一种环丝氨酸与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用.pdf

19 中华人民共和国 国家知识产权局 12 发明专利申请 10 申请公布号 43 申请公布日 21 申请号 202010403070 7 22 申请日 2020 05 13 83 生物保藏信息 CGMCC No 6628 2012 09 26 71 申请人 南京农业大 学 地址 210043 江 苏省南京市栖霞区八卦洲 街道江苏省栖霞现代农业产业园区南 京农业大学现代园艺产业科技创新中 心 72 发明人 杨天杰 韩岗 徐阳春 韦中 沈 其 荣 74 专利代理机构 南京 天华专利代理有限责任 公司 32 218 代理人 徐冬涛 邢贤冬 51 Int Cl C12N 1 20 2006 01 A01N 63 20 2020 01 A01P 1 00 2006 01 C12R 1 01 2006 01 54 发明名称 一种环丝氨酸与有益菌配合防控番茄土传 青枯病的应用 57 摘要 本发明公开了一种环丝氨酸与有益菌配合 防控番茄土传青枯病的应用 采用灌根法将环丝 氨酸与有益菌施入土壤 其中 有益菌为菌株 NJQL A6 分类命 名为皮氏 罗尔斯通氏 菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心 保藏单位地址 北京市朝阳区大屯路 菌种保 藏号为CGMCC No 6628 本发明通过资源调控的 方式可以增强有益菌抑制土传青枯病的能力 同 时施用有益菌和环丝氨酸 以环丝氨酸作为资源 物质 不仅能够促进有益菌生长 还能显著提高 有 益菌对青枯菌的抑制能力 从而减少番茄青枯 病的发病率 防控 番 茄土传病害 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 111607535 A 2020 09 01 CN 111607535 A 1 一种环丝氨酸与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用 其中 有益菌为菌株NJQL A6 分类命名为皮氏罗尔斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏单位地址 北京市朝阳区大屯路 菌种保藏 号为CGMCC No 6628 2 根据权利要求1所述的应用 其特征在于采用灌根法将环丝氨酸与有益菌施入土壤 3 根据权利要求1所述的应用 其特征在于环丝氨酸的终浓度为0 1 1mmol kg土 4 根据权利要求1所述的应用 其特征在于有益菌的终浓度为 107 1 109CFU g土 5 一种环丝氨酸与有益菌配合防控番茄土传青枯病的方法 其特征在于包括 番茄幼 苗移栽7 10天后 以灌根法将环丝氨酸与有益菌菌悬液加入土壤中 环丝氨酸的终浓度为 0 1 1mmol kg土 有益菌NJQL A6的终浓度为10 7 10 9CFU g土 6 根据权利要求5所述的方法 其特征在于有益菌菌悬液的浓度为1 107 1 109CFU mL 7 根据权利要求5所述的方法 其特征在于有益菌菌悬液由以下方法制得 菌株NJQL A6采用NA固体培养基活化 挑取NJQL A6单菌落于NA液体培养基 30 170rpm培养过夜 取 新鲜菌液4500rpm 常温离心5min 收集菌体 用无菌生理盐水洗涤菌体 除去培养基 用无 菌生理盐水调节菌液浓度为1 107 1 109CFU mL 得到NJQL A6菌悬液 权 利 要 求 书 1 1 页 2 CN 111607535 A 一种环丝氨酸与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域 涉及一种资源配合有益菌防控番茄青枯病的应用 具体涉及一种环丝氨酸和有益菌NJQL A6配合防控番茄土传青枯病的应用 背景技术 0002 番茄青枯病是由茄科劳尔氏菌 Ralstonia solanacearum 简称青枯菌 引起的一 种土传病害 多发于我国东部和南部地区 可导致番茄发生不可逆的萎蔫 