干热处理在防治西瓜和蒲瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒上的研究_廖慧敏.pdf

干热处理在防治西瓜和蒲瓜黄瓜 绿斑驳花叶病毒上的研究 廖慧敏 王婉婷 王雨晴 程佳雨 梁金方 包卫国 近年来 随着作物栽培模式和栽培面积的不 断扩大 地域间的种子运输与贮藏导致作物的种 传病害广泛传播 引起作物种传病害的病原种类 有很多 其中黄瓜绿斑驳花叶病毒 Cucumber Green Mottle Mosaic Virus CGMMV 主要侵染葫芦 科作物 1 为害严重且分布广泛 严重影响西瓜 蒲 瓜等葫芦科作物的商业化制种及生产 CGMMV是帚状病毒科烟草花叶病毒属 是正 单链RNA 病毒 病毒性质稳定 2 被 CGMMV 侵染 的植物主要表现为植株叶片花叶 斑驳 褪绿 果实 出现水渍 纤维化 但不同寄主表现不同 3 该病毒 侵染力强 且传播途径多样 对经济作物的生产有 较大影响 20世纪 60 年代 CGMMV 通过黄瓜 蒲 瓜和西瓜从欧洲传到印度 日本 20世纪80年代 传 入我国台湾 到21世纪 中亚 东亚 南亚一些国家 和几乎所有的欧洲国家均有发生 4 2006年 我国将 其确定为全国农业植物检疫性有害植物 属国家三 类检疫性病害 并列入 中华人民共和国进境植物检 疫性有害生物名录 5 2019年5月 宁波邮局海关 截获携带CGMMV 的非法入境植物种子 是全国首 次从非法邮寄进境的植物种子中截获该病毒 6 CGMMV已在我国广泛分布 每年给商业育种公司 苗圃 商业水果和蔬菜生产商 以及食品零售等行 业造成巨大的经济损失 葫芦科植物在采收 运输 贮存过程中都易受 到病原微生物的侵染 种子携带的CGMMV是植株 苗期和成株期的主要侵染源 可能造成葫芦科作物 大规模减产甚至绝收 7 所以对带菌 带毒种子的消 摘 要 为探索防治西瓜 蒲瓜种传病害黄瓜绿斑驳花叶病毒 Cucumber Green Mottle Mosaic Virus CGMMV 的有效 方法 通过干热物理消毒法 将带毒的西瓜和蒲瓜种子分别在消毒处理机进行上层 中层 下层消毒和不消毒 CK CK 处理 结果表明 干热处理防治西瓜种子 CGMMV效果显著 对蒲瓜种子有一定防治效果 且以在消毒处理机中 上层效果更佳 但干热处理会降低西瓜种子的发芽率 对蒲瓜种子发芽率没有影响 干热消毒处理可降低种子携带 病毒量 且不同种类及品种所需的干热程序不同 关键词 西瓜 蒲瓜 种子 发芽率 CGMMV 干热处理 DOI 10 3865 j issn 1001 3547 2024 16 005 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 基金项目 浙江省农业新品种选育重大科技专项 2021C02065 1 5 王宁东 宁波微萌种业有限公司 浙江宁波 315101 E mail wnd 邵桥 吴长江 甘宁 宁波微萌种业有限公司 吴新胜 通讯作者 宁波微萌种业有限公司 浙江宁波 315101 E mail wxs 收稿日期 2024 07 23 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null null null null null null null null null null null null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null null null null null null null null null null null 表 5 沐甜 1号品质鉴定 品种 可溶性固形物 维生素 C mg g 番茄红素 mg g 沐甜 1号 6 50 0 19 0 026 橙色密码 CK 7 00 0 12 0 022 2020 40 31 34 37 6 苑国良 周明 邓磊 等 多抗高品质口感型番茄新品种京 番 309的选育 J 中国蔬菜 2023 6 97 100 7 林文 福州地区口感型水果番茄越冬设施栽培技术 J 长 江蔬菜 2023 11 40 42 8 吕金浮 李美芹 杨园园 等 口感番茄新品种 潍科玉玲 珑 的选育 J 北方园艺 2024 1 157 161 9 苑国良 周明 邓磊 等 多抗高品质口感型番茄新品种京 番 309的选育 J 中国蔬菜 2023 6 97 100 10 刘小云 赵永威 桑克盟 等 