草莓胶孢炭疽菌拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌JK3的鉴定及其抗菌活性.pdf

浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis 2020 32 5 831 839 http www zjnyxb cn 冯江鹏 邱莉萍 梁秀燕 等 草莓胶孢炭疽菌拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌JK3的鉴定及其抗菌活性 J 浙江农业学 报 2020 32 5 831 839 DOI 10 3969 j issn 1004 1524 2020 05 11 收稿日期 2019 12 10 基金项目 浙江省自然科学基金青年基金 LQ18D050001 台州市科技计划 1701ny06 浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才 计划 2019R436011 2018年台州市211人才工程 第三层次择优 台州学院校培育基金 2017PY027 作者简介 冯江鹏 1996 男 甘肃酒泉人 本科生 专业为生物科学 E mail 320834878 qq com 通信作者 钟永军 E mail yjzhong tzc edu cn 草莓胶孢炭疽菌拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌JK3的鉴定及其 抗菌活性 冯江鹏1 2 邱莉萍3 梁秀燕1 2 陈碧秀1 2 夏海洋1 彭春龙2 钟永军1 2 1 台州学院生物制药研究所 浙江台州318000 2 台州学院生命科学学院 浙江台州318000 3 台州市农业科学研究院生物技术 研究所 浙江临海317000 摘 要 利用平板对峙法从堆肥中分离筛选到1株对草莓胶孢炭疽菌具有较强拮抗作用的细菌株系JK3 通 过生理生化特征 16S rDNA和rpoB序列分析 将JK3菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌 利用离体草莓叶片测定 了JK3发酵上清液对草莓炭疽病的防治效果 结果显示 JK3发酵上清液对草莓胶孢炭疽菌引起的草莓炭疽 病有明显预防效果 但治疗作用较差 提前24 h或接种胶孢炭疽菌孢子的同时喷施JK3发酵上清液 防治效果 超过95 接种胶孢炭疽菌孢子后24 h喷施发酵上清液 防治效果为11 5 对JK3发酵上清液进行不同的 温度 pH和蛋白酶处理 结果显示 发酵上清中的抑菌物质对pH和蛋白酶处理不敏感 但高温可降低其抑菌活 性 推测主要抗菌活性成分不是蛋白质 由于芽孢杆菌多产生脂肽类抗菌物质 利用相关合成基因检测引物进 行PCR扩增并测序 结果显示 JK3菌株含有脂肽类抗菌物质生物合成相关基因srfAA bymB fenD bacA和ituC 以上结果表明 贝莱斯芽孢杆菌JK3有开发为防治胶孢炭疽菌引起的草莓炭疽病的生防制剂潜力 关键词 草莓炭疽病 胶孢炭疽菌 贝莱斯芽孢杆菌 生物防治 拮抗活性 中图分类号 S476 1文献标志码 A文章编号 1004 1524 2020 05 0831 09 Identification of antagonistic bacteria Bacillus velezensis JK3 against anthracnose of straw berry and its antipathogenic activity FENG Jiangpeng1 2 QIU Liping3 LIANG Xiuyan1 2 CHEN Bixiu1 2 XIA Haiyang1 PENG Chunlong2 ZHONG Yongjun1 2 1 Institute of Biopharmaceuticals Taizhou University Taizhou 318000 China 2 School of Life Sciences Taizhou University Taizhou 318000 China 3 Biotech Research Institute Taizhou Academy of Agriculture Sciences Linhai 317000 China Abstract A bacterial isolate JK3 which was isolated from compost showed stronger