番茄枯萎病菌分离鉴定及嫁接砧木抗病性评价.pdf

褚新培 男 硕士研究生 主要从事设施蔬菜抗逆和抗病研究 E mail chuxinpei 通讯作者 Corresponding author 高洪波 女 教授 博士生导师 主要从事设施蔬菜与无土栽培研究 E mail hongbogao 收稿日期 2019 12 04 接受日期 2020 03 06 基金项目 河北省重点研发计划项目农业关键共性技术攻关专项 18226907D 国家自然科学基金项目 31872132 番茄枯萎病菌分离鉴定及嫁接砧木抗病性 评价 褚新培 1 吕桂云 1 鹿秀云 2 贾邱颖 1 梁 垚 1 高洪波 1 1 河北农业大学园艺学院 河北省蔬菜产业协同创新中心 河北保定 071001 2 河北省农林科学院植物保 护研究所 河北保定 071000 摘 要 从河北省番茄栽培面积较大的定兴和肥乡地区枯萎病病株中分离纯化菌株 通过形态学和分子生物学等方法对病原 菌进行鉴定 并采用浸根法鉴定了 10 个番茄砧木的枯萎病抗性 结果表明 从定兴和肥乡分离到的菌株均为尖孢镰孢菌 采用尖孢镰孢菌生理小种特异性引物进行 PCR 扩增 证明 2 个菌株都为尖孢镰孢菌番茄专化型 Fusarium oxysporum f sp lycopersici 生理小种 3 筛选得到了 3 个枯萎病高抗砧木品种 7 个抗病砧木品种 关键词 番茄 枯萎病菌 砧木 抗病性 主专化性 王卿和林玲 2016 目前发现的番茄 枯萎病菌生理小种有 3 个 分别为生理小种 1 2 3 徐艳辉 等 2008 郑贵彬和王发科 2000 王全华等 1996 刘晖等 1991 分别对西安 黑龙江和山东地区的番茄枯萎病菌生理小种进行了 鉴定 结果均为生理小种 1 山西省的枯萎病菌除 了生理小种 1 外 生理小种 2 3 也有分布 Chang et al 2018 然而其他地区有关番茄枯萎病菌类 型和分布的研究较少 枯萎病菌生理小种目前尚不 明确 大量试验研究和生产实践表明 不同番茄品种 抗枯萎病能力存在差异 抗生理小种 2 的品种同时 也抗生理小种 1 生理小种 3 可以使抗生理小种 1 和 2 的番茄植株感病 Sato Araki 1974 Jarvis Shoemaker 1978 研究证明 嫁接栽培已经成为 瓜类 王志强 等 2019 和茄果类 李文嘉和莫贱 友 2003 蔬菜防治枯萎病的有效途径 嫁接苗抗 病能力主要取决于砧木的抗性 番茄嫁接砧木对枯 萎病抗性的研究起步较晚 对不同砧木抗病性的评 价以及番茄抗枯萎病指标的筛选有待进一步深入 为此 本试验从河北省两个番茄主产区内枯萎病发 病严重区域分离 纯化和鉴定病原菌 旨在明确河 北省的尖孢镰孢菌番茄专化型生理小种 采用浸根 的方法接菌 鉴定不同番茄砧木品种的抗病性 为 番 茄 Solanum lycopersicum 是茄科番茄属 一年生或多年生草本植物 含有丰富的番茄红素 胡萝卜素和维生素等营养物质 河北省作为我国番 茄主要产区 番茄种植区域广泛 2018 年栽培面 积已超过 7 万 hm 2 总产量逾 470 万 t 黄志乔 2019 随着栽培时间的延长 连作障碍日趋严重 近年来河北省番茄枯萎病发生情况呈逐年上升趋 势 尤其设施生产中更加严重 常在开花期侵染番 茄茎基部造成维管束堵塞 植株萎蔫枯死 从而严 重影响番茄的产量和品质 现已成为影响番茄栽培 面积扩大和效益提升的重要病害之一 张荣 等 2011 枯萎病菌是一种世界范围内广泛分布的真菌 致病菌为尖孢镰孢菌 Fusarium oxysporum 有较 强的腐生或寄生能力 通常通过土壤和种子传病 枯萎病菌寄主范围较广 可以侵染西瓜 番茄 黄 瓜 香蕉 苦瓜等作物 研究证明枯萎病菌具有寄 64 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文 2020 6 64 68番茄枯萎病的快速鉴定以及减轻枯萎病对河北省番 茄生产的影响提供理论和实践依据 1 材料与方法 2018 年 4 月分别从河北省定兴和肥乡种植番 茄的温室中采集枯萎病典型发病植株各 10 株 在 实验室内分离每个病株得到菌株 从两地菌株中各 取 5 个进行形态学鉴定和分子鉴定 然后各挑选 1 个菌株于 5 12 月在河北农业大学农林教学基地日 光温室内进行番茄砧木抗病试验 1 1 菌株的分离纯化及鉴定 1 1 1 菌株的分离纯化 采用组织分离法 取番茄 有病症的茎段 20 30 cm 用 75 酒精消毒后 用灭菌手术刀切取发病部位 4 5 cm 的组织到灭菌 PDA 培养皿中 放入 25 恒温培养箱中培养 3 4 d 后观察待分离菌的生长情况 并用单孢分离法 高 微微 1992 对分离物进行纯化 1 1 2 形态学鉴定 根据英国Booth 分类系统 Booth 1971 以及菌落在 PDA 培养基上的颜色 和形态对定兴菌株和肥乡菌株进行形态学鉴定 1 1 3 生理小种鉴定 采用真菌 DNA 快速提取试 剂盒 购自生工生物工程 上海 股份有限公司 提取病菌 DNA 提取物于 20 保存 利用镰孢 菌的通用引物 FOF1 FOR1 Mishra et al 2003 进行 PCR 扩增 反应体系为 25 L 模板 2 L