新德里番茄曲叶病毒广东丝瓜分离物全基因组序列测定及其在广东的分布_都梦丹.pdf

nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null 曹燕燕 李天奇 葛昌斌 等null 国审小麦品种漯麦null 重要功能基 因的nullnullnull 标记检测与分析 null null 江苏农业科学 nullnull null null null nullnullnull null 昝香存 杜习军 赵明忠 等null 小麦新品种郑麦nullnull 高产稳产表 现及遗传特性解析 null null 种子 nullnull null null nullnull nullnullnullnull null 郝元峰 朱展望 陈延平 等null 一种用于检测中麦nullnull 抗条锈病 nullnullnull的分子标记及使用方法 nullnullnullnullnullnullnullnullnull null null null nullnull null null nullnullnull null 胡文静 张春梅 吴 迪 等null 长江中下游小麦抗赤霉病品种的 筛选与部分农艺性状分析 null null 中国农业科学 nullnull null null nullnull nullnullnullnull null 陈 婧 贾宝森 丁富功 等null nullnull 份小麦品种 系 赤霉病抗性 鉴定及优异种质筛选 null null 麦类作物学报 nullnull null null nullnull null nullnullnull 都梦丹 蓝国兵 李正刚 等null 新德里番茄曲叶病毒广东丝瓜分离物全基因组序列测定及其在广东的分布 null null 江苏农业科学 nullnullnullnull nullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 新德里番茄曲叶病毒广东丝瓜分离物全基因组序列 测定及其在广东的分布 都梦丹 null 蓝国兵 null 李正刚 null 奚有为 null 季英华 null 于 琳 null 丁善文 null 何自福 null 佘小漫 null 汤亚飞 null nullnull广东省农业科学院植物保护研究所null农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室null 广东省植物保护新技术重点实验室 广东广州nullnullnull nullnull江苏省农业科学院植物保护研究所 江苏南京nullnullnull 摘要 丝瓜曲叶病是广东地区新发的一种毁灭性病害 病株表现为叶片卷曲 皱缩 黄化等症状 nullnullnull 扩增结果 显示 疑似病样中均检测到菜豆金色黄花叶病毒属病毒 进一步通过滚环扩增 nullnullnull 与克隆 获得侵染广东丝瓜的 病毒分离物基因组全长序列 广东分离物是一个双组分病毒 包含 nullnullnull null null nullnullnull null null 这null 个组分 其中 nullnullnull null null组 分全长null nullnullnull nullnull 编码null个开放阅读框 nullnullnull nullnullnull null null 组分全长null nullnullnull nullnull 编码null 个 nullnullnull 广东分离物中 nullnullnull null null nullnullnull null null基因组全长序列与已报道的新德里番茄曲叶病毒 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull 中国分离物的 相似性均在nullnullnull以上 也与nullnullnullnullnullnullnull中国分离物聚集在同一个分支 亲缘关系较近 根据菜豆金色黄花叶病毒属病 毒的最新分类标准 研究获得的广东分离物属于 nullnullnullnullnullnullnull 分离物 用 nullnullnullnullnullnullnull 的 nullnullnull 特异引物对采集自广东广 州 惠州 江门 阳江 汕头 佛山的nullnull 份丝瓜曲叶病样品进行检测 结果均为阳性 可知nullnullnullnullnullnullnull 已在广东多个地区 分布 研究系首次在广东检测到nullnullnullnullnullnullnull 对监测nullnullnullnullnullnullnull在我国的扩散具有重要意义 关键词 新德里番茄曲叶病毒 分子特征 基因组序列 广东分离物 中图分类号 nullnullnullnullnullnullnullnull 文献标志码 null 文章编号 nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 收稿日期 nullnull nullnull nullnull 基金项目 国家自然科学基金 编号 nullnullnullnull 以农业领域为单元 的广东省现代农业产业共性关键技术研发创新团队建设项目 农 产品质量安全共性关键技术 编号 nullnullnullnullnullnullnull 广东省蔬菜产 业技术体系创新团队项目 编号 nullnullnullnullnullnullnull 国家西甜瓜产业 技术体系建设项目 编号 nullnullnullnull nullnull 广东省广州市科技计划 编 号 nullnullnullnullnullnullnull 作者简介 都梦丹 nullnull 女 河南滑县人 硕士研究生 主要从事 植物病毒学研究 null null nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnull 共同第一作者 蓝 国兵 nullnull 男 广东紫金人 硕士 副研究员 主要从事蔬菜病 理学研究 null null nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 通信作者 汤亚飞 博士 研究员 主要从事植物病毒学研究 null null nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 