMV-2、SqMV 3 种 病 毒， 其 中 WMV-2 是 流 行优势种。古勤生等（2003）在河南和陕西的葫芦科 作 物 上 检 出 WMV、ZYMV、CMV、CABYV、PRSV-W、SqMV 等，并确定这 2 个地区的流行病毒优势种为WMV和ZYMV，其检出率分别为86.9%、78.6%。本试验在河南省通许县、甘肃省瓜州县、新疆鄯善县 3 个地区共 132 份西瓜甜瓜病毒病样品中检出 ZYMV、WMV、CMV、CABYV、MABYV 等 5 种病毒。CABYV 的检出率最高，为57.1%，且在 3 个地区均检出，表明该病毒的分布范围最广。有报道称新疆哈密瓜上的病毒病复合侵染现象严重，复合侵染率高达60.19%（潘亚南 等，2016），本试验发现新疆鄯善县病毒病复合侵染也很普遍，复合侵染率为 52.0%。有关甘肃省河西地区瓜类作物病毒病的研究发现，复合侵染率与新疆地区相比偏低很多，为27%（文朝慧和南志标，2013），而本试验中甘肃瓜州县的复合侵染率也较低，为 14.9%，河南通许县的复合侵染率更低，仅为 13.3%。同时，我们发现这 3 个地区的病毒优势种各不相同，鄯善县的优势种为 CABYV，通许县的优势种是 WMV，瓜州县的优势种是 CMV，3 个地区的病毒优势种不同，可能与当地栽培的作物和环境条件有关。CABYV和MABYV均属于马铃薯卷叶病毒属（ Polerovirus），主要引起瓜类作物叶片黄化症状。CABYV自1992年发现以来，在世界各地多有报道，而 MABYV 的报道则相对较少（Xiang etal.，2008；Knierimetal.，2010）。本试验在河南通许、甘肃瓜州和新疆鄯善均检出 CABYV，而 MABYV 只在河南通许和新疆鄯善检出，并且鄯善仅检出 1 例。本试验系首次在河南和新疆发现 MABYV。目前，这 2种病毒在我国的研究报道较少，尤其是 MABYV，其生物学特性、传播特性及地理分布尚无详细报道。这2种病毒均可通过蚜虫传播，极易造成病毒的大范围扩散，需引起高度重视，加强监测 工作。本试验对河南通许、甘肃瓜州和新疆鄯善 3 个地区的西瓜甜瓜进行DAS-ELISA和RT-PCR检测，鉴定了当地的主要病毒种类。但侵染葫芦科作物的病毒种类繁多，本试验只检测了其中部分病毒，可能有其他病毒未被检出，因此建立高通量、高灵敏度的检测方法，对于监控病毒流行，防止病毒病的蔓延极为重要。同时，本试验受到地域限制，仅采集了 3 个省份的样品进行检测，对于侵染葫芦科作物的主要病毒在我国的分布，还有待进一步 研究。参考文献古勤生2001葫芦科主要作物病毒的鉴定和小西葫芦黄花叶病毒的变异性博士论文北京：中国农业大学古勤生，范在丰，李怀方2002葫芦科作物病毒名录中国瓜 菜，（1）：45-47古勤生，Roggero P，Ciuffo M，Lenzi R，黄学森，李怀方2003我国北方地区葫芦科作物病毒病的调查与病原鉴定云南农业大学学报：自然科学版，18（S1）：88-89潘亚南，韩剑，吴海波，吉艳玲，王纯利，刘芳，罗明，张祥林2016新疆哈密瓜病毒的 DAS-ELISA 检测和分子鉴定园艺学报，43（6）：1107-1116魏宁生，张满良，吴云峰，魏勇良1991新疆、甘肃甜瓜病毒病的鉴定及防治植物保护学报，18（1）：81-85文朝慧，南志标2013甘肃省河西地区瓜类作物病毒病的病原鉴定西北农林科技大学学报：自然科学版，41（12）：131- 137赵丽，古勤生，陈红运，史团省，田延平，胡京昂2008葫芦科作物 3 种主要病毒的多重 RT-PCR 方法的建立果树学报，（5）：703-707AboujawdahY，Sobh H，Fayyad A1997First reportofCucurbit aphid-borne yellows luteovirusinLebanonPlant Disease，81 （11）：133134新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLESJuarezM，Truniger V，Aranda MA2004First reportofCucurbit aphid-borne yellows virusinSpainPlantDisease，88（8）：907KassemMA，Sempere RN，Juarez M，Aranda MA，Truniger V2007 Cucurbit aphid-borne yellows virusisprevalentinfield-growncucurbitcropsofSoutheasternSpainPlantDisease，91（3）：232-238KnierimD，Deng TC，Tsai WS，Green SK，Kenyon L2010MolecularidentificationofthreedistinctPolerovirusspeciesandarecombinantCucurbit aphid-borne yellows virusstraininfectingcucurbitcropsinTaiwanPlantPathology，59（5）：991-1002LecoqH，Bourdin D，Wipfscheibel C，Bon M，Lot H，Lemaire O1992Anewyellowingdiseaseofcucurbitscausedbya luteovirus，Cucurbit aphid-borne yellows virusPlant Pathology，41（6）：749-761LemaireOJ，Gubler WD，Valencia J，Lecoq H，Falk BW1993FirstreportofCucurbit aphid-borne yellows luteovirusintheUnitedStatesPlantDisease，77：1169LovisoloO1980Virus