优质口感型番茄酸甜果 10 号高效栽培技术 J 长江蔬菜 2021 23 54 56 11 蒋欣梅 董然 郑姗姗 等 不同性质钙肥施用对番茄产 量及品质的影响 J 长江蔬菜 2015 20 77 79 2024 16 14 表 1 干热处理机干热消毒程序 程式段号 温度 湿度 时间 h 1 35 20 12 2 50 20 12 3 60 20 12 4 66 20 3 5 68 20 72 6 65 20 3 7 60 20 12 8 50 20 6 表 2 干热处理对西瓜种子发芽率的影响 批次 处理 播种数 粒 播种 10 d后 发芽数 株 播种 10 d后 发芽率 第 1批 CK 300 185 61 67 上层 300 104 34 67 中层 300 166 55 33 下层 300 178 59 33 第 2批 CK 300 215 71 67 上层 300 161 53 67 中层 300 168 56 00 下层 300 172 57 33 表 3 干热处理对蒲瓜种子发芽率的影响 批次 处理 播种数 粒 播种 10 d后 发芽数 株 播种 10 d后 发芽率 第 1批 CK 100 83 83 00 上层 100 89 89 00 中层 100 78 78 00 下层 100 83 83 00 第 2批 CK 100 89 89 00 上层 100 90 90 00 中层 100 88 88 00 下层 100 87 87 00 毒处理尤为重要 目前 对种子进行消毒处理方法 多样 包括湿热处理 干热处理 药剂处理和干热 药剂处理 8 由于CGMMV存在于种子内部 药剂处理 只能对种子表面消毒 往往效果甚微 可作为防治 CGMMV的辅助手段 干热处理是一种常用的消毒 方法 是加强带毒种子防治管理的关键 目前已被 证实为防治 CGMMV最为有效的方法 其原理是干 热处理可使CGMMV钝化 从而失去侵染能力 9 另 外 研究表明 干热处理会影响种子胚芽从而降低 种子发芽率 但不同种类及品种种子对于干热处理 的温度敏感性有所差异 为此 宁波微萌种业有限公 司特开展现有干热处理程序对CGMMV阳性种子的 消毒效果及对种子发芽率的影响研究 并总结如下 1 材料与方法 1 1 试验材料 供试材料是由郑州果树所提供的接种CGMMV 的西瓜 美都 蒲瓜 奔霄5号 植株收获经酶联免 疫吸附测定 ELISA 和逆转录聚合酶链反应 RT PCR 测定确认感染CGMMV的种子 1 2 试验方法 干热处理 试验设计通过随机抽样 于2023 年 3 月 1 日各抽取 8 kg 感染 CGMMV 的西瓜和蒲 瓜种子 西瓜和蒲瓜种子各平均分成 4 份 其中 3 份西瓜和蒲瓜种子分别放置到赣州鑫宇翔设备技 术有限公司生产的干热灭菌机 型号 5HX 5 0L 05 上 中 下层进行干热处理 剩下的 1 份西瓜和 蒲瓜种子不进行干热处理作对照 CK CK 干热 处理后西瓜上 中 下层干热处理的样品和未干热 处理的样品各抽取 300 粒种子作 2 个批次测定相 应的指标 干热处理后蒲瓜上 中 下层干热处理的 样品和未干热处理的样品各抽取 100 粒种子作 2 个批次测定相应的指标 干热消毒程序如表1 发芽率测定 将经上述干热处理后的西瓜 和蒲瓜种子置于纯净水中浸泡4 h 后将种子平铺 在培养皿中的滤纸上 置于设定温度 30 2 的植物 生长箱 型号 GXZ型 宁波江南仪器厂 培养至根长 1 cm 左右 于 2023 年 3 月 23 日 播种 10 d 后 分 别统计西瓜和蒲瓜种子的发芽数 计算发芽率 发 芽率 发芽的种子数量 测试的种子数量 100 干热处理效果测定 将经上述干热处理后的 西瓜和蒲瓜种子催芽并定植于田间 西瓜和蒲瓜在 2023年4月10日 植株2叶1心期进行田间植株病 症观察 并取嫩叶用逆转录 聚合酶链反应 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction RT PCR 检测 CGMMV 计算阳性比率 阳性比率 阳性 单株数 检测总株数 100 RNA提取 幼苗2叶1心时 用打孔器分别 在西瓜和蒲瓜嫩叶上取样 以 10 个植株叶片为 1 个混样 植株叶片RNA提取采用RNAprep Pure 多 糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒 DP441 天根生化 科技有限公司 RT PCR 检测 RNA 反转录与 PCR 