佘小漫 博士 研究员 从事植物病 理学研究 null null nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull 新德里番茄曲叶病毒 nullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnull nullnullnull null null nullnull nullnullnull 是一种单链环状植物nullnullnull病 毒 属于双生病毒科 nullnull nullnull nullnullnull 菜豆金色黄花 叶病毒属 Begomovirus 该病毒基因组含有null 个大 小约为 nullnull null null 的环状 nullnullnull 分子 即 nullnullnull null null nullnullnull null null 是一种双组分菜豆金色黄花叶病毒属病 毒 nullnullnull null null组分含有null 个开放阅读框 nullnullnull 分 别为位于病毒链上编码病毒外壳蛋白的 nullnullnull 和可 能作为nullnullnull沉默抑制子抑制nullnullnull沉默介导防御反 应的nullnullnull 以及位于互补链上编码病毒复制相关蛋 白的 nullnullnull 转录激活蛋白的 nullnullnull 复制增强蛋白的 nullnullnull 和症状决定因子的 nullnullnull nullnullnull null null 组分含有null 个nullnullnull 分别为病毒链上编码病毒核穿梭蛋白的 nullnullnull 和互补链上编码病毒运动蛋白的nullnullnull null nullnull nullnullnull 最早于 nullnull 年在印度番茄上被发 现 null 随后在泰国 null 巴基斯坦 null 孟加拉国 null 印 度尼西亚 null 伊朗 null 西班牙 null 斯里兰卡 null 突尼 斯 nullnull 意大利 nullnull 摩洛哥 nullnull 塞舍尔 nullnull 希腊 nullnull nullnullnull 江苏农业科学 nullnullnullnull 年第nullnull 卷第nullnull 期 阿尔及利亚 nullnull 菲律宾 nullnull 法国 nullnull 爱沙尼亚 nullnull 尼泊尔 nullnull 中国 nullnull 等多国陆续有报道 该病毒的 自然寄主范围非常广 可侵染番茄 甜瓜 丝瓜等经 济作物和一些杂草 尤其对亚洲 欧洲 非洲范围内 多个国家的葫芦科作物造成了毁灭性危害 nullnull nullnullnull 该病毒侵染茄科 葫芦科作物后 会引起植株出现 叶片卷曲 皱缩 黄化 节间变短 植株矮化 生长迟 缓等典型症状 若在苗期感染 会导致绝收 若在 生长后期感染 也会影响开花结果以及果实变小 畸形等 从而严重影响产量和品质 nullnull 年 nullnull nullnullnull 被欧洲和地中海植物保护组织 nullnullnullnull 列 入警戒名单 我国于 nullnull 年在台湾甜瓜病样上检测到 nullnull nullnullnull nullnull nullnull 年在浙江温室番茄上发现 nullnull nullnullnull nullnull 目前 该病毒已造成浙江 上海 江 苏 河南等多地的甜瓜 西瓜等瓜类作物的严重损 失 nullnull nullnullnull 成为瓜类作物的毁灭性新病毒 nullnull nullnullnull nullnull 年null 月 笔者所在团队首次在广东省广州 市增城区田间发现类似双生病毒感染的丝瓜病株 并进行病样采集 经nullnullnull检测 确定该病样中存在 菜豆金色黄花叶病毒属病毒 克隆病毒分离物的基 因组全长并进行序列分析 明确其病毒种类 并进一 步对广东省其他地区的丝瓜病样进行分子检测 以期 监测该病毒并为该病毒病的防控提供科学依据 1 材料与方法 nullnullnull 病样来源 nullnull 年 null null 月 从广东省蔬菜产区采集 null 份田间表现为叶片卷曲 皱缩 黄化等典型曲叶症 状的丝瓜病样 其中广州增城null 份 广州白云null 份 广州天河null 份 惠州博罗null 份 江门台山null 份 江 门开平null 份 阳江阳春null 份 汕头澄海null 份 佛山 三水null 份 用于后续的病毒种类鉴定和检测 nullnullnull 样品总nullnullnull的提取 取约nullnull nullnull 丝瓜病叶 按照已商品化的试剂盒 nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnull 操作指南提取 供试样品的总nullnullnull 将nullnullnull 溶解于null nullnull nullnull 溶液 含null nullnullnullnullnull nullnullnullnull null nullnullnull null nullnullnullnullnull nullnullnullnull null 值为 nullnullnull 中 保存于nullnull null 冰箱中 nullnullnull 病毒种类的鉴定 nullnullnullnullnull 病毒 nullnullnull 检测 以nullnull 年null 月从广东省 广州市增城区蔬菜种植地 nullnull nullnull nullnullnull null nullnullnullnullnull nullnullnullnull 采集的null 份疑似感染双生病毒的丝 瓜病样为模版 其中 null 份为有棱丝瓜 样本编号 nullnullnullnull null nullnullnullnull null 份为无棱丝瓜 样本编号 nullnullnullnull null nullnullnullnull 利用扩增菜豆金色黄花叶病 毒属病毒nullnullnull 基因部分片段引物 nullnullnullnull nullnull null nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnull nullnull null nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull 对null 份疑似 病样进行 nullnullnull 检测 反应体系如下 nullnull null nullnull Ex Taq nullnull nullnullnull null 各nullnull null nullnull null nullnullnullnullnull 上 下游引物 nullnullnull nullnull 样品总 nullnullnull nullnull null nullnull nullnull null null 总体积为 nullnullnull nullnull 反应程序如下 null null null nullnullnull null null null null null null null null null null null null null 个循环 null null null nullnullnull 将 nullnullnull产物进行nullnull琼脂糖凝胶电泳分析 nullnullnullnullnull nullnullnull扩增 利用 nullnullnull nullnull nullnull nullnullnull nullnullnull 对有 棱丝瓜 nullnullnullnull 无棱丝瓜 nullnullnullnull 样本总 nullnullnull 进 行滚环扩增反应 nullnullnull 具体步骤如下 取 nullnullnull nullnull 待测病样总nullnullnull 加入nullnullnull nullnull 样品缓冲液 二者混 匀后于null null 反应null nullnullnull 冰上冷却后 加入 nullnullnull nullnull 反应缓冲液 nullnullnull nullnull nullnullnull聚合酶 混匀 于null null 反 应null null 以上 在null null 反应null nullnullnull 完成滚环扩增反 应 所获nullnullnull产物可直接用于酶切鉴定 也可保存 在nullnull null 冰箱中 nullnullnullnullnull nullnullnull 产物酶切 克隆 测序 上述 nullnullnull 扩 增产物用Xbanull限制性内切酶进行酶切 反应体系 如下 nullnullnull nullnull nullnullnull产物 nullnullnull nullnull Xbanull快速内切酶 nullnullnull nullnull null null 反应缓冲液 nullnull null nullnull nullnull null null 总体积为 nullnullnull nullnull 在null null 反应null null 后 进行电泳分析 若 能切出与病毒基因组大小 nullnull null null nullnull null null 吻合的条 带 则将这些条带进行切胶回收 连接到用相同内 切酶酶切处理的 null null null nullnull 载体上 用热激法将 连接产物转化到大肠杆菌 nullnull 感受态细胞中 再涂 在含有氨苄青霉素 nullnullnull null null溴 null null null氯 null null null吲 哚null null D null半乳糖苷 null null nullnull 的nullnull 固体培养基平 板上 于null null 倒置培养过夜 最后从每个平板上随 机挑选null 个阳性单克隆进行序列测定 序列测定由 生工生物工程 上海 股份有限公司完成 nullnull nullnullnull 序列分析 用nullnullnullnullnull 的nullnullnull 对测序所 得目的序列进行拼接 获得病毒基因组的全长序 列 并在开放阅读框 nullnullnull nullnullnullnull 网站 null null null null nullnullnullnull nullnullnull null null null null nullnullnullnull nullnullnullnullnull 分析病毒分离物 nullnullnull的具体位置 进一步用 nullnullnullnullnull 软件绘制病 毒分离物的基因组结构图 借助 nullnullnullnull 网站 null null null nullnullnull null nullnullnull null null null null nullnullnullnullnullnull null nullnull 对所获 病毒的核苷酸序列进行相似性搜索 并下载相似性 nullnullnull 江苏农业科学 nullnullnullnull 年第nullnull 卷第nullnull 期 较高的相关病毒代表分离物序列 用 null nullnull null 的 nullnullnull null null nullnullnullnull 进行相似性比对 nullnull 用 nullnullnullnull nullnullnull 的邻接法 nullnull 构建系统进化树 设置 nullnullnullnullnullnullnull 值为null nullnull 根据结果分析其亲缘关系 nullnull 最后 依 据最新菜豆金色黄花叶病毒属病毒的分类标准确 定病毒种类 nullnullnull 广东其他地区样品的检测 根据所获病毒分离物null null 组分的全长序列 分 别设计特异性检测引物nullnull null nullnull null null null nullnullnullnull null nullnull null null null null nullnull null nullnull null null null null nullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnull null null null null nullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 和nullnull null nullnull null null null nullnullnullnull null null null null null null null nullnull null nullnull null null null null nullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnull null null null null nullnull null nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 利用null 对引物分别 对从广东广州 增城 白云 天河 惠州 博罗 江 门 台山和开平 阳江 阳春 汕头 澄海 佛山 三水 null 市null 区县收集的null 份丝瓜疑似病样进行 nullnullnull检测 根据 nullnullnull 检测结果确定 nullnull nullnullnull 在广 东地区的分布情况 nullnull null nullnull nullnullnull 总反应体系 nullnull null nullnull Ex Taq nullnull nullnullnull null 各nullnull null nullnull null nullnullnullnullnull 上 下游引物 nullnullnull nullnull 病样总nullnullnull nullnull null nullnull nullnull null null 反 应程序 null null null nullnullnull null null null null null null null null null null null null null 个循环 null null null nullnullnull 将 nullnullnull 产物用nullnull 琼脂糖凝胶进行电泳分析 2 结果与分析 nullnullnull nullnullnull检测结果 nullnull 年null 月首次在广东省广州市增城区蔬菜 种植地发现疑似双生病毒感染的丝瓜病样 田间主 要表现为叶片卷曲 皱缩 黄化等症状 图null 利用 菜豆金色黄花叶病毒属病毒的特异简并引物 nullnullnullnullnullnullnull 对null 份疑似丝瓜病样进行 nullnullnull 扩增 结果显示 null 份丝瓜病样总nullnullnull中可扩增出nullnull null 的特异条带 图null nullnullnull产物的直接测序分析结果 表明 null 份样品扩增所获序列的相似性在null 以上 nullnullnullnull 比对分析结果显示 本研究所获的核苷酸序 列与已报道的 nullnull nullnullnull 序列的相似性最高 本研 究结果初步表明 null 份疑似丝瓜病样中均含有 nullnull nullnullnull nullnullnull 江苏农业科学 nullnullnullnull 年第nullnull 卷第nullnull 期 nullnullnull 病毒基因组的结构特征 利用 Xbanull限制性内切酶均能从有棱丝瓜 nullnullnullnull 无棱丝瓜nullnullnullnullnullnull 的 nullnullnull 产物中切出约 nullnull null null 大小的条带 推测该片段可能是病毒基因 组 因此对该条带进行克隆和序列测定 nullnullnull产物酶切条带的克隆和测序结果表明 从 有棱丝瓜 nullnullnullnull 病样 无棱丝瓜 nullnullnullnull 病样 nullnullnull中均可克隆到null 个含 null null 组分的病毒基因组 序列 nullnullnullnull null null 登录号 nullnullnullnullnull nullnullnullnull null null 登录号 nullnullnullnullnull 的全长均为null nullnullnull nullnull 二者的 相似性为nullnullnullnullnullnull 为单链闭合环状 推测其编码null个 nullnullnull 具体为位于病毒链上的nullnullnull nullnullnull nullnull nullnullnull nullnull 编 码外壳蛋白 nullnullnull nullnull null nullnull null 编码与病毒移动 相关的蛋白 位于互补链上的 nullnullnull null nullnull null null nullnull null 编码复制相关蛋白 nullnullnull null nullnull null null nullnull null 编码转录激活蛋白 nullnullnull null nullnull null null nullnull null 编码复制增强蛋白 nullnullnull null nullnull null null nullnull null nullnullnull nullnull null nullnull null nullnullnullnull null null 登录 号 nullnullnullnullnull nullnullnullnull null null 登录号 nullnullnullnullnull 全 长均为null nullnull null 二者的相似性为nullnull null 为单链 闭合环状 推测其编码null 个nullnullnull 分别是位于病毒链 上的nullnullnull nullnull nullnull nullnull null 编码核穿梭蛋白 互补链 上的nullnullnull null nullnull nullnull nullnull null 编码运动蛋白 图null nullnullnull 病毒nullnullnull序列相似性分析 由于从有棱丝瓜 nullnullnullnull 无棱丝瓜 nullnullnullnull 病样中获得的病毒分离物基因组序列的相似性为 nullnullnull 因此挑选病毒分离物nullnullnullnull 