番茄褐色皱果病毒茄子、番茄分离株的鉴定和基因组测序分析_杨思华.pdf

植物病理学报 Acta Phytopathologica Sinica ISSN 0412 0914 CN 11 2184 Q 植物病理学报 网络首发论文 题目 番茄褐色皱果病毒茄子 番茄分离株的鉴定和基因组测序分析 作者 杨思华 于璇 胡淑青 冯黎霞 邵晨曦 何旭诺 武目涛 李献锋 DOI 10 13926 ki apps 001759 网络首发日期 2026 09 17 引用格式 杨思华 于璇 胡淑青 冯黎霞 邵晨曦 何旭诺 武目涛 李献锋 番茄 褐色皱果病毒茄子 番茄分离株的鉴定和基因组测序分析 J OL 植物病理学 报 https doi org 10 13926 ki apps 001759 网络首发 在编辑部工作流程中 稿件从录用到出版要经历录用定稿 排版定稿 整期汇编定稿等阶 段 录用定稿指内容已经确定 且通过同行评议 主编终审同意刊用的稿件 排版定稿指录用定稿按照期 刊特定版式 包括网络呈现版式 排版后的稿件 可暂不确定出版年 卷 期和页码 整期汇编定稿指出 版年 卷 期 页码均已确定的印刷或数字出版的整期汇编稿件 录用定稿网络首发稿件内容必须符合 出 版管理条例 和 期刊出版管理规定 的有关规定 学术研究成果具有创新性 科学性和先进性 符合编 辑部对刊文的录用要求 不存在学术不端行为及其他侵权行为 稿件内容应基本符合国家有关书刊编辑 出版的技术标准 正确使用和统一规范语言文字 符号 数字 外文字母 法定计量单位及地图标注等 为确保录用定稿网络首发的严肃性 录用定稿一经发布 不得修改论文题目 作者 机构名称和学术内容 只可基于编辑规范进行少量文字的修改 出版确认 纸质期刊编辑部通过与 中国学术期刊 光盘版 电子杂志社有限公司签约 在 中国 学术期刊 网络版 出版传播平台上创办与纸质期刊内容一致的网络版 以单篇或整期出版形式 在印刷 出版之前刊发论文的录用定稿 排版定稿 整期汇编定稿 因为 中国学术期刊 网络版 是国家新闻出 版广电总局批准的网络连续型出版物 ISSN 2096 4188 CN 11 6037 Z 所以签约期刊的网络版上网络首 发论文视为正式出版 植物病理学报 ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 研究简报 基金项目 国家重点研发计划 2021YFD1400100 海关总署科研项目 2025HK055 通信作者 李献锋 硕士 高级农艺师 主要从事 植物病理学 研究 E mail zhkxf1988 第一作者 杨思华 博士 农艺师 主要从事 植物病理学 研究 E mail 724743763 doi 10 13926 ki apps 001759 番茄褐色皱果病毒茄子 番茄 分离 株 的鉴定 和基因组测序分析 杨思华 于 璇 胡淑青 冯黎霞 邵晨曦 何旭诺 武目涛 李献锋 广州海关技术中心 广州 510623 Identification and genome sequencing analysis of tomato brown rugose fruit virus isolates from eggplant and tomato Yang Sihua Yu Xuan Hu Shuqing Feng Lixia Shao Chenxi He Xunuo Wu Mutao Li Xianfeng Guangzhou Customs Technology Center Guangzhou 510623 China Abstract To clarify the evolutionary patterns and cross host variation characteristics of tomato brown rugose fruit virus ToBRFV isolates from eggplant Solanum melongena and tomato S lycopersicum in China reverse transcription polymerase chain reaction RT PCR and reverse transcription quantitative real time PCR RT qPCR were used for detection followed by high throughput sequencing and bioinformatic analyses Four near complete genome sequences of ToBRFV 6 337 6 368 nt were obtained sharing 99 11 nucleotide identity Globally ToBRFV isolates exhibit low genetic diversity and the population is under strong negative selection pressure and shows an ongoing expansion trend No statistically significant recombination signals were detected suggesting that the accumulation of point mutations is the primary driver of ToBRFV adaptive