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西 北 农 业 学 报 网络出版日期 网络出版地址 基于 基因的宁夏烟粉虱及 温室白粉虱分子鉴定 收稿日期 修回日期 基金项目 宁夏 十三五 重点研发计划重大项目 宁夏自然科学基金 国家自然科学基金 第一作者 宋鲜梅 女 硕士研究生 从事植物保护研究 通信作者 王新谱 男 博士 教授 从事昆虫系统学与多样性研究 李 敏 女 博士 副教授 从事昆虫分子生物学研究 宋鲜梅 李 敏 何云川 贺海明 王新谱 宁夏大学 农学院 银川 太原师范学院 生物系 山西晋中 摘 要 基于线粒体 基因 对宁夏地区粉虱进行分子鉴定 选取宁 夏 个粉虱地理种群的 个样本作为试验材料 用 软件对 基因序列进行读取 整合 对齐 比对处理 用软件 中的 模型计算种内与种间遗传距离 并用邻接法 法 构建系统发育树 用软件 进行遗传多样性的分析 用软件 构建单倍型网络图 结 果显示 个样本中的 个为 型烟粉虱 个为温室白粉虱 表明目前 型烟粉虱已经传入宁夏银川市 石嘴山市 中卫市等 亟需对其危害和扩散进行有效控制 关键词 烟粉虱 温室白粉虱 生物型 基因 分子鉴定 中图分类号 文献标志码 文章编号 近年来 宁夏蔬菜种植面积达 万 占全区作物种植面积的 产值占种植业总 产值的 蔬菜产业已成为宁夏的优势特色 产业 是区域农业经济发展的重要支柱 在宁 夏蔬菜生产中番茄和黄瓜的种植面积较大 其中 番茄栽培以保护地栽培为主 可周年生产 目前 粉虱危害已成为阻碍番茄可持续安全生产的重要 生物灾害之一 烟粉虱 和温 室白粉虱 是中国北 方地区最常见的两种粉虱 均为番茄的重要害虫 且在宁夏都有发生报道 随着种植面积的增 加 品种的更替 目前宁夏粉虱害虫的种类及烟粉 虱的生物型是否变化 亟需研究确定 进而为该类 害虫的绿色防控提供科学依据 鉴于粉虱类害虫体型微小 形态相似 极易随 蔬菜 花卉 水果及其种苗的贸易活动远距离传 播 且难 以 快 速 准 确 识 别 本研究基于线粒体 基因对宁夏各地温室内粉虱类害虫以及烟 粉虱生物型进行分子鉴定 以期对粉虱类害虫的 快速识别 监测 防止入侵等提供依据 材料与方法 供试虫源 年 月在宁夏银川 永宁 贺兰山 石嘴山 吴忠 中卫 中宁 固原等地种植的番茄 黄瓜和豆角等寄主上采集到 个粉虱种群的 个样品 采集点分布如图 所示 将采集的粉虱 置于盛有无水乙醇的 离心管中 保存 备用 粉虱样品的具体采集信息如表 所 示 基因组 提取 取单头粉虱成虫于 的离心管中 用 适量的 浸泡 次 每次 用通用型柱式基因组提取试剂盒 康为世 纪 进行总 的提取 用 分 光光度计检测粉虱基因组 质 量 浓 度 以 值确定其是否被污染 提取的 保存 备用 图 宁夏粉虱采集地分布图 扩增及电泳检测 粉虱种类的鉴定 以 个粉虱样品基因组为 模板 利用通用型引物 和 进行 扩增 目标片段长度约为 反应体系为 其中 全式金 上下游引物 各 模板 左右 加 至 扩增程序为 预 变 性 次 循 环 最 后 延 伸 烟粉虱生物型的鉴定 以其中的 个烟粉虱 基因组为模板 利用通用型引物 和 进行 扩增 目标片段长度约为 反应体系同上 扩增程序为 预变性 次循环 最后 延伸 