MIX 12 5 L 上 下游引物各1 L ddH 2 O 8 5 L PCR 扩增程序为 98 预变性 1 min 98 变性 8 s 51 退火 20 s 72 延伸 6 s 35 个循环 72 延伸 10 min PCR 反应产物采用 1 琼脂糖 凝胶电泳检测 参考 Hirano 和 Arie 2009 的方法 用 2 对特异性引物 sp13f r 和 sp23f r 扩增 DNA 片 段 进行番茄枯萎病菌的生理小种鉴定 反应体系 为 25 L 模板 2 L MIX 12 5 L 上 下游引物 各 1 L ddH 2 O 8 5 L PCR 扩增程序为 98 预 变性 45 s 98 变性 7 s 51 退火 20 s 72 延 伸 4 s 35 个循环 72 延伸 2 min PCR 反应产 物采用 1 琼脂糖凝胶电泳检测 1 2 砧木抗病性评价 1 2 1 砧木培养 砧木种子经温汤浸种后播于灭 菌的基质穴盘内进行育苗 待幼苗长到两叶一心 时进行接菌处理 砧木品种共 10 个 果砧 1 号 购自京研益农 北京 种业科技有限公司 砧木 A1 爱好 劲霸 购自瑞克斯旺种子有限公司 CHENG GONG 购自荷兰德奥特种子公司 欧砧 006 购自北京开心格林农业科技有限公司 奥尼 TMS 150 番茄砧木 405 购自上海惠和种业有限 公司 砧木 3 号 购自广州华艳种子公司 1 2 2 致病性测定 用 PDA 培养基继续培养定兴 和肥乡地区纯化后的菌株 用 PDB 培养液摇菌过 滤菌丝 调整孢子液浓度为 1 10 7 个 mL 1 采用 浸根法接种病菌 王全华 等 1996 每个菌株接 种 18 株 以不接菌处理作为对照 接种后 15 d 统 计病情指数 1 2 3 病情指数调查 病情分级标准 柏敏战和郑 贵 彬 1997 0 级 无症状 1 级 1 2 片子叶 明显变黄以致脱落 2 级 1 2 片真叶变黄或全株 发黄 叶片萎蔫下垂 3 级 全株明显萎蔫或真叶 严重变黄 生长受抑制 矮化 4 级 全株严重萎蔫 枯死 各级发病株数 相应发病级数 最高发病级数 接种总株数 病情指数 100 群体抗病性划分标准 高抗 HR 0 病情 指数 5 抗 病 R 5 病情指数 20 耐 病 T 20 病情指数 40 感病 S 病情指数 40 1 3 数据处理 试验数据采用 SPSS Statistics 22 和 Excel 软件 进行分析及作图 应用 Duncan 新复极差法进行差 异显著性检验 2 结果与分析 2 1 田间发病症状 图 1 A 为番茄枯萎病发病中期整株症状 图 1 B D F 分别为叶 茎 根感染枯萎病早期发病 症状 具体表现为中午时一侧或两侧叶片萎蔫 早 晚恢复正常 维管束稍变褐 根系无明显症状 图 1 C E G 分别为叶 茎 根感染枯萎病晚期发 病症状 植株表现为从下部叶片开始萎蔫发黄直至 枯死 茎基部维管束变为深褐色 根系萎缩变少 2 2 病原菌分离纯化及鉴定 2 2 1 病原菌分离纯化及形态学鉴定 定兴和肥乡 地区各分离得到了 10 个菌株 且在形态学上表现 一致 在 PDA 培养基上分离纯化得到的菌落呈白 65 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文图 1 番茄枯萎病整株和不同部位田间发病症状 A 番茄枯萎病发病中期整株症状 B D F 分别为叶 茎 根感染枯萎病早期发病症状 C E G 分别为叶 茎 根感染枯萎病晚 期发病症状 彩色图版见 中国蔬菜 网站 veg org 下图同 色或粉红色 图 2 A B C D 菌丝多分枝且 具有很多锐角分叉 图 2 E G 分生孢子有大小 两种类型 大型分生孢子镰刀形或纺锤形 顶端和 尾部稍弯曲 具 3 5 个隔膜 小型分生孢子长椭 A B C D E F G 图 2 枯萎病菌菌落 菌丝及分生孢子形态 A B 定兴枯萎病菌菌株在 PDA 培养基上的菌落形态 C D 肥乡枯萎病菌菌株在 PDA 培养基上的菌落形态 E G 定兴和肥乡 菌株菌丝形态 F H 定兴和肥乡菌株分生孢子形态 A E G F H B C D 66 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文圆形或卵形 无色 单孢 图 2 F H 厚垣孢子 圆形或椭圆形 黄褐色 单孢 顶生或间生于菌丝上 2 2 2 生理小种鉴定 尖孢镰孢菌通用引物 FOF1 FOR1 凝胶电泳结果证明 分离得到的 5 个定兴 和 5 个肥乡菌株均为尖孢镰孢菌 利用 2 对特异 性引物 sp13f r 和 sp23f r 分别进行 PCR 扩增 结 果表明定兴菌株和肥乡菌株均为尖孢镰孢菌番茄 专化型 F oxysporum f sp lycopersici 生理小种 3 图 3 2 3 砧木枯萎病抗性评价 从定兴 肥乡两地得到的菌株中各挑选 1 个 菌株进行接种 2 个菌株均能使番茄砧木品种有不 同程度的枯萎病症状 各品种不接菌对照病情指数 都为 0 如表 1 所 示 10 个砧木品种的病情指数均 在 20 以下 达到了抗病水平 其中劲霸 CHENG GONG TMS 150 的病情指数均在 5 以下 达到了 高抗水平 砧木 A1 番茄砧木 