evolution Phylogenetic analysis showed that the eggplant and tomato isolates obtained in this study clustered into Clade with no host associated differentiation confirming that the virus may possess the potential for cross host transmission between tomato and eggplant This study enriches the genomic resources of ToBRFV from eggplant hosts and provides theoretical support for elucidating the cross host infection mechanism of the virus as well as for conducting port quarantine surveillance and transmission risk assessment Keywords tomato brown rugose fruit virus eggplant isolate tomato isolate genetic diversity phylogenetics 中图分类号 S432 44 文献标识码 A 番茄褐色皱果病毒 tomato brown rugose fruit virus ToBRFV 其物种名为 Tobamovirus fructirugosum 隶属于 帚状病毒科 Virgaviridae 烟草花叶病毒属 Tobamovirus 是近年全球新发 的危险性植物病毒 对番茄 Solanum lycopersicum 辣椒 Capsicum annuum 等茄科 Solanaceae 作物生产构成严重威胁 1 该病毒 于 2014 2015年首次在约旦 以色列番茄产区发现 随后快速扩散 至全球 50多 个国家和地区 现已成为番茄主产区危害最重的病原之一 2 3 ToBRFV短距离传播以机械 接触 熊蜂授粉为主 长距离跨境传播以种子为主 种子带毒率最高可达 100 即便种子 传毒至幼苗 的效率 仅为 0 08 2 8 但 仍可造成病害大规模流行 4 5 网络首发时间 2026 09 17 13 42 31 网络首发地址 杨思华 等 番茄褐色皱果病毒茄子 番茄分离株的鉴定和基因组测序分析 2 早期研究认 为番茄 辣椒是 ToBRFV仅有的自然栽培寄主 1 然而 2018年墨西哥报道茄子 Solanum melongena 发生 ToBRFV自然侵染 6 2021年 Fidan等 7 在人工接种的茄子中检测到 ToBRFV 但 茄子 无 症状 2025年 Zamora Macorra 8 等 人工接种 ToBRFV墨西哥分离 株 GeneBank登录号 PQ628197 至 茄子幼苗 部分茄子 受 感染 症状 表现 为 茎和叶坏死 且 ToBRFV在茄子 中的 侵染特征 存在明显的温度 依赖性 这些研究 证实茄子具备被 ToBRFV侵染的潜力 茄子作为我国主栽茄科经济作物 若成为 ToBRFV新 的 寄主 将进一步 增加 病害流行风险与防控难度 ToBRFV为 正义 单链 RNA病毒 基因组全长约 6 392 nt 包含 4个典型开放阅读框 分别编码 126 kDa 蛋白 含甲基转移酶与解旋酶结构域 183 kDa 蛋白 含 RNA 依赖的 RNA聚合酶 RdRp结构域 运动蛋白 MP 与外壳蛋白 CP 1 9 已有研究显示 全球 ToBRFV分离株基因组整体高度保守 核 苷酸序列一致性超 99 但 不同功能基因 的 进化特征存在明显差异 9 10 目前国内外已积累大量 ToBRFV番茄 辣椒 分离株 的基因组数据 但茄子 分离株 基因组信息十分匮乏 其跨寄主变异 进化及 传播机制尚不明确 2025 年 本研究在 汕头口岸 截获 的 进口 茄子种子培育的幼苗中检出 ToBRFV 为明确 ToBRFV 茄 子 分离株 的分子特征 本研究 以上述茄子幼苗叶片以及广东地区送检的疑似感染 ToBRFV 的番茄幼苗 叶片为试验材料 利用高通 量测序获得茄子与番茄分离株的 近全长 基因组序列 通过与全球已 发表的 番茄 辣椒寄主 来源 ToBRFV 基因组 开展比对分析 系统解析其遗传多样性 系统发育 选择压力及 重组特征 阐明该病毒跨地理 跨寄主的传播与进化规律 以 填补全球茄子 ToBRFV 基因组与进化研 究空白 为病毒监测预警 跨境风险评估及综合防控提供科学依据 以 送检的 进口 茄子种子培育的幼苗 叶片 和 广东地区 送检的 疑似 ToBRFV阳性的 番茄 幼苗 叶片 为 供 试样品 以实验室存留的 ToBRFV阳性 核酸为阳性对照 采用文献报道的 ToBRFV特异性引物 ToBRFV F 5 GTCCCGATGTCTGTAAGGCTTGC 3 ToBRFV R 5 GCAGGTGCAGAGGACCATTGTAA 3 11 进行 反转录 PCR RT PCR 检测 茄子与番茄样品均扩增出约 680 bp 的特异性目标条带 附 加 图 1 A 将 阳性 PCR产物送至广州天一辉远基因科技有限公司测序 序列经 NCBI BLASTn比对 结果显示 4条待测 序列与 ToBRFV核苷酸序列一致性均 99 88 初步判定送检茄子 