基于RPA-CRISPR_Cas12a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立.pdf

2024 50 4 235 241PlantProtection 收稿日期 2 0 2 3 0 7 2 5 修订日期 2 0 2 3 1 1 1 3 基金项目 国家重点研发计划 2 0 2 1 Y F D 1 4 0 0 1 0 0 2 0 2 1 Y F D 1 4 0 0 1 0 3 通信作者E m a i l 周涛t a o z h o u s i g 1 6 3 c o m 张永江z h a n g y j p v i y e a h n e t 为并列第一作者 基于RPA CRISPR Cas12a的番茄花叶病毒可视化 检测方法的建立 董 铮1 赵振兴1 范奇璇1 2 王思元1 周 涛2 张永江1 1 中国检验检疫科学研究院 北京 1 0 0 1 7 6 2 中国农业大学植物保护学院 北京 1 0 0 1 9 3 摘要 番茄花叶病毒 t o m a t o m o s a i c v i r u s T o M V 属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamo virus成员 主要危害番茄和辣椒 多数茄科植物易感染 严重影响果实的品质和产量 本研究根据T o M V编码的 外壳蛋白的基因保守序列 设计重组酶聚合酶扩增技术 r e c o m b i n a s e p o l y m e r a s e a m p l i f i c a t i o n R P A 特异性引物和 簇状规则间隔短链重复序列 c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e p e a t s C R I S P R 及相关蛋白1 2 a C R I S P R a s s o c i a t e d 1 2 a C a s 1 2 a 的c r R N A并挑选报告基因 通过优化反应体系建立了T o M V的快速可视化检测方 法 当荧光报告基因F Q终浓度为4 0 0 n m o l L C a s 1 2 a c r R N A比例为1 5 终浓度为2 0 0 n m o l L 1 1 0 0 0 n m o l L 1 时检测信号最强 只需R P A和C R I S P R C a s 1 2 a分别反应1 5 m i n 即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信 号 该方法可特异性检测T o M V 对携带T o M V样品的R N A检测灵敏度可以达到1 7 2 a g L 是普通R T P C R检 测灵敏度的1 0 0 0 0倍 可用于T o M V快速灵敏的可视化检测 关键词 番茄花叶病毒 R P A C R I S P R C a s 1 2 a 可视化检测 中图分类号 S 4 3 6 4 1 2 文献标识码 A DOI 1 0 1 6 6 8 8 j z w b h 2 0 2 3 3 8 1 EstablishmentofRPA CRISPR Cas12a basedvisualdetectionof tomatomosaicvirus DONGZheng1 ZHAOZhenxing1 FANQixuan1 2 WANGSiyuan1 ZHOUTao2 ZHANGYongjiang1 1 ChineseAcademyofInspectionandQuarantine Beijing 1 0 0 1 7 6 China 2 CollegeofPlantProtection ChinaAgriculturalUniversity Beijing 1 0 0 1 9 3 China Abstract Tomatomosaicvirus ToMV isamemberofthegenusTobamovirusinthefamilyVirgaviridae ToMV mainlyinfectstomato pepper andmostSolanaceaeplants resultinginseverelossesinfruitqualityandyield In thisstudy thespecificprimersofrecombinasepolymeraseamplification RPA andthecrRNAofclustered regularlyinterspacedshortpalindromicrepeats CRISPR associated1 2a CRISPR Cas1 2a weredesignedbasedon theconservedsequenceofthecoatproteinsequenceofToMV andthereportergenewasselected Byoptimizing thereactionsystem