antagonistic activity against Colletotrichum gloeosporioides causing strawberry anthracnose in dual culture assay The isolate JK3 was identified as Bacillus velezensis by physiological and biochemical characterization 16S rDNA and rpoB gene sequence analysis The inhibitory effects of JK3 fermented liquid on C gloeosporioides were evaluated with the detached strawberry leav es JK3 fermented liquid showed significant protection on strawberry anthracnose but poor therapeutic effect More than 95 control efficiency was achieved by spraying JK3 fermented liquid 24 h before inoculation with the spore suspension of C gloeosporioides or simultaneous inoculation Only 11 5 control efficiency was resulted by spraying JK3 fermented liquid 24 h after inoculation with the pathogen The antagonistic activity of the fermented liquid was stable to different pH values and proteases but sensitive to high temperature Thus implied that active component was not related to proteins It has been reported that most isolates of Bacillus spp produce active lipopeptides The existences of lipopeptide biosynthetic genes in JK3 were examined by PCR amplification with proper primer pairs and DNA sequencing Results showed that the JK3 contained srfAA bymB fenD bacA and ituC genes The above data indicated that B velezensis JK3 had a potential to be developed as biocontrol agent for controlling strawberry anthrac nose caused by C gloeosporioides Key words strawberry anthracnose Colletotrichum gloeosporioides Bacillus velezensis biocontrol antagonistic activity 草莓是重要的经济作物 在地方特色经济中 占有重要的地位 草莓炭疽病是威胁草莓产业 健康发展的主要病害之一 严重影响草莓的产量 和品质 给我国的草莓产业造成了巨大的经济损 失 1 2 草莓炭疽病菌是典型的高温高湿型病 菌 28 32 和90 以上的相对湿度是草莓炭 疽病菌侵染的最适条件 3 草莓栽培多以温室 大棚为主 草莓棚内易形成高温高湿的环境 利 于草莓炭疽病发生 研究表明 草莓炭疽病的病 原菌为炭疽菌属的多种真菌 有胶孢炭疽菌 Col letotrichum gloeosporioides 尖孢炭疽菌 Colleto trichum acutatum 草莓炭疽菌 Colletotrichum fragariae 等 4 不同地域的草莓炭疽病病菌的 优势种不同 浙江省草莓炭疽病的优势病原菌为 胶孢炭疽菌 5 目前 草莓炭疽病的防治主要依赖于化学药 剂 但化学药剂的大量使用所带来的药物残留问 