扩增采 用 PrimeScript TM One Step RT PCR Kit Ver 2 天根 生化科技有限公司 2024 16 15 图2 第1批蒲瓜干热处理和CK 混样电泳 注 M DNA Marker 1 10 蒲瓜干热处理上层混样1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 11 20 蒲瓜干热处理中层混样1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 21 30 蒲瓜干热处理下层混样1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 31 40 蒲瓜CK 混样1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 阳性对照 阴性对照 图1 干热处理西瓜混样电泳 注 M DNA Marker 1 11 西瓜干热处理上层11个混样 12 22 西瓜干热处理中层11个混样 23 33 西瓜干热处理下层11个混样 34 44 CK 西瓜11个混样 阳性对照 阴性对照 1 000 bp 700 bp 400 bp 100 bp 1 000 bp 700 bp 400 bp 100 bp 400 bp 700 bp 200 bp 1 000 bp 400 bp 700 bp 200 bp 1 000 bp PCR 反应体系 为 RNA 模板 2 5 L 正反向引物各0 5 L 2 1 step Buffer 6 5 L PrimeScript One Step Enzyme 0 25 L 用超 纯水补足至10 L PCR扩增程序为 45 反转录 30 min 95 预变性2 min 94 变性 30 s 60 退火 30s 72 延伸30s 循环 36次 72 延伸5 min 4 保存 PCR产物用 2 琼脂糖凝胶电泳检 测分析 数据统计 利用 Excel软件统计试验数 据并进行数据分析 2 结果与分析 2 1 干热处理对西瓜 和蒲瓜种子发芽率的 影响 西瓜种子经干热处 理机上 中 下层分别处 理后 第1批西瓜种子 播种10 d后的发芽率依次为34 67 55 33 59 33 CK为61 67 第2批西瓜种子播种 10 d 后的发芽 率依次为 53 67 56 00 57 33 CK 为 71 67 表 2 结果表明 干热处理会降低西瓜种子的发 芽率 蒲瓜种子经干热处理机上 中 下层分别处理 后 第 1 批蒲瓜种子播种10 d后的发芽率依次为 89 00 78 00 83 00 CK 为83 00 第2批蒲瓜种 子播种 10 d 后的发芽率依次为 90 00 88 00 87 00 CK 为89 00 表3 结果表明 蒲瓜种子经干 热处理后的发芽率与 CK 无明显差异 即干热消毒 对蒲瓜种子的发芽率无较大影响 2 2 干热处理的消毒效果 干热处理对西瓜种子CGMMV的防治效果 对 干热处理后西瓜植株2叶1心时的嫩叶提取RNA 混样后使用引物 CGMMV1 CGMMV2 GB T 28071 2011 及作为对照的植物鉴定引物 eflaF R 经 PCR 检测后可观察到作为对照的引物扩增条带290 bp 而鉴定 CGMMV 的引物均未获得 654 bp 的扩增条 带 图1 结果表明 干热处理对西瓜种子CGMMV 的防治效果明显 干热处理对蒲瓜种子CGMMV的防治效果 对 干热处理后蒲瓜植株2叶1心时的嫩叶提取RNA 每 10株混样后使用引物 CGMMV1 CGMMV2 GB T 28071 2011 及作为对照的植物鉴定引物 eflaF R 经 PCR 检测后可观察到作为对照的引物扩增条带 290 bp 由表4可知 第1批蒲瓜干热上层混样未检 测到CGMMV 蒲瓜干热中层混样1 10 11 20 蒲瓜 干热下层混样 31 40 41 50 61 70 81 90 91 100 蒲瓜CK 混样21 30 31 40 41 50 51 60 71 80检 测到654 bp扩增条带 图2 第2批蒲瓜CK 混样 1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 蒲瓜干热上层混样81 90 蒲瓜干 热中层混样11 20 61 70 蒲瓜干热下层混样1 10 2024 16 16 表 4 干热处理对蒲瓜混样 CGMMV消毒效果 批次 处理 阳性混样 总计 第 