arapidvisualdetectionmethodforToMVdetectionwasestablished andthedetectionsignal wasstrongestwhenthefinalconcentrationoffluorescentreporterFQwas4 0 0nmol L theCas1 2a crRNAratio was1 5 andthefinalconcentrationwas2 0 0nmol L 1 1 0 0 0nmol L 1 Withonly1 5minofRPAand CRISPR Cas1 2areaction respectively positivesignalscanbedirectlyobservedunderaportablebluelight irradiationequipment ThismethodcanbeusedforspecificdetectionofToMV andtheminimaldetectionlimit indetectingthetotalRNAofToMVcontainingsamplesis1 7 2ag L 1 0 0 0 0timesthatofRT PCR basedToMV detection Hence theestablishedRPA CRISPR Cas1 2a baseddetectionisarapid sensitiveandvisualmethodfor ToMVdetection Keywords tomatomosaicvirus RPA CRISPR Cas1 2a visualizationdetection 2 0 2 4 番茄花叶病毒 t o m a t o m o s a i c v i r u s T o M V 属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒 属Tobamovirus 1 基因组分别编码外壳蛋白 c o a t p r o t e i n C P 运动蛋白 m o v e m e n t p r o t e i n M P 与复制相关的1 2 6 k D蛋白和1 8 3 k D蛋 白 2 T o M V在全世界均有分布 主要危害番茄 Solanumlycopersicum和辣椒Capsicumannuum 易侵染多数茄科植物 3 严重影响果实的品质和 产量 T o M V可以通过嫁接 植株间互相接触 机 械接种传播 也可以通过种子传毒 3 被T o M V 侵染的叶片出现花叶症状 有时还会导致叶片变 形 植株矮缩 甚至死亡 果实会出现着色不均或 凹陷的褐色病斑 4 目前检测T o M V的方法主要有双抗体夹心酶联 免疫吸附测定 d o u b l e a n t i b o d y s a n d w i c h a s s a y D A S E L I S A 斑点酶联免疫吸附测定 d o t E L I S A 胶体 金免疫层析测定 R T P C R 实时定量R T P C R等 3 但是这些方法在实现快速和现场检测T o M V方面存 在一些局限性 目前使用的大多数检测方法很耗时 而且需要昂贵的设备和专业技术知识 限制了在实验 室之外的诊断应用 因此 有必要建立一种快速 灵 敏 可视化的T o M V现场检测方法 5 重组酶聚合酶扩增技术 r e c o m b i n a s e p o l y m e r a s e a m p l i f i c a t i o n R P A 是一种在恒定温度 3 7 4 2 启动D N A指数级扩增的检测技术 由于该 技术反应速度快 灵敏 不需要昂贵的仪器 已被广 泛应用于多种植物病原物的检测 6 C R I S P R C a s系 统由簇状规则间隔短链重复序列 c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e p e a t s C R I S P R 及 相关蛋白1 2 a C R I S P R a s s o c i a t e d 1 2 a C a s 1 2 a 组 成 存在于许多细菌和古细菌的先天免疫系统中 7 在该系统中 C a s蛋白与入侵病毒D N A序列互补的 C R I S P R R N A c r R N A 形成一个核糖核蛋白 r i b o n u c l e o p r o t e i n R N P 复合物 来靶向特定的病毒序 列 8 虽然该系统主要用于基因编辑 9 1 2 但最近 有研究表明 一些C a s蛋白可用于检测特定的核酸 序列 1 3 1 5 例如 C a s 1 2 a在与其D N A底物特异性 相互作用后获得了非特异性的单链D N a s e活性 1 2 前人利用这一特性应用C a s 1 2 a作为生物传感器 除 了C a s 1 2 a及其c r R N A的R N P复合物外 还添加了 一个荧光报告基因 F Q 标记的单链D N A底物 在 C a s 1 2 a激活后 它非特异性地降解单链D N A 释放 荧光基团 产生荧光信号 