死亡 造成番茄 严重减产 制约农业经济的发展 施用农药或熏蒸等传统方式可在短时间内杀灭土传青枯 菌 有效减缓病害的发生 但上述方法也会杀灭土壤中土著微生物 减少土壤物种多样性或 丰度 0003 目前 施用有益菌是较为绿色 可持续的防控番茄青枯病措施 可抑制土传青枯菌 的生长 在一定程度上减少病害的发生 在筛选有益菌以及验证其抑菌效果的过程中 人们 往往使用营养较为丰富的培养基 有益菌可大量增殖或表现出很好的抑菌能力 而土壤中 资源种类和数量都相对有限 有益菌施入土壤后 无法获得足够以及合适的资源 从而生长 减缓 甚至无法在土壤环境中存活 其生防效率必然下降 0004 因此 需要找寻一种能够促进有益菌生长的资源 为有益菌在土壤提供一个适宜 生长的资源环境 并增强其抑制土传青枯菌的能力 发明内容 0005 本发明的目的在于针对土壤中养分有限 施用有益菌防控番茄土传病害时 有益 菌往往难以在土壤中大量增殖并发挥应有防效的问题 发明人发现 室内微孔板系统中 环 丝氨酸可以促进有益菌NJQL A6生长 还可显著提高有益菌对青枯菌的抑制能力 温室盆栽 实验中 环丝氨酸与有益菌NJQL A6同时以灌根法施入土壤中 可降低番茄土传青枯病的病 情指数 说明通过资源调控的方式可以增强有益菌抑制土传青枯病的能力 同时施用有益 菌和环丝氨酸 以环丝氨酸作为资源物质 不仅能够促进有益菌生长 还能显著提高有益菌 对青枯菌的抑制能力 从而减少番茄青枯病的发病率 防控番茄土传病害 0006 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 0007 一种环丝氨酸与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用 其中 有益菌为菌株 NJQL A6 分类命名为皮氏罗尔斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏单位地址 北京市朝阳区大屯路 菌种 保藏号为CGMCC No 6628 0008 菌株NJQL A6具体见申请人于2012年12月19日申请的发明专利申请 发明名称为 一种能防治番茄青枯病的微生物植物疫苗 申请号 201210466659 7 0009 作为本发明环丝氨酸与有益菌配合防控番茄土传青枯病的应用的优选技术方案 采用灌根法 同时将环丝氨酸与有益菌施入土壤 环丝氨酸的终浓度为0 1 1mmol kg土 有益菌的终浓度为1 107 1 109CFU g土 说 明 书 1 4 页 3 CN 111607535 A 0010 本发明的另一个目的是提供一种环丝氨酸与有益菌配合防控番茄土传青枯病的 方法 包括 3 5片真叶的番茄幼苗移栽7 10天后 以灌根法同时将环丝氨酸与有益菌菌 悬液加入土壤中 环丝氨酸的终浓度为0 1 1mmol kg土 有益菌NJQL A6的终浓度为10 7 109CFU g土 0011 所述的有益菌菌悬液的浓度为1 107 1 109CFU mL 0012 所述的有益菌菌悬液由以下方法制得 菌株NJQL A6采用NA固体培养基活化 挑取 NJQL A6单菌落于NA液体培养基 30 170rpm培养过夜 取新鲜菌液4500rpm 常温离心 5min 收集菌体 用无菌生理盐水洗涤菌体 除去培养基 用无菌生理盐水调节菌液浓度为1 107 1 109CFU mL 得到NJQL A6菌悬液 附图说明 0013 图1为环丝氨酸对有益菌NJQL A6生长的影响 其中 图1A为环丝氨酸对有益菌 NJQL A6 48h生物量的影响 图1B为环丝氨酸对有益菌NJQL A6最大生长速率的影响 0014 图2为环丝氨酸对有益菌NJQL A6抑制土传青枯菌生长的影响 0015 图3为环丝氨酸对番茄土传青枯病病情指数的影响 0016 生物材料保藏信息 0017 菌株NJQL A6 分类命名为皮氏罗尔斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月 26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏单位地址 