茄子褐纹病病菌种类和药剂敏感性研究 (1).pdf

DOI 10 3865 j issn 1001 3547 2025 08 007 吴仁锋 男 武汉市农业科学院蔬菜研究所正高职高级农艺师 湖北省 植物病理学会副理事长 武汉市 十百千人才工程 人选 武汉市青 年岗位能手 农业农村部农药登记药效试验杀菌剂项目技术负责 人 主要从事植保专业技术工作 重点开展蔬菜病害的诊断和综合 防控技术研究 以及相关的技术推广工作 近年来 作为主要完成人 获得农业农村部农牧渔业丰收奖1 项 湖北省科技进步二等奖1项 武汉市科技进步二等奖2项 取 得湖北省科技成果4项 武汉市科技成果4项 申报国家发明专利 7项 取得授权发明专利2项 实用新型专利 3 项 发表科研论文 80多篇 茄子褐纹病病菌种类和药剂敏感性研究 冯吉 1 张传清 1 王宏 1 2 1 浙江农林大学现代农学院 杭州临安 311300 2 杭州市农业科学研究院 茄子 Solanum melongena L 作为一种重要蔬 菜 在中国各省均有栽培 根据联合国粮食及农业 组织统计 2021年我国茄子总产量占世界茄子总产 量的 63 9 1 杭茄系列是浙江地区种植的主要品 种 其特点是果实细长线条形 肉质软嫩 产量高 抗逆性强 适合在浙江地区高湿环境中生长 2 茄子褐纹病又称褐腐病 是茄子主要病害之 一 从苗期到成株期均可产生为害 以为害果实为 主 最初在果实表面形成褐色圆形病斑 病部着生 小黑点 并组成明显的轮纹 最后软腐脱落 3 茎部 感染病原菌 病斑呈梭形 并散生小黑点 严重时木 质部外露 整株枯死 茄子褐纹病病原菌有性态为 间座壳属 Diaporthe 无性态为拟茎点霉 Phomopsis 国内之前报道引起茄子褐纹病的病原 菌有拟茎点霉 P longicolla 和 P vexans 4 5 国外 报 道 侵 染 茄 子 的 间 座 壳 菌 有 D arecae D melongenae D passifloricola D solani melongenae D talong和D vexans 其中D vexans为优势种类 6 目 前 国外对茄子褐纹病病原菌的鉴定通常采用形态 学和分子生物学结合的方法 但国内研究茄子褐纹 摘 要 褐纹病是茄子主要病害之一 严重影响茄子产量和品质 早期研究报道茄子褐纹病病原菌主要为褐纹拟茎 点霉 Phomopsis vexans 为明确茄子褐纹病病菌种类 对褐纹病病菌进行了分离 鉴定 对发病及健康样品进行了 ITS 扩增子测序 研究结果表明 结合形态学和分子生物学方法 分离获得的褐纹病病菌鉴定为 Diaporthe vexans D sojae 和 D unshiuensis 3 种 对健康和发病茄子植株微生物群落分析发现 褐纹病的发生水平与间座壳菌丰度相关 采用菌丝生长速率法测定了 3 种病菌对 4 种杀菌剂的敏感性 研究结果表明 戊唑醇 咪鲜胺 丙硫菌唑和吡唑醚菌 酯对茄子褐纹病病原菌生长均有明显抑制作用 其中咪鲜胺抑菌活性最强 平均 EC 50 值为 0 019 g mL 研究结果为 茄子褐纹病的防治提供了基础和依据 关键词 茄子褐纹病 间座壳菌 病原菌鉴定 药剂敏感性 中图分类号 S436 421 1 3 文献标识码 A 文章编号 1001 3547 2025 08 0022 06 2025 8 冯吉 1999 女 在读硕士 研究方向为资源利用与植物保 护 E mail 1208996232 王宏 1981 女 通讯作者 硕士 高级农艺师 主要从事蔬 菜新品种选育与栽培技术研究工作 E mail hongwang201010 收稿日期 2024 12 09 22 表 1 用于扩增茄子间座壳属 ITS TEF1 的引物 基因 引物名称 序列 5 3 参考文献 ITS ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 13 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC TEF1 EF 1F 728 CATCGAGAAGTTCGAGAAGG 14 EF 1R 986 TACTTGAAGGAACCCTTACC 表 2 敏感性测定中不同药剂处理质量浓度 g mL 药剂 质量浓度 戊唑醇 0 01 0 05 0 25 0 50 1 00 咪鲜胺 0 006 25 0 012 50 0 025 00 0 050 00 0 125 00 丙硫菌唑 0 01 0 05 0 25 0 50 1 00 吡唑醚菌酯 0 002 0 010 0 050 0 250 0 500 病病原菌的文献较老 以形态学鉴定为主 因此 鉴 定到的褐纹病菌种类较少 7 且在中国农药信息网 还未查询到针对茄子褐纹病登记的防治药剂 生产 