该方法已被用于检测人 乳头瘤病毒 h u m a n p a p i l l o m a v i r u s H P V 和新型 冠状病毒 c o r o n a v i r u s d i s e a s e 2 0 1 9 C O V I D 1 9 1 3 1 6 表明该方法在病毒诊断方面具有巨大潜 力 近年来 C R I S P R C a s 1 2 a被应用于植物R N A 病毒 1 7 1 8 和D N A病毒 1 9 的检测 证明其在植物病 毒病的检测中具有很大的应用潜力 1 材料与方法 1 1 材料 本研究中所用的带病毒材料包括 T o M V 南芥 菜花叶病毒 a r a b i s m o s a i c v i r u s A r M V 黄瓜花叶 病毒 c u c u m b e r m o s a i c v i r u s C M V 辣椒轻斑驳病 毒 p e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s P M M o V 番茄褐色 皱纹果病毒 t o m a t o b r o w n r u g o s e f r u i t v i r u s T o B R F V 番茄斑驳花叶病毒 t o m a t o m o t t l e m o s a i c v i r u s T o M M V 番茄环斑病毒 t o m a t o r i n g s p o t v i r u s T o R S V 烟草环斑病毒 t o b a c c o r i n g s p o t v i r u s T R S V 烟草花叶病毒 t o b a c c o m o s a i c v i r u s T M V 番茄斑萎病毒 t o m a t o s p o t t e d w i l t v i r u s T S W V 侵染的辣椒或番茄的叶片或种子样品均由 中国检验检疫科学研究院保存 1 2 方法 1 2 1 总R N A提取 称取1 0 0 0粒健康或带病毒的番茄或辣椒种子在 干磨机中打碎至粉末状 按质量体积比1 2比例加入 1 P B S缓冲液 N a C l 1 3 7 m m o l L K C l 1 2 7 m m o l L N a 2 H P O 4 1 2 H 2 O 1 0 m m o l L K H 2 P O 4 2 m m o l L 充分混合放置4 5 m i n 取1 m L上清液备用 取健康 或带病毒的番茄或辣椒叶片在液氮中充分研磨 称 取0 1 g备用 按照植物总R N A提取试剂盒 D P 4 3 2 天根生化科技有限公司 说明书提取R N A 于 8 0 保存备用 1 2 2 R P A引物 c r R N A及荧光报告基因F Q 设计 根据N C B I中T o M V外壳蛋白对应基因序列 进行序列比对分析并设计引物 使用N C B I中P r i m e r B L A S T h t t p s w w w n c b i n l m n i h g o v t o o l s p r i m e r b l a s t 对设计的引物进行特异性验 证 使用在线设计网站C R I S P R进行c r R N A设计 632 5 0卷第4期董铮等 基于R P A C R I S P R C a s 1 2 a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立 表1 c r R N A 荧光报告基因F Q序列和引物均由北京擎科生物科技有限公司合成 表1 番茄花叶病毒的RPA扩增引物 crRNA及荧光报告基因序列 Table1 SequencesofprimersusedforRPAamplification crRNA andfluorescencereportergeneoftomatomosaicvirus 引物 P r i m e r 序列 5 3 S e q u e n c e 扩增片段长度 b p E x p e c t e d s i z e T o M V R P A F C T T A C T C A A T C A C T T C T C C A T C G C A A T T T G T G 2 1 9 T o M V R P A R C A T T G T A C C T G T A C A C C T T A T A A A C A T C G C C T o M V c r R N A U A A U U U C U A C U A A G U G U A G A U A A A C A C A G C A A G C A A G A A C U A C U F Q F A M C C G G A A A A A A A A A A A A C C G G B H Q 1 1 2 3 R P A检测方法 本研究按照R P A恒温扩增试剂盒 W L R B 8 2 0 7 K I T 安普未来生物科技有限公司 进行 R P A反应 扩增体系为5 