云南省蓝莓茎基腐病病原菌鉴定及其生物学特性分析_杨秀梅.pdf

植物保护学报Journal of Plant Protection 2022 49 4 1085 1092 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2022 2020266 云南省蓝莓茎基腐病病原菌鉴定及其生物学特性分析 杨秀梅 1 瞿素萍 1 张艺萍 1 吴学尉 2 王丽花 1 1 云南省农业科学院花卉研究所 国家观赏园艺工程技术研究中心 云南省花卉育种重点实验室 昆明650205 2 云南大学农学院 昆明650504 摘要 为明确云南省蓝莓茎基腐病的病原菌种类及其生物学特性 从玉溪市江川区蓝莓种苗种植 基地采集具有茎基腐病典型症状的蓝莓病株进行病原菌分离 纯化和致病性测定 对病原菌形态学 特征进行观察并基于Act H3 EF 1 和 tub基因序列分析进行分子生物学鉴定 同时对病原菌的 生物学特性进行室内测定 结果表明 分离到的病原菌纯化菌落为深棕色 菌丝白色至红褐色 大 型分生孢子梗无色透明 长150 400 m 分枝末端产生2 4个瓶梗 囊泡球形或近球形 大小为 15 23 m 6 15 m 大型分生孢子无色透明 直圆柱形 一端稍窄 大小为45 80 m 4 8 m 基 于Act H3 EF 1 和 tub基因构建系统发育树 菌株BC 1 BC 2与冬青丽赤壳Calonectria ilicicola 均聚在同一分支 结合形态学特征与系统发育分析结果 将云南省蓝莓茎基腐病病原菌鉴定为冬青 丽赤壳C ilicicola 病原菌对可溶性淀粉的利用效果最好 菌丝生长的最适氮源为蛋白胨 最适生 长温度为25 最适pH范围为4 7 关键词 蓝莓 茎基腐病 冬青丽赤壳 鉴定 生物学特性 Identification and biological characteristics of the pathogen causing stem base rot of blueberry inYunnan Yang Xiumei 1 Qu Suping 1 Zhang Yiping 1 Wu Xuewei 2 Wang Lihua 1 1 Yunnan Key Laboratory for Flower Breeding National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture Flower Research Institute YunnanAcademy ofAgriculture Sciences Kunming 650205 Yunnan Province China 2 School ofAgriculture Yunnan University Kunming 650504 Yunnan Province China Abstract To clarify the pathogen causing stem base rot of blueberry inYunnan Province and its biologi cal characteristics the diseased plants with typical symptoms of stem base rot were collected from the blueberry seedling planting base in Jiangchuan District Yuxi City for pathogen isolation purification and pathogenicity determination The morphological characteristics of pathogens were observed and their Act H3 EF 1 and tub gene sequences were analyzed The results showed that the colonies of the purified isolates were dark brown and the hyphae were white to reddish brown The large conidium stalks were colorless and transparent 150 400 m long with two to four bottle shaped conidiogenous cells at the end of each branch Vesicles were spherical or nearly spherical with a size of 15 23 m 6 15 m Large conidia were also colorless and transparent straight cylindrical slightly narrow at one end and the size was 45 80 m 4 8 m The phylogenetic tree based on Act H3 EF 1 and tub genes indicated that selected isolates