题 环境问题等 不利于我国农业绿色可持续发 展 6 7 近年来 生物防治因其绿色 安全等特 点 越来越为人们所关注 其中 芽孢杆菌是应 用最为广泛的生防菌 具有抗逆性强 生物安全 性好等突出优点 随着生物防治措施的应用和 推广 筛选拮抗芽孢杆菌来防治草莓炭疽病也成 为研究热点 吉沐祥等 8 测定了枯草芽孢杆菌 和蛇床子素对草莓炭疽病病菌的室内抑菌活性 并结合田间试验的结果 证实枯草芽孢杆菌可用 于草莓炭疽病的防治 Nam等 9 从草莓叶片上 分离到1株贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis NSB 1 发现其对草莓炭疽病具有潜在的防治效 果 王美林等 10 研究发现 1 000亿 g 1枯草芽 孢杆菌对草莓炭疽病的防治效力与25 多菌灵 可湿性粉剂或450 g L 1咪鲜胺水乳剂的防治效 力相当 陈哲等 6 研究复合菌剂对草莓炭疽菌 的防治效果时发现 复合菌处理对于草莓炭疽病 的防治效果为68 69 比化学药剂的防治效果 提高了23 63 谷春艳等 11 研究发现 解淀粉 芽孢杆菌WH1G对草莓炭疽病菌具有较强的抑 制作用 当含菌量为1 0 1010 mL 1时 抑制率达 89 将咪鲜胺 0 045 3 mg L 1 与解淀粉芽孢 杆菌WH1G 2 3 106 mL 1 按5 5配比使用时 对病菌抑制的增效作用和防治效果最好 防效 达69 94 本研究从堆肥中分离对草莓胶孢炭疽菌具 有显著拮抗作用的菌株 通过生理生化试验和分 子技术对其进行鉴定 对其抗菌活性进行了初步 研究 该研究为发掘胶孢炭疽菌引起的草莓炭疽 病的生物防治菌株资源奠定了基础 1 材料与方法 1 1 供试菌株与培养基 LB培养基 蛋白胨10 0 g L 1 酵母粉5 0 g L 1 NaCl 10 0 g L 1 琼脂15 0 g L 1 仅固体培 养基 ddH2O 1 000 mL pH 7 2 7 4 PDA培养 基 马铃薯浸粉5 0 g L 1 葡萄糖20 0 g L 1 琼 脂14 0 g L 1 ddH2O 1 000 mL pH 7 0 7 4 供试的胶孢炭疽菌 C gloeosporioides 由台 州市农业科学研究院提供 1 2 试验方法 1 2 1 芽孢杆菌的分离 称取2 0 g土壤或堆肥样品放入100 mL锥 形瓶中 加入20 mL 0 9 NaCl溶液 摇匀后80 水浴20 min 取上清液 以10倍稀释制备5个 稀释梯度 吸取10 3 10 5稀释梯度的稀释液 238 浙江农业学报 第32卷 第5期 200 L涂布LB固体培养基 倒置于30 恒温箱 中培养24 48 h 从LB平板上挑取形态不同的 单菌落 反复划线分离纯化3次 挑取纯化的菌 落于LB培养基中培养24 h 加入甘油并将菌液 保藏于 20 冰箱 1 2 2 拮抗芽孢杆菌筛选 采用平板对峙法筛选拮抗芽孢杆菌 12 13 具体如下 取一块长满胶孢炭疽菌菌丝的PDA平 板 用6 mm打孔器制备菌饼 将菌饼转接于PDA 平板或LB平板的中央 置于30 恒温培养箱培 养1 d 利用十字交叉 在距离菌饼3 cm处的上 下同时接种待测芽孢杆菌发酵上清液1 5 L 在 距离菌饼3 cm处的左右同时接种1 5 L LB液 体培养基作为对照 置于30 恒温培养箱培养 隔天观察 用游标卡尺测量草莓胶孢炭疽菌的生 长 并计算菌丝生长抑制率 菌丝生长抑制率 dc dt dc 100 其中 dc为对照组 菌丝直径 dt为芽孢杆菌处理组菌丝直径 1 2 3 抑菌试验 制备发酵液 将待测芽孢杆菌接种于LB液 体培养基 30 150 r min 1摇床培养3 d 将菌 液分装于50 mL离心管中 12 000 g离心20 min 收集上清液并过0 22 m无菌过滤器 4 保藏待用 无菌发酵上清液的抑制试验参考张紊玮 等 13 的方法 具体如下 将JK3菌株的无菌发酵 上清液按10 的比例混入50 LB固体培养基 并倒平板 以混入10 比例的LB液体培养基作 为对照 在LB平板中央接种草莓胶孢炭疽菌菌 饼 直径6 mm 设置3个平行 置于30 恒温 培养箱培养 待对照组的草莓胶孢炭疽菌菌丝覆 盖平板3 4面积时 用游标卡尺记录各个LB平 板上的菌丝直径 并计算无菌发酵上清对菌丝生 长的抑制率 菌丝生长抑制率 100 dc dt dc 6 其中 dc为对照组菌丝直径 dt为芽孢杆菌处理组菌丝直径 1 2 4 形态学与生理生化试验测定 按照 常见细菌系统鉴定手册 14 和 伯杰 氏细菌鉴定手册 15 的方法对拮抗菌的形态和 