上常使用百菌清 代森锰锌和克菌丹等药剂防治 8 但由于这些药剂频繁使用 出现了防治效果下降的 现象 因此筛选适宜的防治药剂有助于及时控制病 害发生 提质增效 本研究针对综合形态学和分子生物学等对茄 子褐纹病病原菌进行鉴定 使用 ITS 扩增子测序分 析健康和发病植株间座壳菌 Diaporthe 相对丰度 并测定不同种类对药剂的敏感性 以期为茄子褐纹 病准确鉴定及田间防控措施的制定提供支撑 1 材料与方法 1 1 供试药剂与供试培养基 试剂 97 戊唑醇原药 Tebuconazole 江苏扬 农化工集团有限公司 97 咪鲜胺原药 Prochloraz 浙江天丰生物科学有限公司 95 吡唑醚菌酯原药 Pyraclostrobin 浙江新农化工股份有限公司 97 丙硫菌唑原药 Prothioconazole 江西正邦化工有限 公司 将4种药剂原药使用甲醇配制成质量浓度为 1 10 5 g mL的母液 于4 保存备用 马铃薯葡萄糖琼脂 PDA 培养基 马铃薯200 g 葡萄糖20 g 琼脂粉16 g 用无菌水定容至1 L 1 2 病原菌采集与分离 2023年8月 在临安区发现茄子植株大量枯萎 死亡 其果实产生褐色凹陷病斑 并密生轮纹小黑 点 茎秆上产生梭形水浸状病斑 着生大量小黑点 初步判断为茄子褐纹病 将发病植株样本采用组织 分离法 9 取茄子病健交界处的组织 5 mm 5 mm 用 75 酒精消毒 30 s 用 2 NaClO 液消毒 40 s 用无菌水冲洗 3 次 晾干后放于 PDA 培养基上 在 25 恒温培养箱黑暗培养3 5 d后 取菌落边缘菌 丝块放于 PDA 平板上生长产孢 产孢后配制孢子 悬浮液涂板 挑取单个孢子纯化菌株 共分离获得 26株单孢菌株 保存用于后续鉴定与其他试验 1 3 病原菌致病性测定 茄子褐纹病菌致病性测定 10 选取健康无病的 茄子果实 使用烧热的直径 5 mm 的打孔器取果实 表皮 将活化3 d 的菌株边缘打取5 mm菌碟 覆盖 在茄子伤口处 以PDA空白作对照 CK 随机挑选 9 株不同形态的代表性菌株进行接种 每菌株接种 3 个茄子 每个茄子接种 9 个菌碟 置于 25 条件 下培养5 d后 观察发病情况 1 4 病原菌形态学观察 选上述 9 株菌株进行形态学观察 将菌株在 PDA 培养基上活化 3 d 用直径 5 mm 的打孔器在 边缘打取菌碟 每菌株打 3 个菌碟 每个菌碟转接 至1个新 PDA 平板后于 25 黑暗培养 菌丝长满 PDA平板后观察菌落形态特征 产孢子后 用显微 镜观察孢子形态 根据菌落形态和孢子特征参考王 先洪等 11 的方法进行病原菌初步鉴定 1 5 病原菌分子生物学鉴定 使用CTAB 法提取 ED6 ED8 和 ED9 3 株菌株 的DNA 使用表1引物扩增出核糖体内转录间隔区 Internal transcribed spacer ITS 翻译延长因子 Translation elongation factor 1 TEF1 反应体系 及程序参考赖多等 12 的方法 PCR产物由北京擎科 生物科技股份有限公司进行测序 将测序结果在 NCBI 中进行 BLAST 比对 下载标准菌株序列信 息 将菌株序列在MEGA软件中矫正后串联单个基 因 以 D ampelina CBS 267 80 作为外群 使用贝叶 斯法 Bayesian 构建系统发育树 1 6 褐纹病发生与微生物群落关系 于2023 年8月在临安区采集茄子植株 设健 康和发病 2 个处理 每处理 3 株 将植株分为上部 分枝 中部 嫁接口 和下部 主干 3 个部位分别 取样分析 每个部位重复3次 将样品研磨混匀后 使用TGuide S96磁珠法DNA提取试剂盒提取不同 部位样品的总DNA 扩增真菌的ITS rDNA ITS1区 片段 对扩增PCR产物进行纯化 定量和均一化处 理 文库采用Qsep 400方法进行质检 满足指标后 可上机检测 合格的文库在 Illumina Novaseq 6000 上进行测序 将高通量测序获得的原始图像数据文 2025 8 23 件通过碱基识别 Base calling 分析转换成原始测序 读长 Raw sequenced reads 测序结果保存在FASTQ 格式文件中 将Raw Reads去除序列后进行拼接和过 滤 使用QIME2 2020 6软件dada2去噪和去除嵌合 体序列 15 得到最终序列数据 1 7 药剂筛选 采用菌丝生长速率法 16 将 ED6 ED8 和 ED9 3 株菌株在PDA培养基上活化3 d后 根据药剂浓度 配制含梯度药剂的PDA平板 表2 使用直径5 mm 的打孔器在菌落边缘打取菌碟 将菌碟接种至含不 同浓度药剂的 PDA 平板上 以不含药但含相同溶 剂的 PDA 平板作对照 CK 1 每个平板接种 1 个菌 碟 