引物均由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成 扩增产物 于 保存 备用 扩增结束后 取扩增产物 用 的琼脂糖凝胶进行电泳 选取与目标片段长 度一致的单一片段 产物送北京华大基因生 物技术有限公司测序 每个种群粉虱检测 头 共计 条序列 序列分析 用 软件对公司返回的序列进行 分析 根据序列峰图分别删除两端引物序列以及 不稳定和不准确序列 以确保序列的高质量 登陆 查阅并下载相关粉虱 基因片段序列 用软件 对所测结果与 相关引用序列进行比对分析 利用软件中的 模型计 算种内与种间遗传距离 以获得的宁夏地区 条 基因序列和巴西 烟粉虱 西班牙 烟粉 虱 塞 尔 维 亚 温 室 白 粉 虱 登 录 号 分 别 为 和 个地区粉 虱 基因序列为靶标 黑刺粉虱 基因序列 为外 群 用软件 中邻接法 法 构建系 统发育树 以获得的 条 型烟粉虱 基因 序列和在 下载的相关序列 序列命名 登录 号 采集地 生物型 有的无 为靶标 同样以黑 刺粉 虱 基 因 序 列 为 外 群 构 建 系 统 发 育 树 系统发育树分支的置信度采用自展法 重复检测 次 用 软件分析群体间的核苷酸多样性 核酸平均差异度 单倍型多样性 及 其相应标准偏差 在 中构建单倍 型网络图 结果与分析 单头粉虱基因组质量浓度 分光光度计检测结果显示 所提取的单头供 试粉虱基因组 为 所有基因组 质量浓度均大于 满足试验需要 扩增 序列测定以及同源性分析 扩增共计获得 条序列 分别约 和 电泳检测结果见图 经测序比对 并提交到 获得基因序列登录号 表 条 基因序列与数据库中已知的靶标种相 对应的 基因片段的同源性均为 表明所获得的 基因序列准确可靠 所有烟粉虱序 列 比 对 序 列 和 与其他序列相比有 个碱 基的区别 分别是第 位的 和第 位 的 同样所有温室白粉虱序列相比 序列 与其他序列相比有 个碱基 的区别是第 位的 结果显示 宁夏银川 期 宋鲜梅等 基于 基因的宁夏烟粉虱及温室白粉虱分子鉴定 市西夏区 中卫市沙坡头区和中宁县的粉虱为 型烟粉虱 固原市原州区 吴忠市利通区 银川市 永宁县和贺兰县等地均为温室白粉虱 而石嘴山 市大武口区既有 型烟粉虱又有温室白粉虱 所测 型烟粉虱与 已知 型烟粉虱 基因序列对齐处理 比对长度为 得 知宁夏 型烟粉虱 序列完全一致 序列中碱 基 的数量分别为 和 的含量为 型烟粉虱以及外群 黑刺粉虱 部分序列比对见图 列 出序列以外的其他序列同 可以看出宁夏乃至中国与地中海周围国家意大 利 摩洛哥 塞浦路斯等 型烟粉虱 序列有 个碱基之差 与地中海东部国家伊拉克 伊 朗 阿拉伯酋长国等相差 个碱基 与美洲 一些国家相差大于 个碱基 分子质量标准 图 引物 对 个粉虱 基因序列的扩增电泳检测图 型烟粉虱和温室白粉虱的种内与种间遗 传距离 基于 基因序列 用软件 中的 模型计算种内与种 间遗传距离 结果显示 型烟粉虱和温室白粉 虱种内遗传距离均为 种内平均遗传 距离均为 种间遗传距离为 种 间遗传距离为种内遗传距离的 倍 型烟粉虱和温室白粉虱的系统发育树分析 用于粉虱种类鉴定的 条 基因序列和 上已知且具代表性的 条 基因序列所 构建的系统发育树见图 聚类分析结果表明 烟粉虱和温室白粉虱明显形成独立的进化分支 由所测 