和番茄 样品感染 ToBRFV 利用 配套 引物 ToBRFVqs 5 CAATCAGAGCACATTTGAAAGTGCA 3 ToBRFVqas2 5 CAGACACAATCTGTTATTTAAGCATC 3 与探针 ToBRFVp1 5 6 FAM ACAATGGTCCTCTGCACCTG BHQ1 3 12 进行 反转录 实时荧光定量 PCR RT qPCR 检测 所有样品均出现典型扩增曲线 Ct值范围为 13 01 30 47 附 加 图 1 B 为 解析 ToBRFV 茄子分离株和番茄分离株 的 基因组序列差异 将经检测确认为 ToBRFV 阳性的茄 子幼苗叶片 Y188 Y193 和番茄幼苗叶片 Y3047 Y3053 送至上海凌恩生物科技有限公司开展 高通量测序 采用 Ribo Zero rRNA Removal Kits 去除 rRNA 使用 TruSeq RNA Sample Prep Kit Illumina 美国 构建 cDNA 文库 采用 Illumina NextSeq 550 进行 1 75 bp 单端测序 原始测序数据 使用 Trimmomatic v 0 39 进行质控 13 通过 BWA 软件比对番茄 GeneBank 登录号 GCF 000188115 4 杨思华 等 番茄褐色皱果病毒茄子 番茄分离株的鉴定和基因组测序分析 3 和茄子 Genebank 登录号 GCF 001876935 2 参考基因组以过滤 寄 主序列 使用 Megahit 进行从头 组装 14 挑选 1 000 bp 的 组装序列使用 deepVirFinder 15 VirSorter2 16 和 Integrated Microbial Genomes IMG https img jgi doe gov cgi bin vr main cgi 进行病毒 序列 鉴定 以序列一致性 90 且 E value 1 10 为阈值筛选同源序列 比对结果 显示 供试的 茄子幼苗 Y188 Y193 病毒组装序列比对结 果仅有 ToBRFV 不存在 复合侵染 供试的 番茄幼苗 Y3047 Y3053 病毒组装序列比对结果有 ToBRFV 和 番茄黄化曲叶病毒 tomato yellow leaf curl virus TYLCV 存在复合侵染 附 加 表 1 以 在美国国家生物技术信息中心 National Center for Biotechnology Information NCBI 数据库下 载 的 ToBRFV 中国番茄分离 株的基因组序列 GenBank 登录号 MT018320 为 参照 基因组 进行序列拼 接 使用 CheckV 评估基因组完整性 使用 ORFfinder 进行基因注释 17 共计 获得 4 条 ToBRFV 近全 长基因组 序列 登录号 分别 为 AA280522 1 AA280523 1 AA280524 1 AA280525 1 18 19 这 4 条基 因组序列长度为 6 337 6 368 nt 与参考基因组比对 序列覆盖率均 99 核苷酸序列一致性达 99 11 附 加 表 2 其 近全长基因组 序列 都包含 RNA 依赖的 RNA 聚合酶亚基 183 kDa 和 126 kDa 运 动蛋白 30 kDa 和外壳蛋白 17 5 kDa 图 1 A 共检测到 109 个 单核苷酸多态性 SNP 位点 突变位点主要分布在 RdRp 与 MP 基因区域 从 NCBI 数据库下载 111 条全球 ToBRFV 基因组序列 结合本研究获得的 4 条序列 利用 DnaSP v6 12 03 软件开展群体 遗传分析 结果表明 ToBRFV 近全长基因组 核苷酸多样性 Pi 介于 0 0 013 之间 种群整体多态性 偏低 图 1 A 表明全球种群遗传结构相对保守 各功能基因多样性 存在 差 异 其中 CP 基因核苷酸多样性最低 Pi 0 00237 MP 基因核苷酸多样性最高 Pi 0 00501 表明 MP 基因 可能是 病毒适应性变异与寄主适应 性的关键基因 近全长基因组 及各功能基因的 dN dS 比值 均小于 1 表 1 表明 ToBRFV 种群长期处于强负选择压力下 Tajima s D Fu and Li s D 及 F 检验 结果均呈极显著负值 证明 ToBRFV 种群正处于持续扩张状态 借助 Datamonkey 平台的遗传算法重 组检测工具 GARD 开展基因组重组分析 20 软件共扫描 578 个潜在重组位点 然而 未检测到具有 统计学意义的同源重组信号 仅在 2 500 nt 位置出现一处支撑度极低的微弱峰值 cAIC 值 0 000137046 2 不足以判定为有效重组断点 表明该病毒的适应性进化主要依靠点突变累积实现 图 1 B Table 1 Genetic diversity parameters for ToBRFV genomes sequenced in this study combined with publicly available genomes n 115 Gene sequence Length nt N H S Pi Hd Tajima s D Fu and Li s D Fu and Li s F dN dS 183 kDa ORF 4 848 115 102 464 0 003 72 0 996 3 2 688 7 497 6 375 0 13 126 kDa ORF 3 346 115 100 342 0 003 76 0 994 