每个菌碟每个浓度重复3个PDA平板 将接种 后的 PDA 平板放入 25 黑暗条件下培养 5 d 后 采用十字交叉法测量菌落的直径 抑制率 对照组菌落直径 处理组菌落直 径 对照组菌落直径 菌碟原始直径 100 1 8 数据分析 使用SPSS软件计算不同药剂对病原菌的抑制 中浓度 EC 50 值 和毒力回归方程 2 结果与分析 2 1 病原菌分离与致病性测定 对样本进行组织分离后得到 26 株菌株 根据 形态特征进行初步分类 随机挑选9株不同形态的 代表性菌株进行致病性测定 结果表明 接种后5 d 茄子开始出现发病症状 接种后 11 d 接种茄子全 部发病 均出现褐色病斑 表明分离的菌株对茄子 均有致病性 图1 2 2 病原菌形态学特征 根据菌落形态特征 9株菌可分为3类 分别以 ED6 ED8 ED9 为代表菌株 图 2 4 ED6 菌落白 色毛毡状 气生菌丝发达形成同心轮纹 菌落在 PAD培养基上呈现淡黄色 培养 20 d 后 菌丝上散 生大量黑色分生孢子器 ED8菌丝较稀疏 菌落正 面为白色 背面有黄色色素沉积 培养 20 d 后产生 少量分生孢子器 ED9菌丝白色稀疏状 气生菌丝 不发达 菌落正面与背面均为白色 培养 20 d 后产 生的黑色分生孢子器较少 对3种菌落镜检分生孢 子 发现均产生两种类型的分生孢子 一种为 型 分生孢子 卵圆形单孢 含有两个油球 另一种为 型分生孢子 孢子线形 无油球 2 3 病原菌系统发育分析 对供试菌株 ITS TEF1 片段测序后分别得到 550 bp 和 340 bp 的序列 将序列在 NCBI 中进行 BLAST 比对 在 GenBank 中下载相关的模式菌株 序列 表 3 进行联合系统发育树分析 17 18 建树结 果表明 图 5 分离的菌株属于 3 个分支 供试菌 株 ED6 位于 D vexans 种群内 ED8 与 D sojae 归 为一类 ED9与D unshiuensis为一类 结合形态特 征 将茄子褐纹病病原菌鉴定为D vexans D sojae和 D unshiuensis 3种 2 4 褐纹病发生与微生物群落关系 对茄子健康和发病植株微生物群落进行测序 分析 真菌共得到 2 236 个 OTUs 分别属于 13 个 门 45 个纲 105 个目 224 个科 457 个属和 656 个 种 对不同样品不同部位的物种相对丰度进行分 析 发现健康植株分枝 主干和嫁接口的Shannon 指数值分别为 6 313 2 6 095 9 和 6 142 4 发病植 株分枝 主干和嫁接口的 Shannon 指数值分别为 6 372 6 5 666 0和5 051 4 Shannon指数越大说明 样品的物种多样性越高 因此 发病植株分枝处的 物种多样性高于健康分枝处 而在其他部位的物种 多样性小于健康植株 对不同部位间座壳菌多样性进行分析 发现健 康植株上部分枝处间座壳菌相对丰度为 0 而嫁接 口和主干处间座壳菌相对丰度分别为 0 004 3 和 0 004 5 发病植株上部 嫁接口 茎基部均存在间 座壳菌 且上部植株间座壳菌 相对丰度为1 327 6 间座壳 菌分布最多 中部和下部分别 为0 076 0 和0 062 4 表4 2 5 药剂筛选 选 3 个不同菌种的菌株 ED6 D vexans ED8 D sojae ED9 D unshiuensis 作供试菌株 药剂筛选试验 图 1 茄子褐纹病菌致病性测定 注 A 对照 CK B C D分别为 ED6 ED8 ED9 均是茄子接种后 11 d的发病表现 2025 8 24 结果表明 表 5 戊唑醇 咪鲜胺 丙硫菌唑和吡唑 醚菌酯对茄子褐纹病病菌 均有较好的抑菌效果 戊 唑醇对间座壳菌的EC 50 值 在 0 048 0 250 g mL 平 均值为 0 137 g mL 咪鲜 胺对间座壳菌的EC 50 值在 0 002 0 033 g mL 平均 值为 0 019 g mL 丙硫菌 唑对间座壳菌的EC 50 值在 0 329 0 679 g mL 平均 值为 0 530 g mL 吡唑醚 菌酯对间座壳菌的EC 50 值 在 0 008 0 060 g mL 平 均值为0 033 g mL 表明 咪鲜胺对 3 种菌种的抑菌 活性最强 3 讨论与结论 茄子褐纹病病原菌 有 性 态 为 间 座 壳 属 Diaporthe 无性态为拟 近点霉属 Phomopsis Diaporthe 作为植物内生菌 和致病菌 19 是引起作物病 害的主要病原菌之一 包 括根腐病 果腐病 叶斑病 和枯萎病等 20 间座壳属只鉴定形态 特征往往不准确 因此发 展了结合分子生物学的系 统鉴定方法 Aumentado等 6 通过多基因系统发育分析 鉴定出侵染茄子的间座壳 菌有D solani melongenae D talong