1批 CK 21 30 31 40 41 50 51 60 71 80 5 上层 0 中层 1 10 11 20 2 下层 31 40 41 50 61 70 81 90 91 100 5 第 2批 CK 1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 10 上层 81 90 1 中层 11 20 61 70 2 下层 1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 9 表 5 干热处理对蒲瓜单株 CGMMV的消毒效果 批次 处理 阳性单株 阳性比率 第 1批 CK 29 33 35 41 52 54 56 77 79 9 上层 0 中层 9 15 2 下层 32 45 67 81 94 5 CK 7 10 16 18 19 20 22 25 35 37 41 42 48 49 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 66 73 75 82 88 93 96 31 上层 82 83 85 3 中层 13 66 69 3 第 2批 下层 6 15 19 24 28 37 44 47 49 54 56 57 59 60 64 68 69 75 79 88 89 21 图3 第2批蒲瓜干热处理和CK 混样电泳 注 M DNA Marker 蒲瓜干热消毒上层混样1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 11 20 蒲瓜干热消毒中层混样1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 21 30 蒲瓜干热消毒下层混样1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 31 40 蒲瓜CK 混样1 10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90 91 100 阳性对照 阴性对照 400 bp 700 bp 200 bp 1 000 bp 400 bp 700 bp 200 bp 1 000 bp 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60 61 70 71 80 81 90检测到654 bp扩增条带 图3 对混样检测结果中阳性混样组进行单株检测 检测结果如表5 第1批蒲瓜种子经干热处理机上 中 下层干热处理后阳性比率分别为 0 2 5 CK 的阳性比率为 9 第 2 批蒲瓜种子经干热处 理机上 中 下层干热 处理后阳性比率分别 为 3 3 21 CK 的阳性比率为31 综 合混样和单株检测结 果 干热处理过的蒲瓜 仍带有 CGMMV 病毒 残体 但阳性比率较 CK 明显降低 并且以 干热处理机的上中层 的消毒效果更佳 2 3 CGMMV 侵染植 株后的症状表现 不同的葫芦科作 物品种与同一物种栽培 品种的 CGMMV 症状 有所不同 在葫芦科作 物中 CGMMV 表现为 植株生长缓慢 矮化 叶 片斑驳 花叶甚至变白 枯萎 茎和花穗梗形成 棕色的坏死条 甚至整 株植物都可能过早死 亡 但有些成熟植物叶 片上的症状会消失 特 别是在开阔的田野环境 中 表现为无症状感染 果实则经常出现畸形和 内部果肉海绵状 腐烂 变黄等症状 干热处理后西 瓜田间种植表现 田 间观察发现 极少数西 瓜叶片表现出褪绿 黄 化 皱缩现象 图4 但 取样进行PCR检测 未 检测到CGMMV 即干 热处理对防治西瓜种子CGMMV有明显效果 干热处理后蒲瓜田间种植表现 田间观察发 现 绝大多数蒲瓜在苗期表现为无症状 少数表现出 被侵染症状 干热处理后的蒲瓜种子在田间种植的正 常植株及部分病株如图5 其中蒲瓜干热下层68 86 及CK 54为PCR检测CGMMV阳性 田间较正常植 2024 16 17 基金项目 宁波市 科技创新 2025 重大专项 2019B10002 廖慧敏 宁波微萌种业有限公司 浙江宁波 315101 E mail lhm 王婉婷 王雨晴 程佳雨 梁金方 宁波微萌种业有限公司 包卫国 通讯作者 宁波微萌种业有限公司 浙江宁波 315101 E mail wxs 收稿日期 2024 03 27 图4 干热处理后西瓜田间种植的正常植株与其他病毒病株 正常植株 