宁夏地区不同品种番茄主要病毒病的分子鉴定及抗性评价.pdf

西 北 农 业 学 报 宁夏地区不同品种番茄主要病毒病的分子鉴定及抗性评价 收稿日期 修回日期 基金项目 宁夏回族自治区重点研发计划 第一作者 郜雅欣 女 硕士研究生 从事设施蔬菜栽培研究 通信作者 高艳明 女 教授 硕士生导师 主要从事设施蔬菜栽培生理与营养施肥研究 郜雅欣 高艳明 李建设 王 涵 宁夏大学 农学院 银川 摘 要 为明确宁夏地区番茄上的病毒种类并分析复合侵染状况以及评价不同品种番茄的抗病性 于宁夏 贺兰园艺产业园采集 份番茄疑似病毒样品 共 个品种 利用主要的 种番茄病毒特异性引物对病样 进行 分子检测与鉴定 结果显示 在疑似病样中 病毒检出率为 其中 首次在银 川市检出 检出率显著高于其他病毒 达 为当地优势毒源 其次为 和 检出率分别为 和 和 检出率较低 通过对番茄病毒的复合侵染现象分 析发现 复合侵染的样本占阳性样本数的 其中 种病毒的复合侵染率占复合侵染总比的 且 种和 种复合侵染类型繁多 此外 对 个品种感病情况分析 冠蔬 感染的病毒种类最多 为 种 而 黑小哥 未检测出以上 种番茄病毒 进而对番茄病毒病抗性品种进行初步评估 黑小哥 千禧 香妃 号 冠疏 和 赛硒柿 号 这 个品种为抗病毒品种 综上 面对外来病毒的侵入 复合侵 染的暴发 应当引起高度重视和警惕 关键词 番茄病毒病 南方番茄病毒 番茄斑萎病毒 番茄斑驳花叶病毒 复合侵染 番茄 因其具有丰 富的营养价值 独特的风味 广泛的用途等诸多优 点 被称为神奇的菜中之果 深受人们喜爱 此外 番茄亦是中国广泛种植的设施蔬菜种类之一 而处于中国西北的宁夏地区 位于黄河中上游 地 势自西南向东北呈阶梯下降 坡降相宜 引水方 便 便于灌溉 区内昼夜温差较大 日照时间长 具有得天独厚的资源优势 适宜设施蔬菜的发展 如今 该地区设施番茄的栽培面积占设施农业总 面积的 已经成为国内设施番茄的重要生 产基地 然而 随着番茄需求量的提升 番茄种 植面积也随之扩大 番茄病毒病对番茄种植的影 响也日益突出 已成为宁夏番茄第一大病害 致使 番茄产业深受其害 番茄病毒病 又称蔬菜上的癌症 目前 国内 外共发现 种病毒侵染番茄 有 种番茄病毒 病在中国已被报道 其中 大部分为 病毒 如 番 茄 褪 绿 病 毒 番茄斑驳花叶病毒 南方番茄病毒 番 茄 斑 萎 病 毒 黄瓜花叶病毒 番茄烟草花叶病毒 及番茄花叶病毒 等 年 在宁夏首次发现 毒病中的番茄黄化曲叶病 毒 随 后该病毒向全区蔓延 继 年 番茄斑萎病 毒 在石嘴山地区报道 被病毒感染后 的番茄 其田间症状与番茄缺素症相似 并且番茄 感染不同病毒所表现的症状也相近 又因病毒复 合侵染的现象在田间出现频繁 因此肉眼检视不 能作为病毒病诊断的可靠方法 为此 基因分子 生物学因其具有快捷 灵敏准确及可重复的优点 近些年来被广泛应用到植物病毒的鉴定与诊断 本试验通过采集宁夏银川地区种植的适宜鲜 食不同品种中的疑似番茄病毒病样本 运用分子 生物学鉴定方法 以明确宁夏地区番茄病毒病的 病毒种类和番茄被侵染的状况 为宁夏设施栽培 番茄病害的诊断 抗性品种的筛选及综合防控提 供科学依据 材料与方法 试验材料 试验选用樱桃番茄 品种为 白妃 千禧 黑小哥 香妃 号 黄妃 共 个 口感型大番茄 品种为 号 赛硒柿 号 冠蔬 冠蔬 原味 号 甜脆脆 京番 普罗旺斯 味多美 亚蔬 号 中番 号 塞纳 共 个 于 年 月 日播种育苗 月 日定植于宁夏贺兰园艺产 业园 号日光温室 每个品种定植 