D melongenae D arecae D passifloricola 和 D vexans 其中 D vexans 为多个国家引起茄子病害 的主要病原菌 本研究结合形态学和分子生物学的 方法 利用 ITS 和 TEF 鉴定出茄子褐纹病菌有 D vexans D sojae D unshiuensis 3种 目前国内鉴定 到的茄子褐纹病菌大部分为P vexans 是D vexans 的无性态 据报道 D sojae是引起大豆茎枯病和柑 橘褐腐病的病原菌 21 D unshiuensis 在中国首次报 表 3 本研究构建系统发育树的间座壳属真菌 GenBank 登录号 种 菌株号 寄主 采集地 基因登录号 ITS TEF D ampelina CBS 267 8 葡萄 意大利 KC343018 KC343744 D arctii CBS 139280 牛蒡 奥地利 KJ590736 KJ590776 D guangdongensis ZHKUCC20 0014 柚 中国 MT355684 MT409338 D helianthi CBS 592 81 向日葵 塞尔维亚 KC343115 KC343841 D hordei CBS 481 92 青稞 挪威 KC343120 KC343846 D longispora CBS 194 36 茶子属 加拿大 KC343135 KC343861 D neoarctii CBS 109490 豚草 美国 KC343145 KC343871 D sojae FAU635 大豆 美国 KJ590719 KJ590762 D tectonendophytica MFLUCC 13 0471 柚木 泰国 NR 147591 KU749367 D unshiuensis CGMCC 3 17566 金柑 中国 KJ490584 KJ490463 D unshiuensis CFCC 52594 美国山核桃 中国 MH121529 MH121571 D vexans CBS 127 14 茄 美国 KC343229 KC343955 D vexans FAU597 茄属 多米尼加 KJ590734 KJ590774 图 2 菌株 ED6在 PDA上的形态特征 注 A 菌落正 背面形态 B 分生孢子器 C 型分生孢子 D 型分生孢子 标尺 20 m 图 3 菌株 ED8在 PDA上的形态特征 注 A 菌落正 背面形态 B 分生孢子器 C 型分生孢子 D 型分生孢子 标尺 20 m 图 4 菌株 ED9在 PDA上的形态特征 注 A 菌落正 背面形态 B 分生孢子器 C 型分生孢子 D 型分生孢子 标尺 20 m 2025 8 25 表 5 4 种杀菌剂室内毒力测定 药剂 菌株 毒力回归方程 EC 50 值 g mL 1 戊唑醇 ED6 y 2 488x 2 346 0 114 ED8 y 0 935x 0 563 0 250 ED9 y 1 396x 1 845 0 048 咪鲜胺 ED6 y 2 350 x 3 926 0 021 ED8 y 1 806x 2 668 0 033 ED9 y 0 947x 2 492 0 002 丙硫菌唑 ED6 y 1 693x 0 285 0 679 ED8 y 2 912x 0 687 0 581 ED9 y 2 781x 1 344 0 329 吡唑醚菌酯 ED6 y 2 070 x 2 528 0 060 ED8 y 1 029x 1 574 0 030 ED9 y 0 892x 1 888 0 008 表 4 发病和健康茄子植株不同部位间座壳菌相对丰度 样品 上部 中部 下部 健康 0 0 004 3 0 004 5 发病 1 327 6 0 076 0 0 062 4 道是柑橘相关的内生真菌 此后发现其是多种作物 的病原菌 22 通过对健康和发病茄子植株真菌结构多样性 分析发现 发病植株分枝处的物种多样性高于健康 分枝处 而在其他部位的物种多样性小于健康植 株 茄子褐纹病病菌间座壳菌 大量存在于发病植株分枝处 少量存在于嫁接口和植株主 干部位 而健康植株分枝处无 间座壳菌分布 嫁接口和主干 存在极少间座壳菌分布 Xu 等 23 研究结果表明 引起茄 子植株枯萎的部分原因是 Diaporthe 感染地上组织 因 此 茄子褐纹病可能是由间座 壳菌侵染上部枝条引起的 因 研究采集的样品数量有限 健 康和发病茄子植株真菌结构 多样性结果还需进一步验证 研究采用菌丝生长抑制 法测定了 4 种药剂对间座壳 属病原菌的活性 发现 4 种药 剂对间座壳属病原菌均有抑 制作用 其中以咪鲜胺的抑制 效果最好 此前对茄子褐纹病 防治药剂进行室内毒力测定 发现 6 种杀菌剂中以咪鲜胺 的抑制作用最强 与本研究结 果基本一致 对于防治间座壳 