一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物的基因组测序及分析.pdf

中 中国 国 瓜 瓜菜 菜 2020 33 6 12 16 一 个 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 中 国 分 离 物 的 基 因 组 测 序 及 分 析 李 丽 丽 1 郑 敏 2 杨 洪 一 2 1 黑龙江省林业科学研究所 哈尔滨 150081 2 东北林业大学生命科学学院 哈尔滨 150040 摘 要 利用CTAB法分离辣椒叶片总RNA 利用RT PCR技术扩增出了辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组 不同区域片段 并经克隆 测序 证明其为辣椒轻斑驳病毒特异序列 经序列拼接 获得了6290nt的辣椒轻斑驳 病毒中国分离物Hrb基因组全序列 该序列与GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因组的序列同源性为 94 0 99 6 系统进化分析显示辣椒轻斑驳病毒中国分离物 Hrb与日本分离物 PMMoV J C 1421 Pa18 TPO 2 19 亲缘关系较近 与西班牙分离物Ia亲缘关系较远 关键词 辣椒 辣椒轻斑驳病毒 基因组 中图分类号 S641 3 文献标志码 A 文章编号 1673 2871 2020 06 012 05 Genome sequence and analysis of a Chinese isolate of Pepper mild mottle virus LILili 1 ZHENGMin 2 YANGHongyi 2 1 Institute of Forestry Science of Heilongjiang Province Harbin 150081 Heilongjiang China 2 College of Life Sciences Northeast ForestryUniversity Harbin150040 Heilongjiang China Abstract Total RNAwas isolated from leaves of pepper using CTAB method The fragments located in different regions of a Chinese isolate of Pepper mild mottle virus PMMoV were amplified by RT PCR and the PMMoV specific frag ments were confirmed by cloning and sequencing A6290 nt genome sequence of Chinese isolate Hrb was obtained The identities between the sequence and other reported sequences in GenBank were 94 0 99 6 Phylogenetic analysis indicatedthattherewasclosegeneticrelationshipbetweenisolateHrbwithJapanisolates PMMoV J C 1421 Pa18 and TPO 2 19 Inaddition therewasfargeneticrelationshipbetweenisolateHrbwithSpanishisolateIa Keywords Pepper Peppermildmottlevirus Genome 收 稿 日 期 2019 12 16 修 回 日 期 2020 01 16 基 金 项 目 中央高校基本科研业务费项目 DL13EA06 03 作 者 简 介 李丽丽 女 副研究员 研究方向为微生物学 E mail 18830701 通 信 作 者 杨洪一 男 教授 研究方向为微生物学 E mail yhyi1 试验研究 辣椒轻斑驳病毒 Pepper mild mottle virus PMMoV 是当前辣椒生产中遇到的主要病毒之 一 1 辣椒轻斑驳病毒属烟草花叶病毒属 Tobamo virus 病毒粒体呈直杆状 辣椒轻斑驳病毒曾在 英国 美国辣椒田中引起毁灭性灾害 目前该病毒 已在美国 德国 日本等地广泛发生 并在世界各地 广泛分布 2 向本春等 3 于1994年在新疆辣椒上发 现了辣椒轻斑驳病毒 是我国的首次报道 此后 相继在青岛 北京等地广泛被报道 4 