株 株行 距 定植前用利尔康 泡腾消毒 片 型 三氯异氰尿酸 对基质及设施进行消毒 定植后按常规方法施肥和管理 大番茄采用单杆 整枝方式 樱桃番茄采用三杆整枝方式 月 日 盛果期 进行田间调查 在番茄的整个生育期 共采集 个番茄品种的 份疑似被侵染的发 病植株叶片 拍照后分别包于锡纸中 做好标记 置于液氮桶 带回实验室 次日进行病毒病鉴定 试验剩余样品存入 冰箱保存 备用 在样 品采集期间不喷施任何化学药剂 温室内的番茄 植株均为自然发病 供试引物信息 供试引物详见表 表 引物序列信息 病毒 引物名称 序列 扩增片段 参考文献 番茄病样总 提取 番茄叶片总的 提取 将 左右冻结 保存的发病番茄叶片迅速转移至消毒且预冷的研 体中 充分研磨至粉末状 装入经液氮预冷的 离心管中 采用 提取试剂盒 用于 的提取及后续试验 番茄总 的提取以及 的合成 将 左右冻结保存的发病番茄叶片迅速转移至 消毒且预冷的研体中 充分研磨至粉末状 装入经 液氮预冷的 离心管中 采用 多糖多酚植物总 提取试剂盒进行样品 总 的提取 随后利用 生物公司的 试剂盒进行反转录 取 的 作为模板并加入 到 将温度调升至 加热 随后迅 速置于冰上骤冷且静置 使 模板变 性 基因组 去除 加入 到上一步的混合液中 并用移液枪吹打使 之混匀 将温度调至 加 热 最 后 于 的混合液中加入 和 于 加热 加热 加热 进行第一链 的合成 期 郜雅欣等 宁夏地区不同品种番茄主要病毒病的分子鉴定及抗性评价 番茄病样 和 检测 常规 检测 将提取到的总 作为模 板与 特异性引物 表 进行检测 反应 体系 引物各 模板 用 补足到 反应程序 预变性 随后 变性 退火 延伸 循环数为 最后于 延伸 冰箱保存 检测 将模板分别与常见的番茄病 毒病特异性引物 表 进行检测 反应体系 模板 上游引物与下游引物 各 加入 并补足到 反应程序同上 在扩增结束后 取 产物 于 的琼脂糖凝胶上在 的电压下进行 电泳检测 左右后在全自动凝胶成像系统 记录结果 番茄抗病性鉴定 病情分级参照许向阳等 的抗性分级方法并 稍作调整 表 根据番茄群体病情分级标准可 分为 免疫 病情指数为 植株不带毒 高抗 病情指数 抗病 病情指数 耐病 病情指数 感病 病情 指数 病情指数计算参照以下公式 病情指数 各级病株数 相对级数值 调查总株数 最高严重度代表值 病株率 病株数 调查总株 表 不同抗性级数的田间表现症状 级数 田间症状 无任何症状 明脉 轻花叶 小部分黄化 含少量褐斑 心叶及中部叶片花叶 小部分黄化 含少量褐斑 心叶及中部叶片花叶 少数叶片畸形 黄化 含少量褐斑且皱缩或植株轻度矮化 重花叶 多数叶片畸形且黄化 含较多褐斑 皱缩且叶缘焦枯或植株矮化 重花叶 畸形 叶片黄化及叶缘焦枯严重 含有大量褐斑 植株明显矮化 甚至死亡 结果与分析 田间症状调查 田间调查发现 年银川地区番茄病毒病 发生较为严重 棚室内番茄病毒病主要有 种症 状 表现为 叶片缩小 部分变黄 叶片边缘褪 绿变紫 节间缩短 植株矮化严重 不可正常开花 结果 图 叶片缩小 褪绿 轻微上卷 出 现褐色且不规则形病斑 此症状由下而上逐渐明 显 图 叶片上卷严重 黄化明显 叶缘焦 枯 节间缩短 长势弱 果实小并存在花脸现象 图 叶脉浓绿 脉间褪绿黄化 叶片边缘焦 枯 叶肉增厚 变脆易碎 植株长势强 图 叶片由叶缘向内侧逐渐褪绿 边缘干枯 叶脉 明显 心叶皱缩突起 图 叶片变小增厚 轻者边缘褪绿 重者边缘褪绿且发红 图 在 以上 种症状的样品中均能检测到 