属病原菌的药剂 本研究仅在 室内进行测定 田间防治情况 还有待进一步试验 参考文献 1 惠志明 张树根 邓晓梅 等 不 同类型茄子果实主要营养成分 和氨基酸含量分析 J 中国蔬菜 2024 3 97 103 2 张雅 郑积荣 何建仙 等 杭茄 系列茄子品种的杂交制种技术 J 中国蔬菜 2002 1 47 3 李涛 黎振兴 李植良 等 茄子 褐纹病的研究现状与展望 J 中 国农学通报 2015 31 5 108 115 4 吴仁锋 杨绍丽 杨德枝 茄子褐纹病病原鉴定及其生物 学特性研究 J 中国蔬菜 2013 4 80 85 5 Shu C Chen J Huang H et al First report of Phomopsis longicolla causing stem canker of eggplant in Guangdong China J Plant Disease 2014 3 98 426 图 5 基于 ITS 和 TEF1 串联构建系统发育树 注 数值表示自展值 下方的标尺表示遗传距离 2025 8 26 Study on Pathogen Species and Fungicide Sensitivity of Eggplant Brown Rot Disease FENG Ji 1 ZHANG Chuanqing 1 WANG Hong 1 2 1 College of Advanced Agricultural Sciences Zhejiang A 2 Hangzhou Academy of Agricultural Sciences Abstract Eggplant brown rot is one of the main diseases of eggplant which seriously affects the yield and quality of eggplant Early studies have reported that the pathogen of eggplant brown rot is mainly Phomopsis vexans In order to clarify the pathogen species the pathogen was isolated and identified the diseased and healthy eggplant samples were analyzed through ITS amplicon sequencing The results showed that the isolated pathogens were identified as Diaporthe vexans D sojae and D unshiuensis by morphological and molecular biological methods The microbial community analysis of healthy and diseased plants showed that the occurrence level of eggplant brown rot disease was related to the abundance of D spp The sensitivity of the above three pathogens to four fungicides was determined by mycelial growth rate method The results indicated that tebuconazole prochloraz prothioconazole and pyraclostrobin had obvious inhibitory effects on the colony growth among which prochloraz showed the highest inhibitory activity with an average EC 50 value of 0 019 g mL The results provide a basis for the prevention and control of eggplant brown rot disease Key words Eggplant brown rot Diaporthe Pathogen identification Fungicide sensitivity 6 Aumentado H D Balendres M A et al Novel species and new records of Diaporthe causing eggplant leaf