生理生化特征进行鉴定 1 2 5 PCR扩增与序列测定 抽取待测菌株的基因组 用引物27F 5 AGAGTTT GATCCTGGCTCAG 3 和1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 进行PCR扩增其 16S rDNA序列 16 用引物rpoB f 5 AGGT CAACTAGTTCAGTATGGAC 3 和rpoB r 5 AA GAACCGTAACCGGCAACTT 3 进行PCR扩增 rpoB基因保守序列 17 用引物srfAF 5 TCGG GACAGGAAGACATCAT 3 和srfAR 5 CCACT CAAACGGATAATCCTGA 3 进行PCR扩增srfAA 基因序列 18 用引物bmyBF 5 GAATCCCGTT GTTCTCCAAA 3 和bmyBR 5 GCGGGTATT GAATGCTTGTT 3 进行PCR扩增bymB基因序 列 18 用引物bacAF 5 CAGCTCATGGGAAT GCTTTT 3 和bacAR 5 CTCGGTCCTGAAGGGA CAAG 3 进行PCR扩增bacA基因序列 18 用引 物fenDF 5 GGCCCGTTCTCTAAATCCAT 3 和 fenDR 5 GTCATGCTGACGAGAGCAAA 3 进行 PCR扩增fenD基因序列 18 用引物ituCF 5 GGCTGCTGCAGATGCTTTAT 3 和ituCR 5 TCGCAGATAATCGCAGTGAG 3 进行PCR扩增 ituC基因序列 18 PCR扩增产物经1 琼脂糖 凝胶电泳检测后 将目的条带所在胶块切割并送 至生物工程 上海 有限公司进行测序 利用 NCBI网站的BLAST功能对所测的16S rDNA和 rpoB序列进行同源性分析 确定亲缘关系 最后 使用MEGA 6 0软件 19 的Neighbor Joining法 20 构建系统发育树 1 2 6 抑菌活性物质的稳定性分析 JK3发酵上清液抑菌活性物质的稳定性试验参 考孙平平等 21 和张紊玮等 13 的方法 具体如下 温度稳定性 将JK3菌株的无菌发酵上清分 别置于25 40 50 60 70 80 90和100 处理30 min 按5 的比例将不同温度处理的无菌发酵上 清混入PDA固体培养基并倒平板 以混入5 比 例的LB培养基作为对照 向PDA平板接种胶孢 炭疽菌菌饼 置于30 恒温培养箱培养 待对照 组的草莓胶孢炭疽菌菌丝覆盖平板3 4面积时 用游标卡尺记录各个PDA平板上的菌丝直径 并 计算菌丝生长抑制率 菌丝生长抑制率 100 dc dt dc 6 其中dc为对照组菌丝 直径 dt为芽孢杆菌处理组菌丝直径 pH稳定性 用1 mol L 1的NaOH或HCl 将 10倍稀释的JK3无菌发酵上清的pH分别调为 338 冯江鹏 等 草莓胶孢炭疽菌拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌JK3的鉴定及其抗菌活性 2 3 4 5 6 7 8 9 10和11 静置3 h后调回原上 清液pH 7 5备用 用上述方法测定不同酸碱度 对其抑菌活性的影响 蛋白酶处理稳定性 将胰蛋白酶 胃蛋白酶 和蛋白酶K加入JK3无菌发酵上清液 控制体系 中的蛋白酶浓度为20 U mL 1 置于37 水浴处 理1 h 再用前述方法测定不同蛋白酶处理对其 抑菌活性的影响 1 2 7 离体草莓叶片防治试验 草莓叶片准备 植物材料为炭疽易感品种红 颊 定植于温室大棚 剪取离芯第2或第3片生 长健康 大小相近的复叶 置于保鲜袋带回 立即 使用 用75 乙醇棉球轻轻擦拭叶片 保留叶柄 2 3 cm 放置2片灭菌湿滤纸于直径20 cm培 养皿中 加入1 琼脂块 并将草莓叶柄插入琼脂 块中培养 胶孢炭疽菌孢子准备和接种 将活化培养后 的胶孢炭疽菌接于液体培养基PDB中 28 摇 床培养2 d 用3层灭菌纱布过滤后收集分生孢 子 通过血球计数板计数后用无菌水将其稀释至 105 mL 1 以无菌水为对照 均匀喷至草莓叶片 每个处理组设置14份草莓叶片 将JK3菌株的无菌发酵上清原液喷至草莓 叶片表面 发酵上清原液喷施时间分别为胶孢炭 疽菌孢子接种前24 h 同时 0 h 和接种后24 h 以喷施LB液体培养基作为对照 草莓叶片置于 25 光照培养箱培养 8 h 12h L D 湿度 85 7 d后观察记录 草莓叶片病变面积比例 病变面积 叶片总面积 100 草莓叶片 病变面积防治率 100 a b a 其中 