江苏葫芦科作物上瓜类褪绿黄化病毒的发生及其分离物全基因组序列分析.pdf

杨 柳 任春梅 陆 芳 等 江苏葫芦科作物上瓜类褪绿黄化病毒的发生及其分离物全基因组序列分析 江苏农业科学 江苏葫芦科作物上瓜类褪绿黄化病毒的发生 及其分离物全基因组序列分析 杨 柳 任春梅 陆 芳 缪 倩 程兆榜 季英华 江苏省农业科学院植物保护研究所 江苏南京 摘要 为了分析瓜类褪绿黄化病毒 在江苏省葫芦科作物上的分布情况 发生 趋势以及变异情况 本研究对疑似感染 的葫芦科样本进行采集 覆盖了江苏省 个地区的 种常见葫芦科作 物 通过 方法对病样进行了分子鉴定 并对在泰州采集的黄瓜分离物 进行分段克隆与测序 拼接获得 的全基因组序列后对其进行了序列比对和进化分析 检测结果显示 在建湖采集的西葫芦样本 泰州 兴化和南京江宁地区采集的黄瓜样本均有 感染 序列拼接与比对结果显示 分离物 的 序 列与目前已经公布的各个分离物基因组序列相似度在 以上 在进化树上与山东西葫芦分离物聚为一支 其 序列与各分离株的相似性为 以上 在进化上与广东分离物聚为一支 本研究结果表明 可能由 多个途径传入江苏 并已经扩大蔓延到江苏省多个地区和多种寄主上 对该病毒的监测防控已逐渐扩大为葫芦科作物 生产中亟待解决的突出问题之一 关键词 瓜类褪绿黄化病毒 分布 分子鉴定 基因组 系统进化分析 中图分类号 文献标志码 文章编号 收稿日期 基金项目 国家重点研发计划 编号 江苏省农业 科技自主创新资金 编号 作者简介 杨 柳 女 江苏徐州人 博士 助理研究员 主要 从事蔬菜作物病毒病研究 通信作者 季英华 研究员 主要从事蔬菜病毒病研究 瓜类褪绿黄化病毒 属于长形病毒科 毛形 病毒属 它最早于 年在日本甜瓜 上被发现 随后在许多国家都有报道 包括苏丹 黎巴嫩 伊朗 希腊 土耳其 沙特阿拉伯 塞浦路 斯 以色列 美国 阿尔及利亚 西班牙 韩国和印度 等 年 于我国台湾地区首次被发 现 而后在山东 北京 上海 河南 湖南 广西 乃 至海南 新疆和贵州等省份逐渐被报道 并且其危 害地区还在不断扩大 是烟粉虱以半持久方式进行传播的 在 自然情况下主要感染葫芦科作物 目前已经报道的 以甜瓜 西瓜 黄瓜 南瓜 西葫芦等常见作物居多 但室内试验显示该病毒能够侵染 种葫芦科作 物 此外 还可以侵染本氏烟 甜菜 紫花 苜蓿 曼陀罗等植物 等明确了 种杂草 为 的寄主 庄新建等报道 可以感染 药用作物地黄 韦建明等报道 可以感染山 药 这些结果表明 的寄主范围也在不断 扩大 被 感染的植株在早期会出现中部或基部 叶片的褪绿黄化 而后逐步向上发展逐渐蔓延至植 株顶部 叶片最初呈现褪绿症状 随着病情发展 叶 片黄化 同时仍能看见保持绿色的叶脉等局部组 织 最后导致整个植株黄化 在大田生产中严重影 响了葫芦科作物的产量和产品品质 已逐渐扩大为 葫芦科作物生产中亟待解决的突出问题之一 的基因组由 条正单链 和 组成 其中 约 可编码甲基磷 酸转移酶 依赖 的病毒解旋酶 依赖 的 聚合酶 蛋白和 蛋白 约 可编码外壳蛋白 小外壳蛋白 类热 激蛋白 蛋白 蛋白 蛋白 蛋白和 蛋白 在病毒的侵染 复制和传播过程中 这 些蛋白都发挥了重要的功能 江苏地区的设施蔬菜和露地蔬菜在我国蔬菜 生产中均占有重要地位 但病毒病的发生也一直威 江苏农业科学 年第 卷第 期 胁着省内蔬菜产业的发展 根据目前已有报道 在 我国许多葫芦科作物种植区都出现了 的感 染 但在江苏地区尚未有针对性的报道 笔者所在课 