条 型烟粉虱 基因序列和在 下载的相关序列构建的系统发育树 图 可以 看出 烟粉虱 基因序列首先与黑刺粉虱 基因序列分开 被测样本序列与 等 条 已知 型烟粉虱序列聚为一支 相 似 度 为 和 聚 为 一 支 相 似 度 为 和 聚为一支 相似度为 和 聚为 一支 相 似 度 为 等 聚 为 一 支 相 似 度 为 被测样序列与 所在 这一 支 序 列 相 似 度 为 与 所在这一支序列相似度为 与 所在这 一支序列相似度为 与 所在这一支序列相似度为 西 北 农 业 学 报 卷 图 型烟粉虱 序列比对 期 宋鲜梅等 基于 基因的宁夏烟粉虱及温室白粉虱分子鉴定 书书书 表 用 于 序 列 分 析 的 粉 虱 的 具 体 采 集 信 息 以 及 登 录 号 编 号 采 集 地 寄 主 植 物 采 集 日 期 采 集 人 测 序 样 本 数 序 列 登 录 号 银 川 市 西 夏 区 军 马 场 番 茄 宋 鲜 梅 固 原 市 三 营 镇 利 民 村 番 茄 宋 鲜 梅 中 卫 市 阳 光 怡 然 生 态 园 番 茄 宋 鲜 梅 中 卫 市 东 园 镇 史 湖 村 黄 瓜 宋 鲜 梅 中 卫 市 东 园 镇 宋 家 庄 番 茄 宋 鲜 梅 中 卫 市 柔 远 镇 章 家 闸 番 茄 宋 鲜 梅 中 卫 市 柔 远 镇 柔 远 村 番 茄 宋 鲜 梅 中 卫 市 中 宁 县 莫 嘴 村 番 茄 宋 鲜 梅 吴 忠 市 利 通 区 龙 二 村 番 茄 宋 鲜 梅 永 宁 县 永 清 村 豆 角 宋 鲜 梅 永 宁 县 北 全 村 番 茄 宋 鲜 梅 贺 兰 山 县 产 业 园 区 番 茄 宋 鲜 梅 贺 兰 山 县 新 平 村 番 茄 宋 鲜 梅 石 嘴 山 市 大 武 口 区 简 泉 村 番 茄 宋 鲜 梅 西 北 农 业 学 报 卷 图 邻接法构建的粉虱基于 基因序列的系统发育树 遗传多样性和单倍型网络图分析 分析的 条序列共定义 个单倍型 表 分别命名为 单倍型的多样 性为 单倍型 共享个体数最多 占 总个体数的 被 个及 个以上种群共享 的单倍型有 和 总群体的 为 为 和 的 标准差分别为 和 中性检验结果 显示 总种群的 可推断 型烟粉虱近段历 史时期发生过种群扩张 用 构建 单倍型网络图 图 在所有样本中较高频率单 倍型位于图的左上 其余独立的单倍型则通过短 支与这几种高频率的单倍型相连 从地中海地区 逐渐到地中海东部 图右上 亚洲一些国家 图左 下 或美洲国家 图右下 呈现从高向低频率扩散 出现明显的进化分支 结果与系统发育树相吻合 说 明 型烟粉虱存在种群变异 期 宋鲜梅等 基于 基因的宁夏烟粉虱及温室白粉虱分子鉴定 图 邻接法构建的 型烟粉虱基于 基因序列的系统发育树 表 型烟粉虱单倍型间的共享情况 单倍型 样本数目 样本编号 西 北 农 业 学 报 卷 图 型烟粉虱 基因单倍型网络中介图 讨 论 本研究以宁夏 个不同地区种群的粉虱为 试验材料 采用通用引物 和 扩增 基因序列 分子 鉴定结果表明 在宁夏银川市西夏区 中卫市沙坡 头区 中宁县 石嘴山市大武口区均有 型烟粉 虱的分布 在银川市永宁县和贺兰县 石嘴山市大 武口区 固原市原州区 吴忠市利通区 有温室白 粉虱的分布 以上地区是宁夏蔬菜产业较发达的 区域 除中国北方普遍发生的温室白粉虱外 