a 为对照组草莓叶片病变面积比例 b为发酵上清 液处理组草莓叶片病变面积比例 2 结果与分析 2 1 胶孢炭疽菌拮抗芽孢杆菌JK3的分离与活 性测定 从堆肥等样品中分离纯化了204株芽孢杆 菌 利用平板对峙法分别测定分离的芽孢杆菌对 胶孢炭疽菌拮抗活性 其中12株具有明显的拮 抗活性 JK3菌株对胶孢炭疽菌的拮抗活性最强 图 1 A 固体平板上的菌丝生长抑制率为37 12 A为平板对峙法检测JK3菌株对胶孢炭疽菌的抑制活性 B和C为JK3菌株无菌发酵上清液的抑制活性 其中B为固体平板上的抑制 效果 C为抑制率统计结果 CK 空白对照组 0 1 V 发酵上清液终浓度稀释1 000倍 1 V 发酵上清液终浓度稀释100倍 10 V 发酵上清液终浓度稀释10倍 A was antagonistic activity of the isolate JK3 against C gloeosporioides by the plate confrontation method B was antagonistic activity of JK3 sterile fermented liquid and C was statistical results of inhibition rate of B CK Blank 0 1 V 1 000 fold dilution of final concentration of fermen ted liquid 1 V 100 fold dilution of final concentration of fermented liquid 10 V 10 fold dilution of final concentration of fermented liquid 图1 JK3菌株对草莓胶孢炭疽菌的抑制活性 Fig 1 Antagonistic activity of the isolate JK3 against C gloeosporioides 438 浙江农业学报 第32卷 第5期 JK3菌株的发酵上清液对胶孢炭疽菌具有较强的 抑制活性 图1 B 原液 相当于终浓度稀释10 倍 处理组的胶孢炭疽菌几乎不生长 菌丝生长 抑制率达93 93 终浓度稀释100倍处理组 菌 丝生长抑制率达到44 01 图1 C 2 2 JK3菌株分子鉴定和生理生化特性 用引物27F 1492R通过PCR扩增JK3菌株 的16S rDNA并送测序 测序结果上传GenBank 登录号MN860072 并且在NCBI利用BLAST 比对分析 结果显示 JK3菌株与Bacillus velezen sis XP 27 Bacillus methylotrophicus HB24和Bacil lus methylotrophicus SY33序列最相近 同源性达 到100 用引物rpoB f rpoB r扩增JK3菌株的 rpoB基因保守序列并测序 测序结果上传Gen Bank 登录号MN746370 用16S rDNA和rpoB 基因序列分别构建系统进化树 结果显示 JK3菌 株的16S rDNA和rpoB保守序列均与贝莱斯芽孢 杆菌聚为一支 图2 根据 常见细菌系统鉴定手册 和 伯杰氏细 菌鉴定手册 按照芽孢杆菌分类要求 对JK3菌 株进行产酶 碳源利用等生理生化特性分析 结 果见表1 JK3能利用山梨醇 D 果糖 纤维二 糖 甘油 葡萄糖 蔗糖 淀粉和乳糖 而不能利用 D 木糖 半乳糖和鼠李糖 能耐受10 NaCl 并 且过氧化氢酶试验 尿素酶试验 淀粉水解试验 明胶液化试验和V P试验呈阳性 表1 主要 生理生化特性与近源的贝莱斯芽孢杆菌相似 表1 A 基于16S rDNA部分序列构建的系统进化树 B 基于rpoB基因保守序列构建的系统进化树 系统进化树采用邻接法构建 分支数 表示1 000次Bootstrap重抽样分析的支持百分比 图例0 05和0 01为遗传距离 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA partial sequence A and rpoB gene conservative sequence B The phylogenetic tree was generated using the Neighbor Joining method The number of branches indicated the percentage of support for 1 000 bootstrap resampling