题组于 年在江苏省内针对葫芦科作物 感 染进行了普查 并对在主要感染区 泰州兴化 采集 的 分离物进行了全基因组序列分析 材料与方法 病原材料 年 月在江苏省多个葫芦科作物生 产地采集到各种葫芦科作物疑似病毒病感染样品 主要为植株叶片 少部分为果实 症状表现为斑驳 褪绿 黄化 皱缩 畸形等 需要保存的样品经液氮 速冻存于 冰箱 提取和 的合成 取 病叶样品 如果是病果则切取果皮部 分 于液氮中充分研磨成粉末 使用多糖多酚植物 试剂盒 上海浦迪生物科技有限公司 按说明 书步骤操作提取 而后取 使用 试剂盒 南京诺唯赞生物 科技股份有限公司 按说明书步骤反转录成 用于 和克隆 检测分析 采用引物 和 对反转录后的病样 进行 扩增 扩增体系为 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 前后引物各 模板 补足 至 反应程序 预变性 变性 退火 延伸 个循环后 再 延伸 若电泳后在约 处出现 目的条带则将 产物送至南京擎科生物科技有 限公司进行序列测定 基因组序列克隆与测序 根据干射香等设计的引物 分段扩增并通过 拼接获得 和 序列全长 扩增体系 南京诺唯赞生物科技股份有限 公司 前后引物各 模板 补至 反应程序 预变性 变性 退火 延伸 个循环 延伸 产物经 的琼 脂糖凝胶电泳后 在紫外灯下切取凝胶上的目的条 带 使用 胶回收试剂盒 爱思进生物技术有 限公司 根据说明书步骤进行回收 回收产物连接 至 载体 北京全式金生物技术有限 公司 转化大肠杆菌感受态细胞 南京擎科 生物科技有限公司 挑取单克隆经 筛选后送 至南京擎科生物科技有限公司测序 序列比对分析 将测序测得的所有序列利用 软件里 的 功能进行拼接获得 和 全长序列 比对分析使用 网站的 和 软件 聚类分析和进化树的构建使用 软件 结果与分析 江苏省 的发生情况 本研究于 年在江苏省内共采集样本 份 分别来自于 个地区的 种常见葫芦科作物 表 寄主植物样品大多数来源于种植面积较大的葫 芦科作物 如西瓜 甜瓜 南瓜和黄瓜 对所采样品 提取 经过 检测后发现在建湖 兴 化 南京采集的样品中均检测出了 其他地区 样品中均未检出 图 在南京江宁采集的 份 甜瓜中有 份检出 份黄瓜样品中有 份 检出 总检出率为 在兴化采集的 份样 品中黄瓜占 份 丝瓜 份 其中包括丝瓜在内的 份样品检出 检出率为 在建湖采 集的 份西葫芦样品中全部检出 在全部 份样品中 总检出率为 表 样品采集地点和种类统计 采样地 样品 份 黄瓜西瓜甜瓜丝瓜西葫芦南瓜葫芦本地合计 建湖 兴化 海门 南京 泗洪 盱眙 姜堰 大丰 各地合计 泰州兴化分离物基因组特征分析 采用分段克隆拼接的策略 对 泰州兴化 江苏农业科学 年第 卷第 期 黄瓜分离物 的每条链分别分 段进 行克隆 通过软件拼接获得 全基因组 序列 对 序列信息进行分析比对发 现 该分离物的 序列全长共计 个碱基 包含 个开放阅读框 其中 位碱 基为 编码 个由 个氨基酸组成 分子 量约 的蛋白 位碱基为 编码 个由 个氨基酸组成 分子量约 的蛋白 位碱基编码 个由 个氨基酸组成 分子量约 的蛋白 位碱基编码 个由 个氨基酸组成 分子量 约 的蛋白 和 的长度分 别为 和 序列全长共计 个碱基 编码 个蛋 白 其中 位碱基编码由 个氨基酸组 成 分子量约 的蛋白 位 碱基编码由 个氨基酸组成 分子量约 的蛋白 位碱基编码 个由 个氨基酸组成 分子量约 的蛋白 位碱基编码由 