北京市朝阳 区大屯路 菌种保藏号为CGMCC No 6628 具体实施方式 0018 下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明 0019 实施例1 0020 环丝氨酸促进有益菌生长的室内效果 0021 NA液体培养基 葡萄糖10g 蛋白胨5g 牛肉浸膏3g 酵母膏0 5g 去离子水1000mL 调节pH 7 2 7 4 115 高压灭菌30min 0022 NA固体培养基为NA液体培养基加2 3 w w 琼脂 0023 菌株NJQL A6 分类名为皮氏罗尔斯通氏菌 保藏号CGMCC No 6628 0024 将甘油保存的NJQL A6在NA固体培养基上划线 30 培养2d 挑取平板上的单菌落 转接到NA液体培养基 30 170rpm培养过夜 取新鲜菌液4500rpm 常温离心5min 收集菌 体 用无菌生理盐水 0 85 NaCl 洗涤菌体3次 除去培养基 用无菌生理盐水调节菌液浓 度为1 108CFU mL 获得菌悬液 待用 0025 试验设置2个处理 1 环丝氨酸组 加入环丝氨酸和有益菌NJQL A6 2 对照组 只添加有益菌NJQL A6 并以等体积水替代环丝氨酸 培养基为10 NA培养基 用无菌水将 NA液体培养基稀释10倍 环丝氨酸终浓度为0 1mM 有益菌NJQL A6接种量为1 终浓度为 1 106CFU mL 在30 170rpm下震荡培养48h 在酶标仪上测定OD 600 考察有益菌NJQL A6 的生长情况 0026 环丝氨酸对有益菌生长的促进作用见图1和表1 结果表明 与对照组相比 环丝氨 酸可显著促进有益菌NJQL A6生物量和生长速率的增加 P 0 05 说 明 书 2 4 页 4 CN 111607535 A 0027 表1 环丝氨酸对有益菌NJQL A6生物量和生长速率的影响 0028 0029 注 表中同列不同字母表示差异达到0 05的显著水平 下同 0030 实施例2 0031 环丝氨酸增强有益菌抑制土传青枯菌的室内效果 0032 材料 分离自南京麒麟镇的青枯菌QL Rs1115 1 其红色荧光蛋白标记菌株RS RFP 为本发明的模式入侵病原菌 该菌株是将红色荧光蛋白基因mCherry通过质粒pYC12转入青 枯菌QL Rs1115 可以在30 g mL庆大霉素的NA培养基平板 2 上生长 命名为RS RFP 有益菌 NJQL A6筛选自南京麒麟镇 可抑制青枯菌QL Rs1115的生长 0033 将甘油保存的有益菌NJQL A6在NA固体培养基上划线 将平板置于30 培养箱中 培养2d 直至出现单菌落 挑取平板上的单菌落转接到NA液体培养基 30 170rpm培养过 夜 取新鲜菌液4500rpm 常温离心5min 收集菌体 用无菌生理盐水 0 85 NaCl 洗涤菌体 3次 除去培养基 最后用无菌生理盐水调节菌液浓度为1 108CFU mL 获得有益菌菌悬液 待用 0034 青枯菌RS RFP在含有30 g mL庆大霉素的NA固体培养基上复苏 将平板置于30 培养箱中培养2d 直至出现单菌落 挑取平板上的单菌落转接到NA液体培养基 30 170rpm培养过夜 取新鲜菌液4500rpm 常温离心5min 收集菌体 用无菌生理盐水 0 85 NaCl 洗涤菌体3次 除去培养基 最后用无菌生理盐水调节菌液浓度为1 108CFU mL 获得 青枯菌菌悬液 待用 0035 试验设置2个处理 1 环丝氨酸组 加入环丝氨酸 有益菌和青枯菌 对照组 有 益菌和青枯菌 并以等体积水替代环丝氨酸 培养基为10 NA培养基 用无菌水将NA液体培 养基稀释10倍 环丝氨酸终浓度为0 1mM 有益菌NJQL A6和青枯菌RS RFP接种量均为1 在30 170rpm下震荡培养48h 在酶标仪上测定OD 600和红色荧光强度mCherry 发射光 587nm 吸收光 610nm 计算青枯菌相对生长量 log10 mCherry OD 600 0036 结果见图2和表2 与对照组相比 环丝氨酸可显著增强有益菌NJQL