analy sis the legend 0 05 and 0 01 were the genetic distance 图2 基于16S rDNA序列和rpoB基因保守序列构建的JK3菌株与相近典型菌株的系统进化树 Fig 2 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA partial sequence and rpoB gene conservative sequence of the iso late JK3 and other related typical strains 538 冯江鹏 等 草莓胶孢炭疽菌拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌JK3的鉴定及其抗菌活性 表1 JK3菌株的生理生化试验 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the isolate JK3 测定指标 Test B velezensis JK3 B velezensis FZB42 10 NaCl 革兰氏染色Gram staining 山梨糖醇Sorbitol D 果糖D Fructose D 木糖D Xylose 纤维二糖Cellobiose 甘油Glycerol 葡萄糖Glucose 蔗糖Sucrose 淀粉Starch 半乳糖Galactose 鼠李糖Rhamnose 乳糖Lactose 吲哚试验Indole test V P试验Voges Proskauer 甲基红试验Methyl red test 过氧化氢酶Catalase 淀粉水解Starch hydrolysis 脲酶Urease 柠檬酸盐利用Citrate utilization 明胶水解Gelatin hydrolysis 阴性 阳性 未见报道 Positive reaction Negative reaction No report 综合JK3菌株的分子特性和生理生化试验 结果 将JK3菌株定为贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus veleznsis 命名为贝莱斯芽孢杆菌JK3 B velezensis JK3 2 3 离体草莓叶片法测定JK3发酵上清液对草 莓炭疽病防治效果 图3显示 JK3发酵上清液的喷施时间对防 治效果有显著影响 在接种胶孢炭疽菌孢子前 24 h或接种胶孢炭疽菌孢子的同时喷施JK3的 发酵上清液 防治效果明显 分别达到95 68 和 98 99 而在胶孢炭疽菌孢子接种后24 h喷施 发酵上清液 则防治效果差 仅有11 5 因此 认为JK3菌株发酵上清液对胶孢炭疽菌引起的 草莓炭疽病有比较好的预防作用 但治疗作用 稍差 2 4 JK3菌株产生的主要活性物质 为了初步探索JK3菌株产生的抗菌活性物 质种类 分别测定了JK3菌株发酵上清液的热稳 定性 pH稳定性 以及对蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋 白酶和蛋白酶K 等的稳定性 结果 图4 表 A 喷施JK3发酵上清后的代表性草莓叶片 B 草莓叶片病变面 积防治率 24 h表示接种胶孢炭疽菌孢子前24 h喷施JK3 发酵上清液 0 h表示与接种胶孢炭疽菌孢子同时喷施JK3发 酵上清液 24 h表示接种胶孢炭疽菌孢子后24 h喷施JK3发 酵上清液 A Representative lesions on strawberry leaves after treatment with JK3 fermented liquid B Inhibition rate of lesion area on strawberry leaves 24 h Spraying JK3 fermented liquid 24 h before inocula tion with spore suspension of C gloeosporioides 0 h Simultaneous inoculation with spraying JK3 fermented liquid 24 h Spraying JK3 fermented liquid 24 h after inoculation 图3 离体草莓叶片试验检测JK3发酵上清液对胶孢炭 疽菌的防治效果 Fig 3 Inhibitory effect of JK3 fermented liquid on