个氨基酸组成 分子量约 的蛋白 位碱基编码由 个氨基酸组成 分子量约 的蛋白 位碱基编码由 个氨基酸组成 分子量约 的蛋白 位碱基编码由 个氨基酸组成 分子量约 的蛋白 位碱基编码由 个氨基酸组成 分 子量约 的蛋白 和 的长 度分别为 和 分析结果表明 的 序列与目前已经公布的各个分离物基因组序列的 相似度在 以上 其中与北京分离物 和河南分离物 的相似度最高 序列一致性达 但 的 各编码基因和非编码序列与已知 分离物的各 序列相似度不完全一致 其中 和 基因序列保守性较高 大多数分离物的相似性为 碱基变化较多存在于 和 基因上 它们的一致性在 之间 表 的 序列与目前已公布的分 离物基因组序列相似度在 以上 其中与广 东分离物 相似度最高 序列一致 性达 的各编码基因 和非编码序列与已知 分离物的各序列相似度 也不完全一致 其中 和 序列保 守性较高 许多分离物的相似性高达 而 和 上的变异较多 其一致性在 之间 表 将本研究获得的分离物 与已经 公布的和其一致性较高的 个分离物 的序列进行比较分析 结果 表 显示 这 个分离物中共有 个位点存在碱 基变化 中有 个差异碱基位点 中有 个 与其他 个分离物均不相同的位点有 个 中 个 中 个 上的差 异碱基位点共有 个为同义突变 个位点为错义 突变 上有 个位点为同义突变 个错义突 变 另外还有 个突变位点处于 的 区 域 错义突变存在的位置分别位于 和 上 将 中有全基因组序列报道的 和 序列分别使用邻接法 进行聚类分析 将毛形病毒属成员莴苣 褪绿病毒 作为外群 进化树分支 置信度 使用 次自导复制验证 由 此构建的 结果 图 显示 江苏农业科学 年第 卷第 期 表 分离物与 中其他分离物 的序列相似性 登录号分离物宿主地区 相似性 基因组 黄瓜中国北京 哈密瓜美国乔治亚州 西葫芦中国山东 地黄中国河南 黄瓜美国乔治亚州 黄瓜中国广东 黄瓜中国广东 黄瓜中国广东 野萝卜美国乔治亚州 甜瓜中国河南 西瓜以色列 中国河南 黄瓜中国山东 甜瓜中国上海 甜瓜中国台湾 甜瓜中国新疆 甜瓜日本熊本 注 表示没有相应信息 表 分离物与 中其他分离物 的序列相似性 序列号分离物 相似性 基因组 注 表示没有相应信息 与其他 分离物聚在一起 表明 该分离物确实为 成员之一 根据 序列 的系统进化树拓扑结构分析可以看出 与山东分离物 聚为一支 图 说明 江苏农业科学 年第 卷第 期 表 种 分离物序列突变位点比较分析 片段 碱基 位点 基因 或 氨基酸 替换 表 续 片段 碱基 位点 基因 或 氨基酸 替换 注 表示该位点突变的碱基由于位于非编码区域 因此不涉及氨基酸 变化 表示同义突变 它们之间 亲缘关系较近 但从 序列的 系统进化树拓扑结构可以看出 与广 东分离物 聚为一支 图 表明这 个分 离物的 亲缘关系较近 讨论与结论 最初在 年被发现 后来在世界许多 国家的葫芦科作物上均有发生报道 近些年来出现 越来越多的报道 年该病毒在我国台湾地区被 发现 而后在多个省市陆续被发现 刘放等调查发 现湖南省南瓜 检出率呈上升趋势 并且对 分离物的 基因进行选择压力和中性检测 分析 结果显示 我国种群受到正向选择压力或多 样化选择作用 其种群多态性较低 正处于扩张趋 势 但从世界范围来看 维持相对稳定状 态 本研究团队在前期研究普查中 曾于 年在山东寿光的黄瓜上发现 感染 后于 年在江苏 个地区的 种葫芦科作物 调查中发现丰县 睢宁 南京 苏州采集的样品中出 现该病毒 