本 研究明确了 型烟粉虱在宁夏的分布情况 而近 年来宁夏番茄种植区不断加重的番茄黄化曲叶病 毒 病也从侧面印证了 型烟粉虱的存 在 宁夏的 个地市中 固原市因海拔较高 气候 冷凉 夏季温度较低 属冷凉蔬菜种植区 该区域 只有温室白粉虱分布 尚未发现 型烟粉虱 究 其原因可能与 型烟粉虱起源于热带地区 冷凉 地区不适宜生存 宁夏的其他 个地市 夏季干 燥且温度较高 蔬菜种植面积大 露地与保护地栽 培方式并存 且大量种植的茄果类和瓜菜类蔬菜 为烟粉虱提供了良好的寄主环境 利于烟粉虱的 生存繁殖 序列比对分析结果表明 宁夏不同地区的温 室白粉虱和 型烟粉虱种内遗传分化现象不明 显 未形成明显的地理种群 通过系统发育树和 单倍型网络图可以看出 宁夏乃至中国与地中海 周围的摩洛哥 突尼斯 埃及 西班牙 希腊 意大 利亚等国和非地中海地区的日本 越南 韩国 加 拿大 危地马拉等国的 型烟粉虱聚为一支或共 享一个单倍型 宁夏 型烟粉虱所在这一支很有 可能是地中海的本土种群 与地中海东部的以色 列 塞浦路斯 土耳其 叙利亚共和国等国的 型 烟粉虱相似度高达 与伊拉克 伊朗 阿拉伯联合酋长国 巴基斯坦相似度达 而与美洲国家的相似度低 本研 究结果与滕希 关于 型烟粉虱在中国的发生 现状及其基于 序列的系统发育分析 一 文中论述的中国 型烟粉虱的来源相一致 马绍国等 报道在宁夏石嘴山市惠农区发现 型烟粉虱 而本研究中在相同地区采集的烟粉 虱为 型烟粉虱 未检测到 型烟粉虱 且最近 期 宋鲜梅等 基于 基因的宁夏烟粉虱及温室白粉虱分子鉴定 研究 已表明中国农区烟粉虱优势生物型已经 由 型转为 型 这可能与两种不同生物型烟粉 虱的竞争替代有关 很多研究表明 型烟粉虱 比 型烟粉虱有更强的生存优势 如 型烟粉虱 发育历期比 型烟粉虱短 在低温和高温的条件 下都表现出更强的生存能力 而且 型粉虱拥有 更强 更广泛 更稳定的抗性 二者混合发生 时 经过一定的时间 型烟粉虱会逐渐成为优势 生物型 结 论 本研究表明 宁夏银川市西夏区 中卫市沙坡 头区和中宁县的粉虱为 型烟粉虱 固原市原州 区 吴忠市利通区 银川市永宁县和贺兰县等地均 为温室白粉虱 而石嘴山市大武口区既有 型烟 粉虱又有温室白粉虱 同时发现宁夏 型烟粉 虱应源于地中海本土种群 本研究结果可对不同 地区粉虱的针对性防控提供依据 参考文献 黄亚玲 李晓瑞 温淑萍 等 宁夏蔬菜产业生产效率的实证 分析 宁夏农林科技 张友军 朱国仁 褚 栋 等 我国蔬菜作物重大入侵害虫发 生 危害与控制 植物保护 马绍国 哈金华 朱建祥 等 宁夏地区烟粉虱生活习性及发 生规律研究 宁夏农林科技 顾沛雯 覃 强 王 萍 等 宁夏设施园艺病虫害发生特 点 发展趋势及绿色防治技术 农业科学研究 滕 希 型烟粉風在屮国的发生现状及其基于 序 列的系统发育分析 北京 中国农业科学院 褚 栋 张友军 近 年我国烟粉虱发生为害及防治研究 进展 植物保护 刘 晨 张伟兵 洪 波 等 陕西菜田 种粉虱数量结构 及烟粉虱生物型鉴定 西北农业学报 西 北 农 业 学 报 卷 责任编辑 郭柏寿 期 宋鲜梅等 基于 基因的宁夏烟粉虱及温室白粉虱分子鉴定
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