叶片花叶 叶片皱缩 植株矮缩 正常植株 干热下层68 干热下层86 CK 54 图5 干热处理后蒲瓜田间种植的正常植株与CGMMV病株 株均表现出植株矮化 叶片皱缩和叶片变形等症状 即干热处理对防治蒲瓜种子CGMMV有效 3 结论与讨论 CGMMV的远距离传播主要依靠种子携带病毒 传播 且病毒稳定性极强 CGMMV的致死温度为 90 100 常温下病毒侵染力可保持数月 在 0 可保持数年 20 病毒仍能存活 一旦条件适宜就 能继续传播蔓延 田间一旦发病 如未进行有效的 杀灭处理 病株残体中的病毒可存活多年 即便将 病根埋在土壤内 1 a 以上 病毒仍保持侵染能力 10 一般可用物理方法或化学方法钝化 CGMMV 播种 前对种子进行物理消毒 不仅具有良好防治效果 而且在合适条件下 可提高种子活力 增加作物产 量 改善产品品质 11 研究表明 干热处理可大大减 轻种子发病程度 甚至不发病 12 在同一生产 栽 培 管理条件下 不同品种 不同成熟度的种子经干 热处理后的发芽率有所不同 13 本试验对携带CGMMV 的阳性西瓜和蒲瓜种子分别进行干热处理 干热处 理对西瓜种子的发芽率影响最大 西瓜种子进行干 热处理后极大降低了种子携带 CGMMV 的可能 但 其发芽率受到影响 说明干热处理对西瓜种子消毒 效果明显 但还需针对干热温度及时长进行探索 从而降低对西瓜种子发芽率的影响 干热处理后蒲 瓜阳性比率明显低于 CK 组 在干热处理机的不同 层中 下层的阳性比率明显高于上层 中层 推测可 能是因为瓜种子种壳较厚 对温度的耐受程度高 而上中层温度较高 消毒效果更好 CGMMV是一种为害严重 防治困难的检疫性 有害生物 主要侵染葫芦科作物 植株被侵染后 在 种子或苗期很难通过观察症状来辨别是否携带 CGMMV 而干热处理技术是防治种传病害的重要 措施 针对不同的物种和品种探索适宜的干热处理 温度及时长在保持种子发芽率的同时 可有效灭活 种子表面和内部的病原菌 降低种传病害对制种业 和农业生产的影响 参考文献 1 孟姗姗 石延霞 李宝聚 李宝聚博士诊病手记 六十六 黄瓜 种传病害的干热消毒技术 J 中国蔬菜 2013 23 20 22 2 任春梅 杨柳 缪倩 等 种子种苗上黄瓜绿斑驳花叶病毒 IC RT PCR 检测方法的建立及应用 J 植物保护 2022 48 5 212 219 3 谢婷 罗金燕 陈磊 等 黄瓜绿斑驳花叶病毒病防治方法 的比较与展望 J 浙江大学学报 农业与生命科学版 2022 48 3 279 288 4 冯兰香 谢丙炎 杨宇红 等 检疫性黄瓜绿斑驳花叶病毒 的检测和防疫控制 J 中国蔬菜 2007 9 34 38 5 中华人民共和国农业农村部 中华人民共和国农业农村部第 788 号公告 EB OL 2006 12 21 2024 02 25 http www 6 王佳莹 张吉红 崔俊霞 宁波海关全国邮检首次截获黄 瓜绿斑驳花叶病毒 J 植物检疫 2019 3 62 7 古勤生 防治监控黄瓜绿斑驳花叶病毒 确保瓜类安全生 产 J 中国瓜菜 2007 1 47 48 8 蔡明 江冬 张丽英 等 黄瓜绿斑驳花叶病毒种子处理试 验研究 J 植物检疫 2011 25 1 62 63 9 宋顺华 吴萍 郑晓鹰 等 干热处理对蔬菜种子质量的影响及 其杀菌效果研究 J 河南农业科学 2011 40 4 117 119 10 吴元华 李立梅 赵秀香 等 黄瓜绿斑驳花叶病毒在我国定 殖和扩散的风险性分析 J 植物保护 2010 36 1 33 36 11 岳鑫璐 梁根 李志强 等 干热处理对白菜种传黑腐病 抑菌效果评价 J 广东农业科学 2022 49 1 105 110 12 蔡明 李明福 江东 日本 韩国黄瓜绿斑驳花叶病毒发 生及防控策略 J 植物检疫 2010 24 4 65 68 13 杜忠佩 陈星伊 金卫杰 等 干热处理对南瓜种子发芽 及 CGMMV 病毒活性的影响 J 寒旱农业科学 2023 9 839 844 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null null null null null null null null null null null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null null null null null null null null null null 2024 16 18