0 L 每个反应管中加入 待测样品R N A模板2 L B u f f e r A 2 9 4 L B u f f e r B 2 5 L T o M V R P A F 2 L T o M V R P A R 2 L d d H 2 O 1 2 1 L 混合均匀后在 4 2 反应1 5 m i n 反应结束后纯化扩增产物 加 入等体积的T r i s饱和酚 氯仿 异戊醇 2 5 2 4 1 抽提液 混匀 1 2 0 0 0 r m i n离心5 m i n 取上清 进行显色反应 1 2 4 C R I S P R C a s 1 2 a等温快速可视化检测方法 本研究采用的C R I S P R C a s 1 2 a反应扩增体系为 1 0 N E B u f f e r 3 1 2 L R N a s e i n h i b i t o r 4 0 U L 0 5 L D T T 0 1 m m o l L 0 5 L T o M V c r R N A 1 0 m o l L 2 L L b C a s 1 2 a C p f 1 5 m o l L 0 8 L 荧光报告基因F Q 1 0 m o l L 0 8 L d d H 2 O 1 1 4 L 将上述溶液加到反应管中充分混 合后 加入2 L纯化好的R P A反应产物 再次充分 混匀 离心 3 7 反应1 5 m i n 反应结束后在蓝光 4 4 0 4 6 0 n m 下观察 当溶液发出绿色荧光时 判 定待测样品为T o M V阳性 1 2 5 C R I S P R C a s 1 2 a等温快速可视化检测体系 优化 对荧光报告基因F Q终浓度进行优化时 将其终 浓度依次设置为1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 n m o l L 其他试验条件保持不变 对C a s 1 2 a c r R N A浓度比例 进行优化时 将其浓度比例分别设置为2 1 1 1 1 2 1 5 1 1 0 其他试验条件保持不变 在优化好荧光报告 基因F Q终浓度和C a s 1 2 a c r R N A浓度比例的基础 上 确定最终浓度 将C a s 1 2 a c r R N A最终浓度分别设 置为1 2 5 n m o l L 1 6 2 5 n m o l L 1 2 5 n m o l L 1 1 2 5 n m o l L 1 5 0 n m o l L 1 2 5 0 n m o l L 1 1 0 0 n m o l L 1 5 0 0 n m o l L 1 2 0 0 n m o l L 1 1 0 0 0 n m o l L 1 4 0 0 n m o l L 1 2 0 0 0 n m o l L 1 1 2 6 特异性分析 提取辣椒和番茄上常见的A r M V C M V P M M o V T o B R F V T o M M V T o R S V T R S V T M V T S W V样品总R N A作为模板 使用建立的基于 R P A C R I S P R C a s的等温快速可视化检测体系对 其进行扩增 以验证该检测体系是否与其他病毒有 交叉反应 1 2 7 灵敏度分析 将T o M V的R N A按1 0倍浓度梯度稀释为 1 7 2 n g L 1 7 2 n g L 1 7 2 p g L 1 7 2 p g L 1 7 2 p g L 1 7 2 f g L 1 7 2 f g L 1 7 2 f g L 1 7 2 a g L 1 7 2 a g L 将稀释后的样品分别取 2 L进行R P A C R I S P R C a s等温快速可视化检 测 R P A检测和R T P C R检测 确定检测灵敏度 参照 番茄花叶病毒检疫鉴定方法 G B T 3 6 7 7 1 2 0 1 8 3 设计R T P C R引物 引物序列为 R T T o M V F 5 C G A G A G G G G C A A C A A A C A T 3 R T T o M V R 5 A C C T G T C T C C A T C T C T T T G G 3 扩 增片段长度为3 1 8 b p 参照全式金T r a n s S c r i p t I I O n e S t e p R T P C R S u p e r M i x试剂盒配制2 0 L 总反应体系 包括R N A 4 L R T T o M V F和R T T o M V R 1 0 m o l L 各0 4 L T r a n s S c r i p t I I O n e S t e p E n z y m e M i x 0 4 L 2 T S I I O n e S t e p R e a c t i o n M i x 1 0 L d d H 2 O 4 8 L 反应条件为 4 5 3 0 m i n 9 4 5 m i n 9 4 3 0 s 5 8 3 0 s 7 2 4 0 s 3 5个循环 7 2 1 0 m i n 1 2 8 