A6抑制青枯菌 的能力 P 0 05 0037 表2 环丝氨酸对有益菌NJQL A6抑制青枯菌的影响 0038 0039 实施例3 0040 环丝氨酸增强有益菌抑制土传青枯菌的盆栽效果 0041 将有益菌NJQL A6接入NA液体培养基中 30 170rpm下震荡培养48h 取新鲜菌液 说 明 书 3 4 页 5 CN 111607535 A 4500rpm 常温离心5min 收集菌体 用无菌的生理盐水 0 85 NaCl 洗涤菌体3次 除去培 养基 最后用无菌生理盐水调节菌液浓度为1 108CFU mL左右 获得有益菌菌悬液 待用 0042 将青枯菌QL Rs1115接入NA液体培养基中 30 170rpm下震荡培养48h 取新鲜菌 液4500rpm常温离心5min 收集菌体 用无菌的生理盐水 0 85 NaCl 洗涤菌体3次 除去培 养基 最后用无菌生理盐水调节菌液浓度为1 108CFU mL左右 获得青枯菌菌悬液 待用 0043 番茄品种 红矮生番茄 0044 番茄种子经表面消毒后 置于垫有无菌去离子水浸湿滤纸的无菌平板上 30 催 芽2d 取发芽均一的种子种植入装有灭菌基质50孔育苗盘中 待番茄长出3片真叶后 取长 势一致的幼苗移栽至6孔育苗盘中 0045 试验设置2个处理 1 环丝氨酸组 幼苗移栽7天后 采用灌根法同时将环丝氨酸 与有益菌NJQL A6菌悬液均匀浇入番茄根部附近 环丝氨酸终浓度为0 1mmol kg土 有益菌 NJQL A6终浓度为10 7CFU g土 7天后 同样以灌根法接入青枯菌菌悬液 其终浓度为10 6CFU g土 2 对照组 幼苗移栽7天后 以灌根法接入有益菌NJQL A6菌悬液 并以等体积水替代 环丝氨酸 有益菌NJQL A6终浓度为10 7CFU g土 7天后 同样以灌根法接入青枯菌菌悬液 其终浓度为10 6CFU g土 接入青枯菌后一旦番茄出现发病症状 开始记录发病情况 0046 植株病情等级分为5级 3 0 没有染病症状 1 1 25 的植株部位出现染病症 状 2 26 50 的植株部位出现染病症状 3 51 75 的植株部位出现染病症状 4 76 100 的植株部位出现染病症状或者是植株已经死亡 用病情指数表征发病情况 计 算公式为 植株病情指数 各级病株数 相应级数 调查总株数 最高级别值 0047 结果如图3和表3 结果表明 添加环丝氨酸后 可显著降低番茄土传青枯病的病情 指数 P 0 05 减少青枯病发病程度 0048 表3 环丝氨酸对有益菌NJQL A6抑制番茄土传青枯病的影响 0049 0050 参考文献 0051 1 Wei Z Yang X M Yin S X Shen Q R Ran W Xu Y C Efficacy of Bacillus fortified organic fertiliser in controlling bacterial wilt of tomato in the field Appl Soil Ecol 2011 48 152 159 0052 2 Tan S Y Gu Y Yang C L Dong Y Mei X L Shen Q R et al Bacillusamyloliquefaciens T 5may prevent Ralstonia solanacearum infection through competitive exclusion Biol Fertil Soils 2015 52 341 351 0053 3 Kempe J and L Sequeira Biogical control of bacterial wilt of potatoes attempts to induce resistance by treating tubers with bacteria Plant disease 1983 67 499 503 说 明 书 4 4 页 6 CN 111607535 A 图1 图2 说 明 书 附 图 1 2 页 7 CN 111607535 A 图3 说 明 书 附 图 2 2 页 8 CN 111607535 A