番茄病株样品的 检测分析 将在产业园采集的 份疑似番茄病毒样本 进行总 提取 进而利用特异性引物 和 对其进行 检测 结 果显 示 在 疑 似 番 茄 病 毒 样 品 中 特 异 性 引 物 和 分别可扩增 出 大 小 左右 的相应条带 且条带清晰 无其他非特异性条带产 生 而阴性对照未出现扩增现象 表明在所检测样 品种中 可 检 出 以 上 种 病 毒 其 中 份 病 样 均检出病毒 有 份样品未检测到 病毒检出率 西 北 农 业 学 报 卷 症状 症状 症状 症状 症状 症状 图 番茄病样田间症状 高达 通过田间调查不同品种番茄感病 症状 选取生产上主栽品种 普罗旺斯 的病叶再 次进行总 提取 用以上 种病毒种类 的特异性引物进行 检测 扩增出 和 左右大小的特异性 条带 图 且无杂带出现 说明番茄品种 普罗 旺斯 同时被 和 分子质量标准 南方番茄病毒 番茄花叶病毒 番茄斑驳花叶病毒 番茄斑萎病毒 番茄褪 绿病毒 番茄烟草花叶病毒 番茄黄化曲叶病毒 黄瓜花叶 病毒 阴性对照 图 部分番茄样品的 检测凝胶电泳结果 侵染 侵染不同品种番茄的主要病毒种类及检测 结果 表 表明 口感型番茄 冠蔬 所携带病 毒种类最多 检出 种病毒 仅有 和 未检出 其次是樱桃番茄 与口感番茄 原味 号 普罗旺斯 和 中番 号 检出病毒种类个 数皆为 个 樱桃番茄 千禧 与口感番茄 冠蔬 以及硬果番茄 塞纳 和 携带 种 病毒 不同番茄品种间病毒种类各不尽相同 樱桃 番茄 白妃 和 香妃 号 及口感番茄 赛硒 柿 号 甜脆脆 京番 和 亚蔬 号 以 上 个品种均检测出 及 种病毒 而口感番茄 号 除 及 外 还检测到 樱桃番茄 黄妃 及口 感番茄 味多美 所检出病毒种类较少 为 种 在 黑小哥 品种的 个疑似病样中 未检测出番茄 病毒 由图 可见 检出率最高的为 高达 和其他的病毒种类相比有显著差异 是危害银川地区的主要病毒 其次为 和 检 出 率 分 别 为 和 检出率 略 低 各种类间无差异显著性 分 别 为 期 郜雅欣等 宁夏地区不同品种番茄主要病毒病的分子鉴定及抗性评价 表 不同品种番茄病毒病检测鉴定结果 类型 番茄品种 样本总数量 病毒种类 樱桃番茄 白妃 千禧 黑小哥 香妃 号 黄妃 大果番茄 号 赛硒柿 号 冠蔬 冠蔬 原味 号 甜脆脆 京番 普罗旺斯 味多美 亚蔬 号 中番 号 塞纳 不同小写字母表示差异显著 图 宁夏番茄主要病毒病检出率 不同品种番茄病毒的复合侵染分析 在 份阳性样品中 表 发现单一病毒 病侵染样品量为 份 复合样本为 份 复合侵 染的样品占阳性样本的 其中由 种病毒 复合侵染的样本数量最多 检出率为复合侵染总 比的 主要类型为 和 且 为复合侵染 优 势 种 被 和 种病毒侵染样本占比为 而由 种病毒复合侵染的比率略低 为 其病毒复合侵染类型却多达 种 分别为 西 北 农 业 学 报 卷 和 在复合侵染样本 中 最多检测出 种病毒复合侵染 类型复杂 为 表 宁夏番茄主要病毒病复合侵染率 复合侵染的病毒种类 病毒复合侵染类型 检出个数 占复合侵染总比 不同品种番茄病毒抗性分析 不同番茄品种对病毒病的抗性表现皆不相 同 经抗病性调查后 结果表明 番茄 黑小哥 疑 似病样中没有发生病毒病 发病率为 初步 定为番茄病毒病免疫品种 其余供试番茄品种均 发现不同程度的病毒侵染 发病品种之间发病率 存在较大差异 硬果番茄 塞纳 发病率最高 高达 樱桃番茄 发病率最低 为 樱桃番茄中 千禧 香妃 号 和 及口 感番茄 冠疏 的病情指数分别为 和 