样品检测 收集1 0份辣椒和番茄的叶片或种子样品提取 总R N A 表2 使用建立的R P A C R I S P R C a s 1 2 a 体系进行T o M V的检测 并与R T P C R检测方法比 较 分析检测准确率 732 2 0 2 4 表2 10份待检测番茄花叶病毒样品 Table2 10samplesusedfordetectionoftomatomosaicvirus 编号样品类别取样部位来源 N o S a m p l e c a t e g o r y S a m p l i n g l o c a t i o n O r i g i n 1番茄叶片广东 2番茄叶片山东 3番茄种子甘肃 4番茄叶片福建 5番茄叶片辽宁 6辣椒叶片山东 7辣椒种子内蒙古 8辣椒叶片山东 9辣椒种子山东 1 0辣椒叶片山东 2 结果与分析 2 1 可视化反应体系优化 为建立最适的R P A C R I S P R C a s 1 2 a反应体 系 进行荧光报告基因F Q终浓度优化 试验结果 如图1 a所示 当荧光报告基因F Q终浓度达到 4 0 0 n m o l L时 离心管中绿色荧光强度达到最亮 继续增加浓度时亮度不再增加 因此选择4 0 0 n m o l L 为荧光报告基因F Q终浓度 C a s 1 2 a c r R N A浓度比例的优化结果如图1 b 所示 当C a s 1 2 a c r R N A浓度比例为1 5时 离心管 中绿色荧光强度达到最亮 最终确定C a s 1 2 a c r R N A浓度比例为1 5 C a s 1 2 a c r R N A浓度的优化结果如图1 c所示 结果表明C a s 1 2 a c r R N A浓度为2 0 0 n m o l L 1 1 0 0 0 n m o l L 1和4 0 0 n m o l L 1 2 0 0 0 n m o l L 1 时离心管中绿色荧光强度达到最亮 考虑成本问题 最终确定C a s 1 2 a c r R N A浓度为2 0 0 n m o l L 1 1 0 0 0 n m o l L 1 结合上述优化试验 最终确定显色体系为 2 L纯化的R P A反应产物 靶标浓度约为2 5 1 0 0 n g L 1 0 N E B u f f e r 3 1 2 L 4 0 U L R N A s e i n h i b i t o r 0 5 L 0 1 m m o l L D T T 0 5 L 1 0 m o l L T o M V c r R N A 2 L 5 m o l L L b C a s 1 2 a C p f 1 0 8 L 1 0 m o l L荧光报告基因 F Q 0 8 L d d H 2 O 1 1 4 L 2 2 检测体系的特异性分析 为了评估R P A C R I S P R C a s 1 2检测体系的特 异性 根据优化好的R P A C R I S P R C a s 1 2 a反应体 图1 RPA CRISPR Cas12a反应体系优化 Fig 1 OptimizationofRPA CRISPR Cas12areactionsystem 系对分别携带 A r M V C M V P M M o V T o B R F V T o M M V T o R S V T R S V T M V T S W V的样品进 行检测 以d d H 2 O为阴性对照 N C 结果显示 携 带T o M V病毒的样品检测为阳性 带有其他9种病 毒的样品检测结果均为阴性 图2 2 3 检测体系的灵敏度测定 以携带T o M V的番茄样品总R N A为模板 R P A C R I S P R C a s 1 2 a反应能检测到的极限为 1 7 2 a g L 图3 a R P A反应的检测灵敏度为 1 7 2 f g L 图3 b 而普通R T P C R的检测灵敏度 为1 7 2 p g L 图3 c 在此条件下 建立的R P A C R I S P R C a s 1 2 a检测的灵敏度显著高于普通R T P C R 是普通R T P C R的1 0 0 0 0倍 832 5 0卷第4期董铮等 基于R P A C R I S P R C a s 1 2 a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立 图2 番茄花叶病毒RPA CRISPR Cas12体系的特异性分析 Fig 2 SpecificityassayofRPA CRISPR Cas12fordetectionoftomatomosaicvirus 图3 番茄花叶病毒RPA CRISPR Cas12a RPA和RT PCR体系灵敏度分析 Fig 3 SensitivitytestofRPA CRISPR Cas12a RPAandRT PCRfordetectionoftomatomosaicvirus 932 2 0 2 4 2 4 辣椒和番茄样品的检测 使用建立的R P A C R I S P R C a s 1 2 a体系进行 T o