and fruit blight in the Philippines J Mycol Progress 2024 23 1 23 7 衡周 孙小晴 黄俊霖 等 茄子褐纹病菌的分离鉴定及产 孢条件的优化 J 广东农业科学 2020 47 6 56 62 8 任长清 茄子褐纹病及蚜虫的防治 J 农业与技术 2016 36 14 107 9 张超 王玉梓 王照琪 等 槟榔间座壳菌叶斑病病原鉴定 及生物学特性 J 热带生物学报 2025 16 1 79 86 10 张蕊 杨石有 刘晓妹 等 芒果炭疽菌致病力室内快速 测定方法研究 J 黑龙江农业科学 2016 8 51 54 11 王先洪 姜佳琦 洪霓 等 贵州梨芽枯间座壳菌属Diaporthe 的种类 J 菌物学报 2022 41 8 1 151 1 164 12 赖多 王德林 周国昌 等 余甘子斑点病病原菌鉴定 生 物学特性及防治药剂筛选 J 南方农业学报 2024 55 2 479 488 13 White T J Bruns T Lee S J Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics M PCR protocols A guide to methods and applications 1990 315 322 14 Carbone I Kohn L M A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes J Mycologia 1999 91 3 553 556 15 Callahan B J Mcmurdie P J Rosen M J et al DADA2 High resolution sample inference from Illumina amplicon data J Nature Methods 2016 13 7 581 583 16 朱璨 江山市柑橘病虫害调查及黑点病的发生与防治 D 杭州 浙江农林大学 2023 17 Norphanphoun C Gentekaki E Hongsanan S et al Diaporthe Formalizing the species group concept J Mycosphere 2022 13 1 752 819 18 李媛 石凌波 费诺亚 等 蓝莓间座壳茎溃疡病病原鉴 定及生物学特性研究 J 植物保护 2017 43 1 89 94 19 Zhao X L Li K N Zheng S j et al Diaporthe diversity and pathogenicity revealed from a broad survey of soybean stem blight in China J Plant Disease 2022 106 2 892 2 903 20 Mahadevakumar S Janardhana G R Leaf blight and fruit rot disease of brinjal caused by Diaporthe vexans Phomopsis vexans in six agro ecological regions of south west India J Plant Pathology Quarantine 2016 6 1 5 12 21 Xiao Y S Zou M Y Zhou X et al First report of postharvest fruit brown rot disease on navel orange caused by Diaporthe sojae in China J Plant Disease 2023 3 107 948 22 Huang F Udayanga D Wang X et al Endophytic Diaporthe associated with citrus A phylogenetic reassessment with seven new species from China J Fungal Biology 2015 119 5 331 347 23 Xu X Minja R Kizito E B et al Amplicon sequencing identified a putative pathogen Macrophomina phaseolina causing wilt in African eggplant Solanum aethiopicum grown in Tanzania and Uganda J Frontiers in Agronomy 2024 5 1 300 324 2025 8 27