为高抗品种 抗性等级为抗病 的樱桃番茄有 白妃 黄妃 口感番茄有 原味 号 甜脆脆 京番 味多美 亚蔬 号 中番 号 赛硒柿 号 硬果番茄有 其中 的病情指数最高 高达 而口感番茄 号 冠蔬 普罗旺斯 和硬果 番茄 塞纳 与 均处于耐病水平 病情指数分 别为 在以上品 种中 免疫品种占参试总品种的 高抗品 种占参试总品种的 而大多数为抗性品 种 占总品种数的 因此 初步认为品种 黑小哥 千禧 香妃 号 和 冠蔬 可以作为宁夏地区春茬设施栽培番茄抗病毒 病备选品种 表 讨论和结论 现如今 番茄种植业已成为宁夏地区蔬菜种 植的主导产业之一 随着其不断的发展 病毒病危 害的问题也越发突出 导致番茄品质与产量严重 下降 制约着当地番茄产业的发展 前人对宁夏 期 郜雅欣等 宁夏地区不同品种番茄主要病毒病的分子鉴定及抗性评价 表 不同品种番茄病毒病抗性评价 品种名称 结果期 病株率 病情指数 抗性等级 品种名称 结果期 病株率 病情指数 抗性等级 高抗 冠蔬 耐病 抗病 原味 号 抗病 高抗 甜脆脆 抗病 白妃 抗病 京番 抗病 千禧 高抗 普罗旺斯 耐病 黑小哥 免疫 味多美 抗病 香妃 号 高抗 亚蔬 号 抗病 黄妃 抗病 中番 号 抗病 号 耐病 抗病 赛硒柿 号 抗病 塞纳 耐病 冠蔬 高抗 耐病 地区病毒病种类有所鉴定与分析 但缺少不同病 毒对番茄侵染的主次关系相关报道 因此 对该地 区番茄病毒病的发展现状进行系统研究刻不 容缓 本研究从银川市贺兰园艺产业园 号日光 温室采集 份疑似病毒感染番茄叶片 利用分 子生物学手段 对其样品进行 病 毒分子检测 分析结果显示 侵染番茄的病毒种类 伴有以上 种 且 的样品都被病毒所感 染 在本试验中 为银川地区优势种 检出率高达 且在当地首次发现 本研究 为宁夏自治区番茄上发现 的首次报道 由于该病毒是近年来植物上新发现的一种病毒 并且 已对多个地区包括番茄在内的多种植物侵 染 从 年中国首次报道该病毒以来 截至到 年 已有 个省份发现 其中 海南省 和辽宁省 受到该病毒侵染并引发番 茄产量难以提升的困扰 番茄斑驳花叶病毒 属 于烟草花叶病毒属 其传播方式主要为汁液摩擦 目前 研究报道指出此病毒亦可寄主在部分作物 的种子上 因而 的寄主种类和范围 可能较为广泛 并且有相关报道提到 在对不同品种番茄之间的抗 耐病性进行评价时 比 更容易侵染一些品种 并且表现的症状 也更为严重 因此 番茄斑驳花叶病毒在银川 市大爆发 此外 采样时期温度高 降雨少 棚内 粉虱 蓟马大量聚集 可通过昆虫传播 而据最新研究表明 除了可以种传以外 还可 利用花粉快速传播 其传播效率与番茄的品种呈 相关关系 以上因素与二者普遍发生息息相 关 进而使 和 也成为该地区番茄上 不容忽视的主要病毒 番茄病毒病在各地报道的优势种类有所不 同 在不同的品种上亦是如此 其种类繁多 侵染 类型较为复杂 复合侵染也层出不穷 且当不同病 毒发生复合侵染时 作物往往会表现出协生作 用 本研究通过样品鉴定与数据分析发现 银 川地区番茄病毒病复合侵染类型共有 个 其中 半数以上样本是由 种或 种病毒共同侵染 部 分样本甚至出现 种病毒复合侵染的现象 为银 川地区番茄病毒病的防控和治理增加难度 而出 现番茄病毒病复合侵染严重的现象可能归因于病 毒的传播方式和田间管理及外来病毒入侵等 如 和 可通过两种传 播方式进行传播 一种是机械传播 另外则是通过 昆虫媒介进行传播扩散 其中 部分介体传播 时可以携带多种病毒 对番茄植株刺吸后 将携带 病毒一并传染至植物体内 