辣椒斑驳病毒江苏南京分离物的分子鉴定与系统进化分析_刘亚楠.pdf

江苏农业学报 Jiangsu J of Agr Sci nullnullnullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 刘亚楠 史 宝 杨 柳 等 null 辣椒斑驳病毒江苏南京分离物的分子鉴定与系统进化分析 null null 江苏农业学报 nullnullnullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 辣椒斑驳病毒江苏南京分离物的分子鉴定与系统进化 分析 刘亚楠 null 史 宝 null null 杨 柳 null 任春梅 null 李 硕 null 孙 枫 null 季英华 null null nullnull江苏省农业科学院植物保护研究所 江苏 南京 nullnullnullnullnullnull nullnull青海大学农林科学院 青海 西宁 nullnullnullnullnullnull 收稿日期 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 基金项目 江苏省自然科学基金项目 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 作者简介 刘亚楠 nullnullnullnullnull 女 河南驻马店人 硕士研究生 主要从事 作物病毒防控技术研究 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull 通讯作者 孙 枫 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull 季英华 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 摘要 本研究从江苏南京表现叶片卷曲矮缩症状的辣椒中鉴定出辣椒斑驳病毒 nullnullnullnullnullnull 江苏分离物 nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull 侵染本氏烟后导致叶片卷曲 黄化及严重矮化 该病毒基因组全长 null nullnullnull nullnull 编码 nullnull 个成熟 蛋白 系统发育分析结果表明 辣椒斑驳病毒分为两大组群 辣椒斑驳病毒中国安徽 湖南 江苏分离物和韩国分 离物聚为 组群 辣椒斑驳病毒美国分离物 德国分离物和中国台湾分离物聚为 组群 辣椒斑驳病毒中国分离 物遗传相似度较低 群体多样性高 nullnullnullnullnullnullnullnullnull 基因组中未检测到重组事件 表明其基因结构相对稳定 本研究结 果为解析 nullnullnullnullnullnull 在中国的分布 进化特征及制定有效防治策略提供理论依据 关键词 辣椒斑驳病毒 病毒病 基因组克隆 进化分析 中图分类号 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 文献标识码 null 文章编号 nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Molecular identification and phylogenetic analysis of a Jiangsu Nanjing isolate of pepper mottle virus nullnullnull nullnullnullnullnull null nullnullnull nullnullnull null null nullnullnullnull nullnullnull null nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull null nullnull nullnullnullnull null nullnullnull nullnullnullnull null nullnull nullnullnullnullnullnullnull null null null Institute of Plant Protection Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Nanjing nullnullnullnullnullnull China null Academy of Agriculture and Forestry Sciences Qing hai University Xining nullnullnullnullnullnull China Abstract nullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull Nicotiana benthamiana nullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull null nullnullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Key words nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull 辣椒是中国重要的蔬菜作物 其适应性强 营养 丰富 深受消费者喜爱 中国的辣椒栽培面积为 nullnullnullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnull null nullnull null 辣椒已成为中国栽培面积最 大的蔬菜 nullnullnull 在江苏省 随着设施栽培技术的推广 辣椒年种植面积扩大至 nullnullnullnullnullnullnull null nullnull null null 然而 病毒 病在辣椒主产区广泛发生 严重影响辣椒产量和品 nullnullnullnull 质 中国已报道侵染辣椒的病毒有 nullnull 多种 在江苏 省已鉴定出 nullnull 种辣椒病毒 包括烟草花叶病毒 nullnullnull 番茄花叶病毒 nullnullnullnull 烟草轻型绿花叶病 毒 nullnullnullnullnull 辣椒轻斑驳病毒 nullnullnullnullnull 辣椒脉黄 化病毒 nullnullnullnullnull 番茄褪绿病毒 nullnullnullnull 瓜类褪绿黄 化病毒 nullnullnullnull 烟草扭脉病毒 nullnullnullnull 番茄黄化曲 叶病毒 nullnullnullnullnull 蚕豆萎蔫病毒 null 号 nullnullnullnullnull 苜蓿 花叶病毒 nullnullnull 辣椒脉斑驳病毒 nullnullnullnullnullnull nullnullnull 辣椒斑驳病毒 nullnullnullnullnullnull 属于马铃薯 null 病毒科 