C gloeosporioides on detached strawberry leaves 明 JK3菌株发酵上清液pH稳定性好 对50 以上高温略敏感 处理30 min抑菌活性仍然能保 留70 以上 胃蛋白酶 胰蛋白酶和蛋白酶K处 理后 发酵上清液的菌丝生长抑制活性几乎不受 影响 推测JK3产生的主要活性物质可能是非蛋 白质类的小分子物质 也有可能产生类似其他芽 孢杆菌的脂肽类物质 由于芽孢杆菌脂肽类物质合成基因比较保 守 利用芽孢杆菌脂肽合成基因检测引物 以JK3 基因组DNA为模板进行PCR扩增 结果显示 能 扩增出Surfactin合成相关基因srfAA Bacillomycin 638 浙江农业学报 第32卷 第5期 图4 温度 A pH B 和蛋白酶 C 对发酵上清抑菌活性影响 Fig 4 Effect of different temperatures A pH B and proteases C on inhibitory stability of JK3 sterile fermented liquid against C gloeosporioides 合成相关基因bymB Bacillysin合成相关基因ba cA Fengycin合成相关基因fenD iturin A合成相 关基因ituC预期大小片段 图5 测序结果显 示 扩增出的DNA片段均为预期的基因片段 用NCBI中的BLAST比对分析 结果显示 克隆 出的基因序列均与来源于贝莱斯芽孢杆菌的相 关基因高度同源 表明该菌株具有合成多种脂肽 类抗菌物质的能力 推测这些脂肽类物质对草莓 胶孢炭疽菌具有抑菌活性 M DNA标准分子质量 M DNA marker 图5 JK3菌株脂肽合成酶基因PCR凝胶电泳检测 结果 Fig 5 Detection of lipopeptide biosynthesis genes in the isolate JK3 by PCR 3 结论与讨论 芽孢杆菌分类向来略有争议 2016年 Dun lap等 23 利用全基因组比较对贝莱斯芽孢杆菌 甲基营养型芽孢杆菌 解淀粉芽孢杆菌植物亚种 的分类地位进行研究 认为甲基营养型芽孢杆 菌 解淀粉芽孢杆菌植物亚种与贝莱斯芽孢杆菌 互为同物异名 贝莱斯芽孢杆菌属于枯草芽孢 杆菌群 鉴于16S rDNA序列在分类上的分辨率 问题 22 本文利用rpoB基因和16S rDNA联合分 析 结合生理生化试验结果 将JK3菌株鉴定为 贝莱斯芽孢杆菌 报道显示 贝莱斯芽孢杆菌分布广泛 在河 水 农作物土壤 鱼类肠道 植物组织和根际 以 及野牦牛牛粪等不同生境中均有发现 并且报道 的贝莱斯芽孢杆菌多表现出促植物生长和防治 植物病害的作用 22 本文从堆肥中分离到1株 对草莓胶孢炭疽菌具有显著拮抗效果的贝莱斯 芽孢杆菌JK3 利用离体草莓叶片测试胶孢炭疽 菌引起的草莓炭疽病防治试验 发现JK3发酵上 清液对草莓胶孢炭疽菌引起的草莓炭疽病有较 好的保护作用 但治疗效果稍差 因此 使用JK3 菌株可以用于预防由胶孢炭疽菌引起的草莓炭 疽病 由于浙江省草莓炭疽病主要病原菌为胶 孢炭疽菌 本文仅测试了JK3对胶孢炭疽菌的拮 抗 后一步应该广泛收集植物病原菌 进行JK3 抗菌谱试验 明确其可能的作用范围 室内毒力测定显示 稀释10倍的无菌发酵 上清液对胶孢炭疽病菌菌丝生长抑制率达到 93 显示良好的应用潜力 但室内毒力测定结 果不一定与田间防效成正比 离体叶片接种试验 展示了应用潜力 但由于离体叶片抗病性明显降 低 可能与活体效果会有差异 因此 后续需要 进一步利用盆栽试验来验证防治效果 芽孢杆 菌类产品通常以芽孢的形式进行销售和使用 芽 孢杆菌的定殖和原位拮抗决定防治效果 后续试 验需要研究JK3在草莓叶面的定殖 本文仅测 738 冯江鹏 等 草莓胶孢炭疽菌拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌JK3的鉴定及其抗菌活性 试了代谢产物的作用效果 如果菌体定殖和代谢 产物能够发生协同作用 将显著提高JK3的应用 效果 本试验利用脂肽合成基因引物对JK3菌株 的基因组进行扫描 检测到了Surfactin Bacillo mycin Bacillysin Fengycin和iturin A的合成相关 基因片段 显示JK3菌株具有合成多种脂肽类物 质的能力 初步试验显示JK3产生的主要抑菌 物质对温度 pH和蛋白酶稳定 显示JK3菌株具 有进一步研究的潜力 由于芽孢杆菌的抗菌物 质是当前芽孢杆菌研究领域的热点之一 而贝莱 