BC 1 BC 2 and Calonectria ilicicola were clustered in the same branch Combining the results of morphological characteristics and phylogenetic analysis the pathogen causing blueberry stem base rot in Yunnan Province was identified as C ilicicola The results of biologi 基金项目 云南省乡村振兴科技专项 202104BI090014 通信作者 Author for correspondence E mail wanglihua cn 收稿日期 2020 10 23 1086 植 物 保 护 学 报 49卷 蓝莓为一种新兴的世界性小浆果类果树 是原 产于北美地区的杜鹃花科越橘属Vaccinium蓝果类 型植物 蓝莓果实含有丰富的营养成分 尤其富含 花青素 黄酮类和多糖类化合物 具有良好的营养和 保健价值 被联合国粮农组织列为世界五大健康食 品之一 王佳宁等 2016 我国自2000年开始蓝莓 的商业化种植 截止2020年底 全国蓝莓栽培面积 6 64万hm 2 总产量34 72万t 鲜果产量23 47万t 李 亚东等 2021 近年来随着蓝莓产业的不断发展 种植面积逐年增加 蓝莓病害发生也随之增多 严重 影响蓝莓的产量和品质 丽赤壳属Calonectria真菌是一类重要的植物 病原菌 其无形态为帚梗柱孢霉Cylindrocladium 该属真菌主要分布在热带和亚热带地区 主要引起 植物叶斑 枝枯和根茎腐烂 其寄主范围广泛 可侵 染约100个科335种植物 殷瑜 2016 在我国 丽 赤壳属真菌严重危害绿巨人 桉树 花生和大豆等植 物 造成巨大的经济损失 据报道 广州市从台湾省 引进的绿巨人幼苗 1个月内被天南星帚梗柱孢Cyl indrocladium spathiphylli侵染而腐烂死亡的植株比 例高达60 姜子德和戚佩坤 1997 广西壮族自 治区北海市合浦县常乐镇和曲樟乡等地由柱枝双孢 霉Cy scoparium和帚梗柱枝菌Cy quinqueseptatum 侵染引起的桉树焦枯病发病率达75 以上 庞联东 等 2001 广东省由冬青丽赤壳Ca ilicicola侵染 引起的花生黑腐病和大豆冠腐病发病率分别高 达50 和80 Guan et al 2010 Pan et al 2009 2007年 我国将冬青丽赤壳列入 中华人民共和国 进境植物检疫性有害生物名录 盖云鹏等 2016 近年来 随着国内蓝莓种植面积不断扩大 种植 区不断有丽赤壳属真菌危害蓝莓的报道 如冯璐 2007 对发生于辽东地区的蓝莓叶斑病进行研究 发现病原菌为柯氏丽赤壳Ca colhounii 费诺亚等 2017 将湖北省随州市蓝莓苗木枝枯病的病原菌鉴 定为加拿大丽赤壳Ca canadensis 丽赤壳菌可随 蓝莓苗木进行远距离传播 且病原体以微菌核的形 式长期存在于土壤或植物病残体中 田块一旦发过 病就会残留抗逆性强的病菌子囊壳 微菌核和厚垣 孢子 给蓝莓病害防控带来很大困难 盖云鹏等 2016 笔者于2019年10月在云南省玉溪市江川区 的蓝莓种苗生产基地开展病害调查时 发现品种莱 格西和天后等2 3年生蓝莓种苗出现茎基腐病症 状 表现为植株茎基部发黑变腐 枝条枯萎 叶片干 枯脱落 受害植株1 2月内即枯萎死亡 据调查 品 种莱格西较易感病 发病率超过40 在一些地块甚 至成片死亡 严重影响蓝莓种苗的产量和品质 为 明确该病的病原菌种类 本研究对采集自云南省玉 溪市的典型发病蓝莓植株进行病原菌的分离鉴定 致病性测定及其生物学特性分析 以期为云南省蓝 莓茎基腐病的发生 流行规律研究和综合防治提供 理论依据 1 材料与方法 1 1 材料 供试病样及植物 2019年10月自云南省玉溪市 江川区蓝莓种苗基地采集蓝莓品种莱格西感茎基腐 病病株10株 带回实验室于4 保存 同时在该基 地选取健康蓝莓品种莱格西植株 带回室内备用 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂 potato dextrose agar PDA 培养基成分为马铃薯200 g 葡萄糖20 g 琼脂18 g 蒸馏水1 L 麦芽汁琼脂 malt extract agar MEA 培养基成分为麦芽汁20 g 琼脂18 g 蒸 馏水1 L 香石竹叶片琼脂 carnation leaf agar CLA 培养基成分为葡萄糖18 g 琼脂18 g 蒸馏水1 L 灭 菌后倒平板 将新鲜香石竹叶片剪成长度为2 cm的 小片 凝固前每个平板平铺3片 4 水琼脂 water agar WA 培养基成分为琼脂40 g 蒸馏水1 L 查彼 Czapek 培养基成分为NaNO 3 2 g KCl 0 5 g Fe SO 4 7H 2 O 0 01 g K 2 HPO 4 1 g MgSO 4 7H 2 O 0 5 g 蔗 糖30 g 琼脂18 g 蒸馏水1 L 试剂及仪器 DNA提取试剂盒 dNTP Taq酶 Buffer 宝生物工程 大连 有限公司 其他试剂均为 