4 2 709 7 588 6 46 0 145 MP 801 115 59 75 0 005 01 0 958 0 2 348 4 957 4 613 0 289 CP 480 115 37 35 0 002 37 0 696 0 2 556 4 413 4 396 0 164 Note N number of isolates analyzed H number of haplotypes S number of segregating polymorphic sites Pi nucleotide diversity Hd haplotype diversity dN dS ratio of the number of nonsynonymous substitutions to the number of synonymous substitutions P 0 02 P 0 001 杨思华 等 番茄褐色皱果病毒茄子 番茄分离株的鉴定和基因组测序分析 4 以番茄花叶病毒 tomato mosaic virus ToMV 为外群 采用贝叶斯法构建系统发育树 并计算遗 传分化系数 Fst 与迁移个体数 Nm 基于 拼接的 ToBRFV 近全长基因 组 序列构建 的 系统发育树 全球 ToBRFV 分离株可划分为 Clade Clade Clade 三大 进化分支 图 2 Clade I 仅包含斐济 GeneBank 登录号 PQ492144 和巴基斯坦 GeneBank 登录号 PQ492152 分离株 Clade II 为欧洲主导的过渡 亚支 涵盖 来自 意大利 荷兰及部分美洲 大洋洲 的 分离株 以番茄寄主为主 Clade III 为 最具多样 性的分支 欧洲 亚洲 美洲 非洲及大洋洲分离株广泛穿插 未形成严格地理分区聚类 也未因 寄 主差异形成遗传分化 本研究 获得的 番茄 茄子 分离株 均聚集于 Clade 与国内番茄分离株亲缘关 系最近 未形成独立的寄主分支 提示 ToBRFV 可能 在番茄与茄子之间跨寄主传播 依据病毒种群 Fst 0 33 且 Nm 1 为频繁基因流的判定标准 21 仅 Clade I 与 Clade II III 组合符合频繁基因流特征 Fst 0 17871 Nm 1 15 表明基因交流频繁 Clade II 与 Clade III 和 Clade I 均表现为明显遗传分 化但基因流受阻 Clade I 与 Clade III 无明显遗传分化且基因流受阻 表 2 Kst Z 及 Snn 检验进一 步支持上述结果 群体 遗传结构主要由进化历史主导 地理与寄主未形成显著分化屏障 Fig 1 Population genetic and evolutionary analyses of global ToBRFV isolates using near complete genome sequences A Nucleotide diversity Pi distribution analysis The horizontal and vertical axes represent the genomic nucleotide nt position and Pi respectively RdRp RNA dependent RNA polymerase MP movement protein CP coat protein UTR untranslated regions B Recombination breakpoint analysis detected by the genetic algorithm for recombination detection GARD the horizontal and vertical axes represent the genomic nt position and the cAIC value respectively the single peak located at approximately 2 500 nt was the highest in the figure but extremely low in absolute value and did not reach the threshold for a valid recombination breakpoint 5 UTR 3 UTR RdRp 183 kDa RdRp 126 kDa MP CP 2 000 4 000 6 000 0 500 1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 3 500 4 000 4 500 5 000 5 500 6 000 6 500 0 10 5 2 10 5 3 10 5 4 10 5 A B 杨思华 等 番茄褐色皱果病毒茄子 番茄分离株的鉴定和基因组测序分析 5 Fig 2 Bayesian phylogenetic tree inferred from near complete genome sequences of ToBRFV Tobacco mosaic virus ToMV was designated as the outgroup and the best fit substitution model was selected based on the Akaike Information Criterion AIC node