斯芽孢杆菌显示了开发成生防制剂的潜力 并且 本文研究的JK3菌株对草莓胶孢炭疽菌引起的 草莓炭疽病显示出良好的防治效果 因此 JK3 研究可以为进一步发掘防治草莓炭疽病生防菌 资源奠定基础 参考文献 References 1 徐铭毅 赵娜 赵阳 草莓炭疽病的发生与防治 J 上海 蔬菜 2018 1 65 67 XU M Y ZHAO N ZHAO Y Occurrence and control of strawberry anthracnose J Shanghai Vegetables 2018 1 65 67 in Chinese 2 张晓慧 草莓病害研究进展 J 安徽农学通报 2018 24 18 52 57 ZHANG X H Research progress of strawberry diseases J Anhui Agricultural Science Bulletin 2018 24 18 52 57 in Chinese with English abstract 3 温庆文 钟霞 王蕾 等 大棚草莓定植后谨防炭疽病 J 农业知识 2017 26 27 29 WEN Q W ZHONG X WANG L et al Beware of anthrac nose after planting strawberries in greenhouses J Agricultur al Knowledge 2017 26 27 29 in Chinese 4 张国珍 我国对草莓炭疽根腐病的重视程度亟待提高 J 植物保护 2015 41 2 234 236 ZHANG G Z Urgent attention to anthracnose root rot of straw berry is highly needed in China J Plant Protection 2015 41 2 234 236 in Chinese with English abstract 5 任海英 蒋桂华 方丽 等 浙江省草莓炭疽病菌鉴定及 生物学特性研究 J 浙江农业学报 2011 23 5 937 941 REN H Y JIANG G H FANG L et al Identification and characterization of the pathogen of strawberry anthracnose in Zhejiang Province J Acta Agriculturae Zhejiangensis 2011 23 5 937 941 in Chinese with English abstract 6 陈哲 黄静 赵佳 等 防治草莓炭疽病的芽孢杆菌组合 的筛选 J 中国生物防治学报 2018 34 4 582 588 CHEN Z HUANG J ZHAO J et al Screening of the combi nations of Bacillus strains against strawberry anthracnose J Chinese Journal of Biological Control 2018 34 4 582 588 in Chinese with English abstract 7 王金楠 浅谈生物农药的特点及发展现状 J 现代化农 业 2014 11 4 5 WANG J N Brief talk about the characteristics and develop ment status of biopesticides J Modernizing Agriculture 2014 11 4 5 in Chinese 8 吉沐祥 杨敬辉 吴祥 等 草莓炭疽病的生物防治 J 江苏农业学报 2012 28 6 1498 1500 JI M X YANG J H WU X et al Biocontrol of strawberry anthracnose caused by Colletotrichum fragariae J Jiangsu Journal of Agricultural Sciences 2012 28 6 1498 1500 in Chinese with English abstract 9 NAM M H KIM H S LEE H D et al Biological control of an thracnose crown rot in strawberry using Bacillus velezensis nsb