国产分析纯 Powercylcer Gradient SL梯度PCR仪 德国Analytik Jena公司 DYCP 31DN型电泳仪 北 京六一仪器厂 721BR凝胶成像系统 美国Bio Rad 公司 5430R离心机 德国Eppendorf公司 E800生物 显微镜 日本Nikon公司 400BS隔水式恒温培养 箱 上海跃进医疗器械厂 KBW240光照培养箱 德 cal characteristics showed that among the five tested carbon hydrates soluble starch was the best carbon source for BC 2 The optimum nitrogen source for mycelial growth of BC 2 was peptone the optimum growth temperature was 25 and the optimum pH range was 4 7 Key words blueberry stem base rot Calonectria ilicicola identification biological characteristics 4期 杨秀梅等 云南省蓝莓茎基腐病病原菌鉴定及其生物学特性分析 1087 国Binder公司 1 2 方法 1 2 1 蓝莓茎基腐病的调查 于2019年10月在云南省玉溪市江川区的蓝莓 种苗基地开展蓝莓茎基腐病的调查 调查品种为莱 格西 天后 茶花 珠宝 绿宝石 奥尼尔和春高共 7个蓝莓品种 参照方中达 1998 五点取样法进行 调查 每点取30 50株 每7 d调查1次 记录病害发 生情况并计算发病率 1 2 2 蓝莓茎基腐病病原菌的分离与形态学鉴定 采用常规组织分离法 方中达 1998 分离病原 菌 取莱格西病株茎基部病健交界处组织 切成边 长为0 5 cm的小方块 经75 酒精与0 1 升汞消毒 后 灭菌水清洗3次后置于PDA平板上 25 暗培 养5 d后 从菌落边缘挑取菌丝至新的PDA平板上 25 暗培养7 d后 用打孔器打取直径为5 mm的菌 饼 接种至离体健康莱格西蓝莓叶片上 置于放有湿 滤纸片的培养皿中 于25 12 h光照 12 h黑暗条 件下培养5 d后挑取菌丝进行镜检 观察到分生孢 子产生后 挑取孢子并配制浓度为1 10 5 个 mL的悬 浮液母液 将母液稀释10 4 倍并混匀 取0 1 mL孢 子悬浮液均匀涂布在4 WA平板上 将培养基切成 0 4cm 0 4cm的小块 逐个镜检后挑取带有单个分生 孢子的琼脂块置于新的PDA平板上 25 培养获得 纯培养物 接种至PDA斜面培养基上 4 保存备用 从分离菌株中选择菌株BC 1 BC 2分别接种 至MEA平板上 25 黑暗培养7 d后测量菌落直径 并观察其形学态特征 同时参照殷瑜 2016 方法将 供试菌株接种至CLA平板上 25 黑暗培养7 d后 观察分生孢子梗及囊泡的形状 并随机选取20个分 生孢子 观察其形态 隔膜数 并测量其大小 1 2 3 蓝莓茎基腐病病原菌的分子生物学鉴定 以菌株BC 1 BC 2为代表菌株进行病原菌的 分子生物学鉴定 从MEA平板上挑取适量菌丝 采 用CTAB法提取菌丝基因组DNA 设计肌动蛋白 actin Act 组蛋白H3 histon H3 H3 延伸因子 1 蛋白 elongation factor 1 EF 1 和 微管蛋白 tubulin tub 的编码基因的特异性引物 表1 进行 PCR扩增 引物均由宝生物工程 大连 有限公司合 成 25 L PCR反应体系 2 Taq PCR Green Mix 12 5 L 10 mol L上下游引物各1 L DNA模板 2 L ddH 2 O 8 5 L PCR扩增程序 94 预变性 3 min 94 变性30 s 50 退火30 s 72 延伸1 min 35个循环 最后72 延伸10 min PCR产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳检测后 送至宝生物工程 大连 有 限公司测序 将测序结果输入NCBI数据库进行 BLAST同源性比对 从GenBank下载丽赤壳属近缘 种的Act H3 EF 1 和 tub基因序列作为参考序 列 利用MEGA7 0软件对基因序列进行比对分析 序列两端切齐后首尾相连 连接顺序为Act H3 EF 1 tub 以邻接法对4个基因的联合序列进行系统 发育分析 重复检验1 000次 表1 目的基因片段扩增引物及序列信息 Table 1 Primers used in this study and their target gene segments 基因片段 Target gene Act H3 EF 1 tub 引物名称 Primer name ACT 512F ACT 783R CYLH3F CYLH3R EF1 728F EF2 T1 CYLTUB1R 引物序列 5 3 Primer sequence 5 3 ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC TACGAGTCCTTCTGGCCCAT AGGTCCACTGGTGGCAAG