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 马铃薯 null 病毒属 Potyvirus 可侵染辣 椒 番 茄 Solanum lycopersicum 烟 草 Nicotiana nullnullnullnull 马铃薯 Solanum tuberosum 等多种茄科植 物 nullnullnullnull 辣椒斑驳病毒可通过机械传播或由蚜虫在 田间扩散 造成辣椒叶片斑驳褪绿 皱缩卷曲 植株 矮化 果实畸形 严重影响辣椒产量和品质 nullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull 基因组为负义单链 nullnullnull 全长约 nullnull nullnull 包 含一个开放阅读框 编码一个由 null nullnullnull 个氨基酸组 成的多聚蛋白 该多聚蛋白包含 null 个蛋白裂解位 点 可加工成 nullnull 个成熟蛋白 nullnull nullnullnullnullnull nullnull nullnullnull nullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnull nullnull nullnull nullnullnull nullnullnull nullnullnull 和 nullnullnull 与病毒复制密切相关 而 nullnull nullnullnullnullnull nullnullnull 和 nullnullnull 参与了病毒长距离运动 nullnull 辣椒斑驳病毒 nullnullnullnullnullnull 于 nullnullnullnull 年首次在美国 的辣椒上被发现 随后在印度 古巴和韩国等国家的 茄科作物上被发现并报道 nullnullnullnullnull nullnullnullnull 年 在中国湖 南省 贵州省 福建省 广东省和广西壮族自治区辣 椒上均检测出辣椒斑驳病毒 nullnull 辣椒斑驳病毒湖 南分离物全基因组分析结果表明 辣椒斑驳病毒中 国湖南分离物在遗传进化上与美国分离物 韩国分 离物存在显著差异 nullnull 本研究拟对江苏南京辣椒 上的辣椒斑驳病毒进行基因组克隆和进化分析 以 期为解析 nullnullnullnullnullnull 在中国的分布 进化特征及制定 有效防治策略提供理论依据 null 材料与方法 1 1 植物材料 nullnullnullnull 年 nullnull 月 于江苏省南京市江宁区和平社 区采集到表现病毒病症状的辣椒 其叶片出现斑驳 褪绿及卷曲等典型症状 1 2 NA 提取和 T PC 分析 称取 nullnullnull null 辣椒叶片 经液氮研磨成粉末状 加入 null nullnull nullnullnullnullnullnull 试剂 混匀后室温静置 null nullnullnull 加入 nullnullnull null 氯仿 颠倒混匀 于 null null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull条件下离心 null nullnullnull 取 nullnullnull null 上清液至新离心管中 加入等体积异 丙醇 颠倒混匀后于 null null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull条件离心 null nullnullnull 弃上清液 加入 null nullnull nullnullnull乙醇 于 null null nullnull nullnullnull nullnullnullnullnull离心 null nullnullnull 弃上清液 将沉淀用 nullnull null 经过二 乙基焦碳酸酯处理的超纯水溶解 得到总 nullnullnull 以提取的 nullnullnull 为模板 进行反转录合成 nullnullnull nullnull nullnull null 反应体系为 nullnullnull 模板 null null nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull 宝生物工程大连有限公司产 品 null null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull null null null nullnull null 反应程序为 nullnull null nullnull nullnullnull nullnull null null null 以辣椒 nullnullnullnull 为模板 采用 表 null 所示的 nullnullnullnullnullnull 特异性引物和植物内参基因引 物进行 nullnullnull 扩增 nullnull null 反应体系为 nullnullTaq nullnullnullnull nullnullnull nullnullnull 南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品 nullnull null 上下游引物各 null null nullnullnullnull 模板 null null nullnullnull null null null null 反应程序为 nullnull null null nullnullnull nullnull null nullnull null nullnull null nullnull null nullnull null nullnull null nullnull 个循环 nullnull null nullnull nullnullnull 将 nullnullnull 产物利用 nullnull琼脂糖凝胶分离 随后通 过凝胶成像系统 上海天能生命科学有限公司产 品 观察并拍照 切下目标条带 将回收产物连接 至 null 载体并转化至大肠杆菌 nullnullnull 感受态细胞中 挑取阳性克隆送至南京擎科生物技术有限公司进行 测序验证 表 1 本研究所用引物 Table 1 Primers used in this study 引物名称 引物序列 nullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull CaUBI 3nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull CaUBI 3nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Nbactinnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull Nbactinnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull 江 苏 农 业 学 报 nullnullnullnull 年 第 nullnull 卷 第 nullnull 