andviroiddiseasesofcucurbitsActa Horticulturae，88：33-82ProvvidentiR1993Resistance toviraldiseasesofcucurbits/KyleMMResistance toViralDiseasesofVegetables：Genetics andBreedingPortland：TimberPress：8-43RobertsonNL，French R，Gray SM1991Use ofgroup-specificprimersandthepolymerasechainreactionforthedetectionandidentificationofluteovirusesJournalofGeneralVirology，72（6）：1473-1477ShangQX，Xiang HY，Han CG，Li DW，Yu JL2009Distributionandmoleculardiversityofthreecucurbit-infectingpolerovirusesinChinaVirusResearch，145（2）：341-346ShangQX，Xiang HY，Han CG，Li DW，Yu JL2012Rapid detectionanddifferentiationofthreecucurbit-infectingpolerovirusesbymultiplexRTPCRJournal ofAgriculturalScience，4（4）：209-216XiangHY，Shang QX，Han CG，Li DW，Yu JL2008First reportontheoccurrenceofCucurbit aphid-borne yellows virus onninecucurbitaceousspeciesinChinaPlant Pathology，57（2）：390YardmcN，null zgnullnenH2007First reportofCucurbit aphid-borne yellows virusinTurkeyAustralasian PlantDiseaseNotes，2 （1）：5Detection of Viruses Infecting Watermelon and Melon in Henan， Gansu Provinces and Xinjiang Autonomous RegionWUYang，LIJun-xiang，PENGBin，GUQin-sheng*（ ZhengzhouFruitResearchInstitute， ChineseAcademyofAgriculturalSciences， Zhengzhou450009， Henan， China）Abstract：132 sampleswithsuspectedvirus-likesymptomswerecollectedfromHenan，Gansu ProvincesandXinjiangAutonomousRegionVirus detectionwascarriedoutbyDoubleAntibodySandwichEnzymeLinkedImmunosorbentAssay（DAS-ELISA）and Reversetranscriptpolymerasechainreaction（RT-PCR），hopingtounderstandthevirusspeciesinfectingwatermelonandmelongrowninthese3areasandtheirdistribution TheresultsshowedthatthedetectionratesofCucurbit aphid-borne yellows virus（CABYV）， Zucchini yellow mosaic virus（ZYMV）， Watermelon mosaic virus（WMV）， Cucumber mosaic virus（CMV）， Melon aphid-borne yellows virus（MABYV） amongthe132detectedsampleswere57.1%，45.6%，38.9%，20.0%，17.5%，respectively，whereas Papaya ring spot virus-watermelon strain（PRSV-W） andSquash mosaic virus（SqMV）were notdetectedIt wasthefirsttimetofindMABYVinHenanProvinceandXinjiangAutonomousRegionThis studyalsofoundthatZYMV，WMV，CABYV，MABYV occurredinHenanProvince；ZYMV，CMV，CABYVinGansuProvince；ZYMV，WMV，CMV，CABYV，MABYVinXinjiangAutonomousRegion21.2%ofthesesamplesweremix-infectedby2virusesBesides，the virusdominantspeciesweredifferentfromeachotherinthese3areas，implying thedistributionswereassociatedwithenvironmentalconditionandcultivarsgrownKey words：Watermelon；Melon；Virus；Detection；Mix-infectionYardmcN，35新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控 研究论文中 国 蔬 菜     CHINA VEGETABLES