AGCTGGATGTCCTTGGACTG CATCGAGAAGTTCGAGAAGG GGARGTACCAGTSATCATGTT AACATGCGTGAGATTGTAAGT AGTTGTCGGGACGGAAGAG 参考文献 Reference Carbone C D symptoms of leaves 图1 云南省蓝莓茎基腐病的田间症状 Fig 1 Symptoms of blueberry stem base rot in the fields inYunnan Province 2 2 蓝莓茎基腐病病原菌的分离和形态学鉴定 共分离纯化得到9株单孢菌株 各菌株形态学 特征无明显差异 菌株在MEA培养基上生长较慢 平均生长速度为5 8 mm d 菌落近圆形 边缘不整 齐 菌丝绒毛状 白色至红褐色 菌落背面呈深棕色 图2 A B 大型分生孢子梗由总梗 多级扫帚状 分枝 末端含囊泡的延伸梗组成 具隔 无色透明 长 150 400 m 末端囊泡带梗 为球形或近球形 大小 为15 23 m 6 15 m 图2 C D 分生孢子梗分 枝末端产生2 4个瓶梗 顶端为产孢细胞 呈瓶状 分生孢子从产孢细胞内生出 图2 E G 大分生孢 子无色透明 呈直圆柱形 一端稍窄 大小为45 80 m 4 8 m 具1 3个隔膜 隔膜处未见明显缢 缩 图2 H 根据形态学特征 将该病原菌初步鉴 定为丽赤壳属Calonectria真菌 2 3 蓝莓茎基腐病病原菌的分子生物学鉴定 将供试菌株BC 1 BC 2的Act H3 EF 1 和 tub基因序列提交至GenBank 菌株BC 1获得基因 序列登录号为MW447130 MW447131 MW447132 和MW447133 菌株BC 2获得基因序列登录号为 4期 杨秀梅等 云南省蓝莓茎基腐病病原菌鉴定及其生物学特性分析 1089 MT683618 MT683619 MT683620 和 MT683621 菌株的Act H3 EF 1 和 tub序列与GenBank中 冬青丽赤壳相关序列的同源性为99 100 基于 Act H3 EF 1 tub多基因序列构建系统发育树 代 表菌株BC 1 BC 2均与冬青丽赤壳位于同一分支 图3 结合形态学特征和分子生物学鉴定结果 最终将云南省蓝莓茎基腐病的病原菌鉴定为冬青丽 赤壳C ilicicola 2 4 蓝莓茎基腐病病原菌的致病性 健康蓝莓活体枝条接种供试菌株后发病较快 48 h后接种部位即出现长度为0 5 1 0 cm的红褐色 水浸状病斑 接种5 d时病斑长度扩展至3 0 5 0 cm 接种10 d后植株枯萎死亡 而对照植株未发病 图 4 取发病植株进行病原菌的再分离 重新获得与 接种菌形态学特征一致的病原菌 通过柯赫氏法则 验证证明原接种菌株为蓝莓茎基腐病的病原菌 A B MEA培养基上菌落的正面和背面形态 C 大型分生孢子梗 D 囊泡 E G 分生孢子梗和产孢细胞 H 大 型分生孢子 A B Frontal and reverse colony morphologies on MEAmedium C macroconidiophore D vesicle E G conidiophores and conidiogenous cells H macroconidia 图2 云南省蓝莓茎基腐病病原菌的形态学特征 Fig 2 Morphological characteristics of the pathogenic isolates causing stem base rot on blueberry inYunnan Province 图3 基于Act H3 EF1 和 tub基因联合序列以邻接法构建云南省蓝莓茎基腐病病原菌及相关近缘种的系统发育树 Fig 3 Phylogenetic tree of pathogenic isolates causing blueberry stem rot inYunnan and its related sibling species based onAct H3 EF1 and tub gene sequences by neighbor joining 括号内的登录号依次对应Act H3 EF1 和 tub基因序列 The accession no in parentheses correspond to Act H3 EF1 and tub gene sequences 1090 植 物 保 护 学 报 49卷 A 对照植株 B 接种菌株BC 1后发病植株 C D 接种菌株BC 2后发病植株 A Control B diseased plant after infected isolate BC 1 C D diseased plants after infected isolate BC 2 图4 云南省蓝莓茎基腐病病原菌的致病性测定 Fig 4 Pathogenicity test of selected isolate BC 2 on blueberry under greenhouse conditions 2 5 蓝莓茎基腐病病原菌的生物学特性 2 5 1 病原菌对碳源和氮源的利用 供试菌株在5种碳源培养基上均能生长 对可 溶性淀粉的利用效果最好 培养7 d时菌落直径为 6 78 cm 