labels represent Bayesian posterior probabilities and the scale bar corresponds to nucleotide substitutions per site Sequences are labelled in the format virus abbreviation accession number location host The near complete genome sequences of this study are shown in bold Clade III Clade II Clade II 杨思华 等 番茄褐色皱果病毒茄子 番茄分离株的鉴定和基因组测序分析 6 Table 2 Genetic differentiation parameters among ToBRFV populations Population Fst Nm Kst Z Snn Clade I vs II III 0 178 71 1 15 0 000 56 ns 7 791 95 ns 0 991 30 Clade I vs II 0 425 80 0 34 0 065 41 4 731 31 0 962 96 Clade I vs III 0 230 95 0 83 0 000 06 ns 7 292 60 ns 0 988 89 Clade II vs III 0 399 71 0 38 0 078 22 7 230 95 1 000 00 Note Fst fixation index Nm number of migrants per generation ns non significant Kst interpopulation differentiation statistic Z Z statistic Snn nearest neighbor statistic P 0 01 P 0 001 本研究 在 茄子 中 检出 ToBRFV 茄子表现 为 无症状 附 加 图 2 与 Fidan 等 7 人工接种茄子 的 结 果一致 茄子受 ToBRFV 侵染后多表现 为 潜伏侵染或轻微症状 隐症植株易成为田间隐蔽毒源 在特 定条件下可发生系统性侵染 大幅提升 病害 传播与流行 风险 8 从遗传稳定性角度而言 本研究 获得 的番茄和茄子分离 株 近全长基因组 高度保守 核苷酸 一致性 为 99 11 符合 ToBRFV 单系起源 依托 种子贸易全球传播的特征 1 ToBRFV 受强负选择作用 种群不断扩张 与全球疫情发展态势一致 22 本研究 的 群体遗传分析 证实 ToBRFV 各功能基因进化特征 存在 差异 CP 基因高度保守 保障病毒正常 传播 MP 基因变异程度最高 是病毒突破寄主抗性 实现跨寄主侵染的关键基因 23 全球 ToBRFV 分离株无寄主特异性聚类特征 不存在寄主遗传分化 提示 其 可能具有跨寄主传播潜力 地理隔离是 驱动种群分化的主要因素 且其跨寄主适应主要依赖点突变累积 24 综上 ToBRFV 种群持续扩张且整体遗传结构稳定 本研究 揭示 了 ToBRFV 茄子 和番茄 分离株 的 分子特征与进化规律 可为我国茄科作物 ToBRFV 疫情监测 种子检疫 跨寄主风险评估及病害综合 防控提供重要参考 关于 ToBRFV 在茄子体内的侵染循环 致病特性及流行传播规律 仍需 开展 进一 步 的 人工接种试验 和 流行病学调查 等 研究 参考文献 1 Salem N Mansour A Ciuffo M et al A new tobamovirus infecting tomato crops in Jordan J Archives of Virology 2015 161 2 503 506 2 Akhmadaliev B Abduvaliev B Adilov B et al First report of tomato brown rugose fruit virus infecting sweet pepper Capsicum annuum in open fields in Uzbekistan J Plant Disease 2025 109 2 2001 3 EPPO Tobamovirus fructirugosum Z EPPO 2024 https gd eppo int 4 Salem N M Sulaiman A Samarah N et al Localization and mechanical transmission of tomato brown rugose fruit virus in tomato seeds J Plant Disease 2022 106 1 275 281 5 Panno S Caruso A G Barone S et al Spread of tomato brown rugose fruit virus in Sicily and evaluation of the spatiotemporal dispersion in experimental conditions J Agronomy 2020 10 6 834 6 EPPO Update of the situation of tomato brown rugose fruit virus in Mexico Z EPPO 2019 https gd eppo int reporting