导致发生多种病毒复 合侵染现象 而 与其他番茄病毒复合侵染 的现象较为普遍 据国外检测的报道 分别 与 和 复合侵染 在国内 复 合侵染的现象更为明显 与 西 北 农 业 学 报 卷 于山东寿光在同一样本上被检测到 新 疆部分番茄样品中发现 和 共存 而北京出现了 与 复合侵染 的现象 除了上述情况之外 在分析结果中发 现 超过半数的复合侵染都出现了 由 此可见 该病毒的入侵使银川市病毒病复合侵染 的类型更加多样化 由于当前尚无明确统一的番茄病毒病抗性评 价标准 因此 本试验以烟粉虱 蚜虫 蓟马等昆虫 在常规管理条件下传播番茄病毒的方式 将病情 指数 病毒 检测 病毒检出量及植株长势等 综合指标相结合 对不同品种番茄进行抗病性鉴 定 与 等 的评估方法具有一定的相似 性 相较使用单一指标评估更加全面和客观 鉴 定结果发现 在本研究所有参试品种中 樱桃番茄 黑小哥 对番茄病毒病免疫 未检测出以上 种 番茄病毒病 且在田间表现出长势强 产量高 口 感好等诸多优点 其次为樱桃番茄 千禧 香妃 号 和 及口感番茄 冠疏 为高 抗等级的番茄品种 病毒病侵染率较其他品种偏 低 在田间表现良好 而对番茄病毒病表现出抗病 的樱桃番茄 与口感番茄 赛硒柿 号 病情 指数分别为 和 二者的发病率与高抗番 茄 香妃 号 相同 皆为 且在田间植株总 体表现出健康状态 此外 媒介昆虫是虫媒植物 病毒传播扩散的重要 桥梁 基于宁夏地区 月气温高 降雨少 是烟粉虱 蚜虫 蓟马等昆 虫生存的有利条件 为了避免因昆虫传毒而致番 茄病毒病大爆发现象的出现 暂不采用携带 种 病毒的樱桃番茄 综合考虑 初步判定 黑小哥 千禧 香妃 号 冠疏 和 赛硒柿 号 这 个品种为抗病毒品种 后期可进行品种与多种病 毒靶标对峙抗性 进一步验证抗病毒品种 为宁夏 番茄病毒病的综合防控及番茄的产业发展提供理 论依据和技术指导 参考文献 刘 卫 姚永康 刘士辉 番茄黄化曲叶病毒及其抗性基因 研究进展 上海农业科技 沙 龙 高艳明 李建设 宁夏番茄黄化曲叶病毒病分子鉴 定及防控措施 北方园艺 刘 勇 李 凡 李月月 等 侵染我国主要蔬菜作物的病毒 种类 分布与发生趋势 中国农业科学 曹金强 谢学文 柴阿丽 等 李宝聚博士诊病手记 九十三 番茄斑萎病毒病在宁夏的发现与防治 中国蔬菜 陈利达 石延霞 谢学文 等 我国不同地区番茄主要病毒病 种类的分子检测与分析 华北农学报 许向阳 李景富 孙清芳 番茄 叶霉病 枯萎病苗期多 抗性鉴定方法研究 北方园艺 涂丽琴 吴淑华 高丹娜 等 辽宁省番茄上番茄斑驳花叶 病毒的分子鉴定 江苏农业学报 期 郜雅欣等 宁夏地区不同品种番茄主要病毒病的分子鉴定及抗性评价 李云洲 默 宁 闫见敏 等 番茄斑萎病毒病研究进展 园艺学报 杨海燕 崔百明 张 强 等 新疆番茄病毒病检测及南方 番茄病毒全基因组序列测定与传播特性分析 植物保 护学报 张 强 崔百明 郑银英 等 新疆加工番茄上南方番茄病 毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达 西北农林科技大 学学报 自然科学版 董云浩 雷喜红 李云龙 等 警惕种子传带的南方番茄病 毒 对我国番茄产业的危害 植物保护 丁 天 波 周 雪 杨 楠 等 单 独 侵 染 和 复合侵染番茄植株上烟粉虱寄主适应 性及寄主植物营养成分含量和防御反应变化 昆虫学 报 西 北 农 业 学 报 卷 责任编辑 郭柏寿 期 郜雅欣等 宁夏地区不同品种番茄主要病毒病的分子鉴定及抗性评价