405 的抗病性相对 较差 病情指数在 10 以上 图 3 番茄枯萎病菌特异性引物的 PCR 扩增结果 M DL 2000 marker 1 3 分别为定兴菌株引物 FOF1 FOR1 sp13f r sp23f r 扩增结果 4 6 分别为肥乡菌株引物FOF1 FOR1 sp13f r sp23f r 扩增结果 表 1 不同番茄砧木品种的枯萎病抗性评价 砧木品种 定兴菌株 肥乡菌株 病情指数 抗性评价 病情指数 抗性评价 果砧 1 号 7 50 R 12 50 R 砧木 A1 15 00 R 17 31 R 爱好 7 50 R 5 00 R 劲霸 1 25 HR 2 50 HR CHENG GONG 3 95 HR 2 78 HR 欧砧 006 2 27 HR 6 25 R 奥尼 8 75 R 11 84 R TMS 150 3 95 HR 2 50 HR 番茄砧木 405 10 53 R 13 75 R 砧木 3 号 5 36 R 7 14 R 注 HR 高抗 R 抗病 3 结论与讨论 由于番茄尖孢镰孢菌的抗逆性较强 防治较为 困难 因此对番茄枯萎病菌系统研究亟待进行 刘 晖 等 1991 郑贵彬和王发科 2000 运用近等 位基因系品种 Ip 和 Pearsorn VF 11 VF 11 鉴定 小种法 得出山东 西安地区的枯萎病菌生理小种 均为生理小种 1 但由于试验使用的品种存在特殊 性不能普遍适用 Baysal等 2010 Chang等 2018 利用番茄尖孢镰孢菌生理小种的特异性引物 sp13f r 和 sp23f r 研究发现 西地中海地区分布有尖孢镰 孢菌番茄专化型生理小种 2 和 3 山西地区生理小 种 1 2 3 都有分布 本试验利用形态学和分子生 物学方法对番茄枯萎病菌进行鉴定 得出河北省番 茄栽培面积较大的定兴 肥乡两地的菌株均为尖孢 镰孢菌番茄专化型生理小种 3 对河北省番茄枯萎 病菌生理小种进行研究为后续有针对性地防治枯萎 病 培育抗病材料提供重要依据 荆子桓等 2016 利用田间抗病性鉴定方法和 分子标记技术 对 20 份番茄砧木进行筛选 最终 得到 2 个对枯萎病 青枯病 根结线虫等病害具有 良好抗性的聚合多抗材料 本试验筛选出 3 个番茄 枯萎病高抗砧木 分别为劲霸 CHENG GONG 和 TMS 150 其具体抗病机制需要进一步的研究 综 上所述 本试验鉴定出定兴和肥乡地区的枯萎病菌 生理小种均为生理小种 3 且筛选得到 3 个番茄枯 萎病高抗砧木品种 为番茄枯萎病的防治提供了理 论依据 参考文献 柏敏战 郑贵彬 1997 番茄枯萎抗病性室内鉴定方法研究 植物 病理学报 27 1 60 64 Booth C 1971 The Genus of Fusarium 陈其煐 译 1988 镰刀 菌属 北京 农业出版社 25 35 高微微 1992 介绍一种简便的真菌单孢子分离方法 中国中药杂 志 3 148 黄志乔 2019 河北省番茄种植现状及发展建议 河北科技报 2019 07 23 荆子桓 王先裕 龙安四 孙岚明 陈 宝玲 2016 广西番茄砧木 多抗材料筛选 中国蔬菜 10 28 32 李文嘉 莫贱友 2003 我国番茄嫁接技术研究进展 中国蔬菜 4 67 68 刘晖 郑是琳 黄艳萍 1991 番茄枯萎病菌生理小种及其生物学 M 1 2 3 4 5 6 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 67 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文Isolation and Identification of Tomato Fusarium Wilt and Evaluation of Disease Resistance of Grafted Rootstocks CHU Xin pei 1 LYU Gui yun 1 LU Xiu yun 2 JIA Qiu ying 1 LIANG Yao 1 GAO Hong bo 1 1 College of Horticulture Hebei Agricultural University Collaborative Innovation Center of Vegetable Industry in Hebei Baoding 071000 Hebei China 2 Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences Baoding 071001 Hebei China Abstract This paper seperated and purified bacterial strains from wilt tomato plants grown in Dingxing and Feixiang counties with large tomato cultivation areas of Hebei Province Mophology and molecular biology methods were adopted to identify the pathogenic bacteria