期 1 3 辣椒斑驳病毒接种本氏烟植物 将本氏烟种子播种于培养基质 营养土 null 蛭 石 nullnull null null 中 置于植物生长室内培养 设定温度为 nullnull null 光周期为 nullnull null 光照 nullnull null 黑暗 待植株生长 至 nullnullnull 叶期 接种辣椒斑驳病毒 具体接种方法如 下 取 null null 感染辣椒斑驳病毒的辣椒叶片 利用液氮 进行研磨 加入 null nullnull nullnull nullnull nullnullnullnullnull磷酸盐缓冲液 继 续研磨成植物匀浆 在本氏烟叶片表面撒少量石英 砂 用毛笔蘸取植物匀浆均匀涂抹在本氏烟叶片 上 nullnull 接种 nullnull nullnullnull 后 用蒸馏水冲洗叶片表面 随 后将本氏烟植株移回生长室继续培养 接种 null null 后 观察本氏烟发病症状并拍照记录 同时取样进行 nullnullnullnullnullnull 检测 1 4 PepMoV 全基因组进化树分析 将本研究获得的 nullnullnullnullnullnull 分离物的全基因组序 列提交至国家生物信息中心 nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull null nullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 登录号 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 从美国家生物技术信息中心 nullnullnullnull 数据库下载 其他 nullnullnullnullnullnull 分离物的全基因组序列 利用 nullnullnullnullnull nullnullnullnull 软件分析数据 利用 nullnullnullnullnull 软件的邻接法对 nullnullnullnullnullnull 全基因序列进行相似性分析和系统进化树 构建 重复次数为 null nullnullnull次 nullnull 系统进化树以马铃 薯 null 病毒作为外群 利用 nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull null nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 作图 nullnull 1 5 PepMoV 基因重组分析 利用 重 组 检 测 软 件 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 对 nullnullnullnullnullnull 分离物全基因组序列进行重 组事件检测 检测方法包括 nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 和 nullnullnullnull 等 各方法 参数均为软件默认设置 为保障结果可靠性 仅当 某一重组事件被 null 种及以上方法共同检测到 才判 定其为有效重组 nullnull null 结果与分析 2 1 辣椒斑驳病毒江苏分离物的分子鉴定和全基 因组序列克隆 如图 null 所示 江苏省南京市江宁区和平社区辣椒 叶片斑驳褪绿 皱缩卷曲 植株严重矮化 疑似感染病 毒 利用 nullnull琼脂糖凝胶电泳检测 nullnullnullnullnullnull 扩增产 物 在 nullnullnull nullnull 处出现特异性条带 测序结果表明 该 片段与辣椒辣椒斑驳病毒韩国分离物 nullnullnullnullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnull 登录号 nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull 核苷酸同源性为 nullnullnull 据此确认江苏南京辣椒感染 nullnullnullnullnullnull 本研究将 其命名为 nullnullnullnullnullnullnullnullnull null 江苏省南京市江宁区和平社区受辣椒斑驳病毒侵染的辣椒 null 辣椒斑驳病毒 nullnullnullnullnullnull 检测结果 PepMoV CP 为辣椒斑驳病毒 nullnull 蛋白编 码基因 null 为 nullnullnull 分子量标准 nullnullnullnull 为辣椒样品 CaUbI 3 为内参基因 图 1 辣椒斑驳病毒江苏分离物的分子鉴定 Fig 1 Molecular identification of the Jiangsu isolate of pepper mottle virus 如图 null 所示 接种 nullnullnullnullnullnullnullnullnull null null 后 本氏烟草 叶片向下卷曲 黄化 同时植株严重矮化 接种 nullnullnullnull nullnullnullnullnullnull nullnull null 后 本氏烟草植株逐渐死亡 如图 null 所示 nullnullnullnullnullnullnullnullnull 基因组全长 null nullnullnull nullnull 本研究分 null 段扩增 2 2 辣椒斑驳病毒江苏分离物系统进化分析 如表 null 所示 在核苷酸水平上 nullnullnullnullnullnullnullnullnull 与辣 椒斑驳病毒韩国分离物 中国分离物的核苷酸序列相 似度较高 nullnullnullnullnullnullnullnullnull 与辣椒斑驳病毒韩国分离物 nullnullnullnullnullnull nullnullnull 核苷酸序列相似度最高 为 nullnullnull nullnullnull 与 辣椒斑驳病毒中国湖南分离物 nullnullnullnullnullnull nullnull 核苷酸序 列相似度为 nullnullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnull 与辣椒斑驳病毒德 国分离物 美国分离物的核苷酸序列相似度较低 nullnullnullnullnullnullnullnullnull 与辣椒斑驳病毒美国分离物 nullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull 核苷酸序列相似度最低 为 nullnullnull nullnullnull 在氨基 酸水平上 nullnullnullnullnullnullnullnullnull 与辣椒斑驳病毒韩国分离物 nullnullnullnull刘亚楠等 辣椒斑驳病毒江苏南京分离物的分子鉴定与系统进化分析 中国湖南分离物氨基酸序列相似度较高 nullnullnullnullnullnullnullnullnull 与辣椒斑驳病毒韩国分离物 nullnullnulln