M V的检测 以d d H 2 O为阴性对照 N C 携带 T o M V的番茄样品总R N A为阳性对照 P 结果显 示 总共在3份样品中检出T o M V 图4 a R T P C R检 测结果与R P A C R I S P R C a s 1 2 a检测结果一致 图4 b 图4 RPA CRISPR Cas12a RT PCR检测10份样品携带番茄花叶病毒 Fig 4 RPA CRISPR Cas12a RT PCRdetectionoftomatomosaicvirusin10samples 3 结论与讨论 T o M V主要危害番茄 辣椒及多数茄科植物 在世界各地广泛分布 快速 准确地检测该病毒有 助于预防其进一步传播 然而 现有的T o M V诊断 方法只能在实验室中进行 本研究开发了一种快 速 特异 灵敏的R P A C R I S P R C a s 1 2 a技术的 T o M V可视化检测方法 在R P A C R I S P R C a s 1 2 a 检测体系中加入荧光报告基因F Q F A M C C G G A A A A A A A A A A A A C C G G B H Q 1 如果发现目 标序列 荧光报告基因被切割出F A M基团 可在蓝 光 4 4 0 4 6 0 n m 下直接观察到绿色荧光信号 增加 了该方法的便携性 因此 该方法具有在现场检测 中使用的潜力 本研究构建的R P A C R I S P R C a s 1 2 a体系的灵 敏度是R P A反应的1 0倍 是R T P C R的1 0 0 0 0 倍 显著高于传统的R T P C R R P A与C R I S P R C a s 1 2 a系统相结合 能够获得比R P A反应灵敏度 更高的检测技术 对环境要求低 操作简单 不需 要P C R仪和琼脂糖凝胶电泳 可以实现在田间 口 岸等现场快速检测的需求 但是通常检测灵敏度 越高的技术 在实际应用中发生污染的可能性越 大 因此可以优先选用带有滤芯的灭菌移液器枪 头和单独开盖的离心管进行试验 后续可以考 虑在同一个离心管中进行R P A反应和C R I S P R C a s 1 2 a可视化反应 减少中途开盖操作 降低污 染的可能 本研究建立的R P A C R I S P R C a s 1 2 a检测方 法只需反应3 0 m i n 利用便携式恒温金属浴和充 电式蓝光灯 即可快速检测T o M V 可用于田间 和口岸检疫等 为我国番茄花叶病毒的预测预报 和田间诊断等提供了更为便捷的技术手段 具有 广泛的应用前景 对我国番茄花叶病毒的防控具 有重要意义 参考文献 1 金凤媚 薛俊 郏艳红 等 天津地区番茄黄化曲叶病毒 D N A A的克隆和序列分析 J 华北农学报 2 0 1 1 2 6 1 5 8 6 2 2 金凤媚 薛俊 宋建 等 天津地区番茄褪绿病毒的分子检测 042 5 0卷第4期董铮等 基于R P A C R I S P R C a s 1 2 a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立 与基因组部分序列分析 J 华北农学报 2 0 1 6 3 1 2 2 3 2 7 3 国家标准化管理委员会 番茄花叶病毒检疫鉴定方法 第4部 分原理 G B T 3 6 7 7 1 2 0 1 8 S 北京 中国标准出版社 2 0 1 8 4 曹金强 柴阿丽 谢学文 等 番茄花叶病毒对番茄茎部和果 实危害严重 J 中国蔬菜 2 0 1 6 1 0 8 4 8 6 5 D U A N X u e y a n M A W e n d i J I A O Z h i y u a n e t a l R e v e r s e t r a n s c r i p t i o n r e c o m b i n a s e a i d e d a m p l i f i c a t i o n a n d C R I S P R C a s 1 2 a b a s e d v i s u a l d e t e c t i o n o f m a i z e c h l o r o t i c m o t t l e v i r u s J O L P h y t o p a t h o l o g y R e s e a r c h 2 0 2 2 4 1 2 3 D O I 1 0 1 1 8 6 s 4 2 4 8 3 0 2 2 0 0 1 2 8 y 6 P I E P E N B U R G O W I L L I A M S C H S T E M P L E D L e t a l D N A d e t e c t i o n u s i n g r e c o m b i n a t i o n p r o t e i n s J O L P L o S B i o l o g y 2 0 0 6 4 7 e 2 0 4 D O I 1 0 1 3 7 1 j o u r n a l p b i o 0 0 4 0 2 0 4 7 J I