article 6622 7 Fidan H Sarikaya P Yildiz K et al Robust molecular detection of the new tomato brown rugose fruit virus in infected tomato and pepper plants from Turkey J Journal of Integrative Agriculture 2021 20 8 2170 2179 8 Zamora Macorra E J Ochoa Mart nez D L Chavar n Camacho C Y et al Genomic insights into host associated variants and transmission features of a ToBRFV isolate from Mexico J Frontiers in Plant Science 2025 16 1580000 9 Abrahamian P Cai W Nunziata S O et al Comparative analysis of tomato brown rugose fruit virus isolates shows 杨思华 等 番茄褐色皱果病毒茄子 番茄分离株的鉴定和基因组测序分析 7 limited genetic diversity J Viruses 2022 14 2816 10 Panno S Ruiz Ruiz S Caruso A G et al Real time reverse transcription polymerase chain reaction development for rapid detection of tomato brown rugose fruit virus and comparison with other techniques J PeerJ 2019 7 e7928 11 李献锋 刘明航 魏霜 等 番茄褐色皱果病毒 RT PCR 检测方法的建立与评价 J 病毒学报 2022 38 4 905 914 Li X F Liu M H Wei S et al Development and evaluation of a RT PCR assay for detection tomato brown rugose fruit virus Chinese Journal of Virology 2022 38 4 905 914 12 W M S W Identification of novel and known tobamoviruses in tomato and other solanaceous crops using a new pair of generic primers and development of a specific RT qPCR for ToBRFV J Acta Horticulturae 2021 1316 143 148 13 Bolger A M Lohse M Usadel B Trimmomatic a flexible trimmer for Illumina sequence data J Bioinformatics 2014 30 15 2114 2120 14 Li D Liu C M Luo R et al MEGAHIT an ultra fast single node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de bruijn graph J Bioinformatics 2015 31 10 1674 1676 15 Ren J Ahlgren N A Lu Y Y et al VirFinder a novel k mer based tool for identifying viral sequences from assembled metagenomic data J Microbiome 2017 5 69 16 Guo J Bolduc B Zayed A A et al VirSorter2 a multi classifier expert guided approach to detect diverse DNA and RNA viruses J Microbiome 2021 9 37 17 Nayfach S Camargo A P Eloe Fadrosh E et al CheckV assessing the quality of metagenome assembled viral genomes J Nature Biotechnology 2020 38 1 100 106 18 Center N G D Database resources of the national genomics data center china national center for bioinformatio n in 2025 J Nucleic Acids Research 2025 53 D1 D30 D44 19 Bioinformatics G P GenBase a nucleotide sequence database J 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