The wilt resistance of 10 tomato rootstocks were identified by root dip method The results showed that both strains isolated from Dingxing and Feixiang belonged to Fusarium oxysporum f sp lycopersici PCR amplification was conducted using specificity primers of Fusarium oxysporum f sp lycopersici race It was proved that these 2 bacterial strains were specialized forms of Fusarium oxysporum f sp lycopersici race 3 Three high resistant and 7 resistant rootstock varieties were screened out Key words Tomato Fusarium wilt Rootstock Disease resistance 特性研究初报 山东农业大学学报 22 4 356 360 王卿 林玲 2016 瓜类枯萎病研究进展 中国瓜菜 3 1 6 王全华 李景富 李永镐 1996 番茄枯萎病抗病育种研究进展 北方园艺 4 53 55 王志强 刘声锋 尚建立 郭松 杨万邦 田梅 2019 西瓜种质 资源枯萎病抗性鉴定 北方园艺 13 73 76 徐艳辉 李烨 许向阳 2008 番茄枯萎病的研究进展 东北农业 大学学报 39 11 128 134 张荣 姜子德 李敏慧 习平根 2011 尖孢镰孢菌致病机理及相 关致病基因研究进展 中国农学通报 27 15 254 258 郑贵彬 王发科 2000 西安地区番茄枯萎病尖镰孢菌的生理型鉴 定 植物病理学报 30 3 30 31 Baysal Siragusa M kten H Polat I G mr kc E Yigit F Carimi F Teixeira da Silva J A 2010 Fusarium oxysporum f sp Lycopersici races and their genetic discrimination by molecular markers in West Mediterranean region of Turkey Physiological and Molecular Plant Pathology 74 1 68 75 Chang Y D Du B Ling W Wang L Ji P Xie Y J Li X F Li Z G Wang J M 2018 A study on the pathogen species and physiological races of tomato Fusarium wilt in Shanxi China Journal of Integrative Agriculture 17 6 1380 1390 Hirano Y Arie T 2009 Variation and phylogeny of Fusarium oxysporum isolates based on nucleotide sequences of polygalacturonase genes Microbes and Environments 24 113 120 Jarvis W R Shoemaker R A 1978 Toxonomic status of Fusarium oxysporum causing foot and root rot of tomato Phytopathology 68 1679 1680 Mishra P K Fox R T V Culham A 2003 Development of a PCR based assay for rapid and reliable identification of pathogenic Fusaria FEMS Microbiology Letters 2 329 332 Sato R Araki T 1974 On the tomato root rot disease occurring under vinyl house conditions in Southern Hokkaido Annual Report of the Society of Plant Protection of North Japan 25 5 13 牛牌 19 大白菜杂交种种子纯度快速鉴定方法研究 作者 刘栓桃 张志刚 王立华 王荣花 李巧云 赵智 中 中国蔬菜 2020 年第 3 期 一文中 基金项目 山东省重点研发计划项目 2014GSF21103 更正为 山东省重点研 发计划项目 2017GSF21103 作者 信息 更 正 68 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究论文