A N G F u g u o D O U D N J A C R I S P R C a s 9 s t r u c t u r e s a n d m e c h a n i s m s J A n n u a l R e v i e w o f B i o p h y s i c s 2 0 1 7 2 2 4 6 5 0 5 5 2 9 8 G A S I U N A S G B A R R A N G O U R H O R V A T P e t a l C a s 9 c r R N A r i b o n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x m e d i a t e s s p e c i f i c D N A c l e a v a g e f o r a d a p t i v e i m m u n i t y i n b a c t e r i a J P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s o f t h e U n i t e d S t a t e s o f A m e r i c a 2 0 1 2 1 0 9 3 9 E 2 5 7 9 E 2 5 8 6 9 J I N E K M C H Y L I N S K I K F O N F A R A I e t a l A p r o g r a m m a b l e d u a l R N A g u i d e d D N A e n d o n u c l e a s e i n a d a p t i v e b a c t e r i a l i m m u n i t y J S c i e n c e 2 0 1 2 3 3 7 6 0 9 6 8 1 6 8 2 1 1 0 H W A N G W Y F U Y a n f a n g R E Y O N D e t a l E f f i c i e n t g e n o m e e d i t i n g i n z e b r a f i s h u s i n g a C R I S P R C a s s y s t e m J N a t u r e B i o t e c h n o l o g y 2 0 1 3 3 1 3 2 2 7 2 2 9 1 1 S H A L E M O S A N J A N A N E H A R T E N I A N E e t a l G e n o m e s c a l e C R I S P R C a s 9 k n o c k o u t s c r e e n i n g i n h u m a n c e l l s J S c i e n c e 2 0 1 4 3 4 3 6 1 6 6 8 4 8 7 1 2 G A R S T A D B A S S A L O M C P I N E S G e t a l G e n o m e w i d e m a p p i n g o f m u t a t i o n s a t s i n g l e n u c l e o t i d e r e s o l u t i o n f o r p r o t e i n m e t a b o l i c a n d g e n o m e e n g i n e e r i n g J N a t u r e B i o t e c h n o l o g y 2 0 1 7 3 5 1 4 8 5 5 1 3 C H E N J S M A E n b o H A R R I N G T O N L B e t a l C R I S P R C a s 1 2 a t a r g e t b i n d i n g u n l e a s h e s i n d i s c r i m i n a t e s i n g l e s t r a n d e d D N a s e a c t i v i t y J S c i e n c e 2 0 1 8 3 6 0 6 3 8 7 4 3 6 4 3 9 1 4 H A R R I N G T O N L B B U R S T E I N D C H E N J S e t a l P r o g r a m m e d D N A d e s t r u c t i o n b y m i n i a t u r e C R I S P R C a s 1 4 e n z y m e s J S c i e n c e 2 0 1 8 3 6 2 6 4 1 6 8 3 9 8 4 2 1 5 G O O T E N B E R G J S A B U D A Y Y E H O O L E E J W e t a l N u c l e i c a c i d d e t e c t i o n w i t h C R I S