用于后续序 列的详细分析 nullnullnullnull 结果显示 与病毒分离物 nullnullnullnull 基因组全长序列具有较高相似性的序列均 为nullnull nullnullnull 分离物 用 null nullnull null 软件对 nullnullnullnull 及来自亚洲 欧洲 非洲多个地区的null 个nullnull nullnullnull 分离物基因组序列进行比较发现 nullnullnullnull null null 与null 个nullnull nullnullnull 分离物nullnullnull null null 全长核苷酸的相似性 为nullnullnullnull nullnullnullnullnull 与来自中国大陆的分离物的相 似性在null 以上 其中与安徽 nullnullnullnullnull 分离物的相 似性最高 为nullnull nullnull 与上海 浙江 江苏分离物的 相似性为nullnull nullnull null nullnull nullnull 此外 与印度番茄分离 物 nullnullnullnullnull nullnullnullnull 的相似性分别为 nullnull nullnull nullnull nullnull 与亚洲其他分离物的相似性为 nullnull nullnull null nullnullnullnull 与非洲塞舍尔 摩洛哥 阿尔及利亚 突尼斯 分离物的相似性为nullnullnull nullnull nullnullnull nullnull 与欧洲意大利 西班牙 法国分离物的相似性为nullnull nullnull null nullnull nullnull 与法国nullnullnullnullnull 分离物的相似性最低 表null nullnullnullnull null null 与nullnull nullnullnull 分离物nullnullnull null null全长 核苷酸的相似性为nullnull nullnull nullnullnull nullnull 与中国大陆分 离物的相似性在null 以上 其中与安徽 nullnullnullnullnull 分 离物的相似性最高 为nullnull nullnull 与上海 浙江 江苏 分离物的相似性为nullnull nullnull null nullnull nullnull 此外 与印度 番茄分离物 nullnullnullnullnull nullnullnullnull 的相似性分别为 nullnull nullnull nullnull nullnull 与亚洲其他分离物的相似性为 nullnull nullnull nullnullnullnullnull 与非洲塞舍尔 摩洛哥 阿尔及利 亚 突尼斯分离物的相似性为nullnull nullnull null nullnull nullnull 与 欧洲意大利 西班牙 法国分离物的相似性为 nullnull nullnull nullnullnull nullnull 与意大利 nullnullnullnullnull 分离物的相 似性最低 表null nullnullnull 病毒系统进化分析 为了明确广东分离物 nullnullnullnull 与 nullnull nullnullnull 各 分离物间的亲缘关系 以泰国番茄黄化曲叶病毒 nullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnullnull 为 nullnullnull 江苏农业科学 nullnullnullnull 年第nullnull 卷第nullnull 期 表1 广东分离物YLSG01 与已报道的ToLCNDV分离物基因组核苷酸序列相似性 洲 地点 分离物 寄主 nullnullnull null null nullnullnull null null 登录号 大小 null 相似性 null 登录号 大小 null 相似性 null 亚洲 中国安徽 nullnullnullnullnull 菜豆 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国上海 nullnull 黄瓜 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国浙江 nullnull nullnullnull 番茄 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国上海 nullnull nullnull 甜瓜 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国上海 nullnull nullnull 甜瓜 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国上海 nullnull 丝瓜 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国上海 null null nullnullnull 西瓜 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国江苏 nullnullnullnull 西瓜 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国江苏 nullnullnullnullnullnullnull 甜瓜 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 中国浙江 nullnullnullnullnull 甜瓜 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 印度 nullnullnull nullnullnullnull 番茄 nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnull nullnullnull 亚洲 印度 番茄 nullnullnullnull null nullnull nullnullnull nullnullnullnull null nullnul