其次为麦芽糖和葡萄糖 两者对菌丝生长 的影响差异不显著 病原菌对果糖的利用效果最差 培养7 d时菌落直径为4 06 cm 图5 A 在氮源利 用试验中 供试菌株对蛋白胨和甘氨酸的利用效果 较好 培养7 d时菌落直径分别为8 14 cm和8 00 cm 病原菌对尿素和硝酸钠的利用效果较差 两者对菌 丝生长的影响差异不显著 图5 B 图5 碳源 A 氮源 B 温度 C 和pH D 对云南省蓝莓茎基腐病病原菌菌丝生长的影响 Fig 5 Effects of carbon source A nitrogen source B incubation temperature C and pH D on mycelia growth of isolate BC 2 obtained from blueberry stem rot inYunnan Province 图中数据为平均数 标准差 不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P 0 05水平差异显著 Data are mean SD Different lowercase letters indicate significant difference at P 0 05 level by Duncan s new multiple range test 4期 杨秀梅等 云南省蓝莓茎基腐病病原菌鉴定及其生物学特性分析 1091 2 5 2 不同温度 pH对菌丝生长的影响 供试菌株在10 30 范围内均能生长 最适宜 温度为25 菌落直径为8 11 cm 温度为10 20 时菌丝生长较缓慢 温度为35 时菌丝停止生长 图5 C 供试菌株对环境酸碱度的适应范围较 广 在pH 4 10范围内均能生长 最适pH范围为4 7 图5 D 3 讨论 准确的分类鉴定是研究病原菌种群结构 传播 途径 流行规律以及病害综合防治的基础 我国蓝 莓产区发现的丽赤壳菌有多个种 因此病原菌的鉴 定工作显得尤为重要 在丽赤壳属真菌的鉴定中 形态学分类的重要依据是囊泡的形状 但是球形囊 泡与梨形或卵圆形囊泡容易混淆 Hirooka et al 2009 因此在确定菌株的种群分类时还需进行进一 步的分子生物学鉴定 目前结合形态学特征和多基 因系统学鉴定该属真菌已成为发展趋势 殷瑜 2016 Lombard et al 2010 对丽赤壳菌属的68个 种进行了Act tub Cal H3 ITS Lsu及EF 1 七段 基因的多基因联合系统发育分析 根据聚类分析及 形态学特征将其划分为扁平囊泡组和球形囊泡组 2个大类13个复合群 建议对于未知的丽赤壳菌属 真菌的鉴定 可应用H3 EF 1 和 tub这3段基因 联合构建系统发育树来确定其分类地位 本研究通 过Act H3 EF 1 和 tub共4段基因联合构建系统 发育树的方法 将云南省蓝莓茎基腐病的病原菌鉴 定为冬青丽赤壳 与丽赤壳属真菌的其他相似种能 进行明显区分 病原菌的生物学特性与病害的发生和流行规律 有着密切联系 吴恩果等 2020 盖云鹏等 2016 研究结果表明 引起花生黑腐病的冬青丽赤壳在 10 30 范围内均能生长 温度低于5 或高于35 时菌丝停止生长 菌丝最适生长温度为25 28 费 诺亚等 2017 对加拿大丽赤壳的生物学特性研究结 果表明 菌丝生长的最适温度为25 但在5 与 35 条件下菌丝不能生长 这与本研究结果一致 本研究中 病原菌菌丝生长的最适pH范围为4 7 表明该菌适宜在中性偏酸性的条件下生长 该菌对 可溶性淀粉的利用效果最好 这与费诺亚等 2017 的研究结果一致 冬青丽赤壳在pH 4 10范围内均 能生长 且对大部分供试碳 氮源均可有效利用 表 明该菌有较强的环境适应性 这也许是丽赤壳属真 菌在全世界范围内均有分布且寄主范围广泛的原因 之一 近年来国内蓝莓种植面积不断扩大 不同种植 环境 品种布局与种苗来源影响着病害发生的多样 性 我国蓝莓产区发现有柯氏丽赤壳Ca colhounii 和加拿大丽赤壳 以及本研究在云南省玉溪市蓝莓 种苗基地发现的冬青丽赤壳 表明随着蓝莓商业化 种植由北向南延伸 丽赤壳属真菌在蓝莓种植区的 种群分布越来越丰富 其对蓝莓产业的潜在威胁不 容忽视 该属真菌在云南省乃至全国蓝莓种植基地 的种群分布 危害情况以及病害流行规律都有待进 一步研究 冬青丽赤壳菌引起的蓝莓茎基腐病是典 型的土传和种传病害 为防治该病害建议在种植蓝 莓时应选择无病地块 种苗种植前应进行消毒处 理 此外 田间发现病株应及时销毁 并对病株周围 土壤进行消毒 发病地块应注意水旱轮种 或与其他 作物轮作 参 考 文 献 References Carbone I Kohn LM 1999 A for designing primer sets for spe ciation studies in filamentous ascomycetes Mycologia 91 3 553 556 Crous PW Groenewald JZ Ris de JM Simoneau P Hyde KD 2006 Calonectria species and their 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