感染寄主有黄瓜 西瓜和甜瓜 总感染率 为 这是首次在江苏省境内发现 的 侵染 年在对南京市 泰州市姜堰区和另外 个地区进行葫芦科作物调研的过程中 又发现了该 病毒的侵染 除了黄瓜和甜瓜外 丝瓜和西葫芦也 检出 本次样品 总检出率为 该病毒在江苏省内的传播可能也呈现逐渐扩大的 趋势 烟粉虱的流行暴发本身就会给蔬菜产业造成 损失 而且烟粉虱又可以同时携带多种病毒 再加 上它们食性繁杂 寄主广泛 这就给相关病毒的扩 江苏农业科学 年第 卷第 期 展蔓延提供了很多机会 走访调查发现该病毒 病的暴发时间与烟粉虱的暴发时间相吻合 条件适 宜的温室环境下随时可能暴发 而露地作物在 月期间也有可能集中暴发 不仅烟粉虱向周边 地区的扩散会造成病毒的蔓延 蔬菜作物和种子的 贸易往来等也会造成病毒长距离的传播 图 为分别基于 中不同 分离物的 和 全序列分析构建的系统进化树 该类型的进 化树是很多次 得到的平均结果 从图 可以看出 无论是 还是 来自国外的分 离物 美国分离物 日本分离物和以色列分离物 都 聚在一个大分支上 这说明 的进化具有一定 的地域性 在国内分离物中 江苏分离物 的 与山东分离物 亲缘关系最近 但是 其 却与广东分离物 亲缘关系最近 这 可能意味着该病毒通过多种途径传入江苏 并在不 同毒株之间发生了复制重组 实验室条件下发现该病毒能感染 种葫芦科 作物 本研究在葫芦科作物集中生产地采集的黄 瓜 甜瓜 丝瓜和西葫芦上均发现了该病毒 这说明 该病毒在自然状态下确实可以感染多种作物导致 生产问题 目前已有报道该病毒在自然情况下侵 染西甜瓜 西葫芦 黄瓜等多种葫芦科作物 其中 感染丝瓜还未有详细报道 因此该病毒是葫 芦科作物生产中的巨大威胁 还有研究报道其能 感染 种杂草 这更加大了该病毒的防控难度 在 生产中不仅要注意作物本身的防控还要注意田边 杂草的管理 此外 相似度和系统进化分析发现来 江苏农业科学 年第 卷第 期 源于同一寄主的分离物并没有聚在一起 图 表 明该病毒的进化不受寄主的影响 参考文献 孙晓辉 赵 静 代惠洁 等 瓜类褪绿黄化病毒在山东省的流 行调查及西葫芦分离物全基因组扩增与序列分析 植物病 理学报 臧连毅 孙晓辉 苏文敏 等 瓜类褪绿黄化病毒山东分离物全 基因组序列扩增及分析 植物保护学报 刘珊珊 彭 斌 吴会杰 等 海南省和河南省发生甜瓜褪绿黄 化病的分子鉴定 果树学报 唐 鑫 张德咏 李 凡 等 瓜类褪绿黄化病毒 在湖南省的首次报道及其流行动态研究 植物病理学报 刘 放 刘 勇 张德咏 等 瓜类褪绿黄化病毒自然侵染南瓜 及分子进化分析 植物病理学报 杨世安 李战彪 秦碧霞 等 广西三种甜瓜病毒分离物的分子 检测与鉴定 植物保护 彭 斌 刘莉铭 刘珊珊 等 瓜类褪绿黄化病毒新疆分离物基 因组分析 植物病理学报 潘卫萍 张以和 吉艳玲 吐鲁番首次发生甜瓜褪绿黄化病毒病 蔬菜 韦建明 岳宁波 李云洲 贵州首次报道瓜类褪绿黄化病毒侵染 山药 植物病理学报 庄新建 郭 枭 丁诗文 等 河南温县地黄上瓜类褪绿黄化病 毒的鉴定及其 序列分析 植物病理学报 古勤生 彭 斌 刘珊珊 等 瓜类新病毒病害 一 瓜类褪绿 黄化病 中国瓜菜 干射香 山东黄瓜分离物基因组结构特征及致病相关蛋 白研究 荆州 长江大学 干射香 涂丽琴 吴淑华 等 山东寿光黄瓜上瓜类褪绿黄化病 毒的分子鉴定 江苏农业学报 杨 柳 况佳颖 任春梅 等 江苏省主要葫芦科作物病毒种类 及分布 江苏农业学报 江苏农业科学 年第 卷第 期