辣椒轻斑驳 病毒为种传病毒 带毒种子是病毒扩散的重要因 素 辣椒轻斑驳病毒可随辣椒制品进入人体 经消 化 排出体外后仍具有侵染性 5 早期侵染后 辣椒 轻斑驳病毒可使叶片轻度褪绿 部分植株矮化 症 状可能较轻微 后期可能使叶片斑驳 黄化 可使辣 椒果实呈现凹凸 坏死斑点或浅黄色斑驳 从而影 响辣椒产量及品质 1 辣椒轻斑驳病毒对辣椒生产造成了巨大威胁 因而迫切需要控制辣椒轻斑驳病毒造成的危害 培育抗病毒品种是控制植物病毒病危害的主要策 略 当前已获得了辣椒轻斑驳病毒的抗性基因 6 然而 由于病毒的快速变异 一些新的病毒分离物 可能使抗性基因失效 7 9 获得病毒不同分离物的 基因组序列并分析其分子变异特点是病毒防控的 基础性工作 笔者在前期研究中已获得了一个辣 12 第6期 等 基因组测序及分析 试验研究 李丽丽 等 一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物的基因组测序及分析 椒轻斑驳病毒中国分离物 在本试验中探索获得其 基因组序列并分析其分子变异特点 1 材料与方法 1 1 材料 感染辣椒轻斑驳病毒的辣椒植株于2014年取 自哈尔滨农田 经RT PCR鉴定其为辣椒轻斑驳病 毒 该分离物被命名为Hrb 基于辣椒轻斑驳病毒基因组序列 GenBank登 陆号 NC 003630 设计引物 引物序列见表1 引 物由上海生工生物工程公司合成 1 2 总RNA 分离 向离心管中加入490 LCTAB 10 L 巯基乙 醇 采集幼嫩叶片 经液氮速冻 快速研磨至细粉 并转入离心管 轻轻晃动离心管 65 水浴 之后 加入等体积的氯仿 异戊醇 24 1 混匀后12000r min 1 离心5 min 取上清 再次进行氯仿 异戊醇抽提 12 000 r min 1 离心5 min 取上清并加入1 10体积 3 mol L 1 醋酸钠 三倍体积无水乙醇 混匀后 12 000 r min 1 离心5 min 加入30 L去离子水溶 解沉淀 1 3 利 用RT PCR 技 术 扩 增 病 毒 基 因 组 不 同 区 域 片段 反转录体系如下 总RNA 1 0 L RNase free H2O 12 L M MLV Buffer 4 L 随机引物1 0 L dNTPs 0 5 L 10 mmol L 1 RNasin Ribonuclease Inhibitor 0 5 L M MLV 1 L 200 U 反应条件 为 37 2 5h 72 30min PCR体系如下 反转录产物2 L 10 Buffer 2 L MgCl23 L 10 甘油2 L 上下游引物各2 L 引物组合分别为A11 A22 B11 B22 C11 C22 D11 D22 E11 E22 F11 F22 dNTPs0 4 L 10mmol L 1 Taq DNA酶0 75 U 加去离子水至25 L 反应条 件 94 2min 94 30s 55 40s 72 1min 35个循环 72 5min 1 4 PCR 产物的克隆和测序 利用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回 收目的片段 将回收的目的片段与pMD 18T载体连 接 反应体系如下 5 L solution I buffer 1 L pMD 18T载体 1 L回收目的片段及3 L去离子 水 4 过夜连接 将10 L连接产物加入30 LJM109感受态细 胞中 冰上放置30min 42 热激45s 冰浴1min 加入LB液体培养基进行培养 经蓝白斑筛选 PCR 技术筛选阳性克隆 之后对阳性克隆进行双向 测序 使用DNAMAN软件对测序结果进行序列拼接 之后利用BLAST进行序列比较 利用CLUSTAL 1 83进行多序列比对 2 结果与分析 2 1 RT PCR 扩增及测序 利用CTAB法分离辣椒叶片总RNA 利用扩增 辣椒轻斑驳病毒基因组不同区域的引物对 经过不 断优化RT PCR反应条件 最终扩增出了预期的辣 椒轻斑驳病毒基因组不同区域片段 图1 利用胶 回收试剂盒 将扩增产物进行切胶回收纯化 之后 进行克隆 测序 获得了辣椒轻斑驳病毒中国分离 物Hrb基因组不同区域片段的序列 2 2 基因组特点分析 经序列拼接 获得了6 290 nt的辣椒轻斑驳 病毒中国分离物Hrb基因组全序列 图2 该序列 腺嘌呤 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 胞嘧啶的比例为19 18 15 12 其核苷酸序列比GenBank中已报道的辣椒 轻斑驳病毒基因组序列 GenBank登陆号 NC 003630 在700 768 nt处缺少69个核苷酸 序列缺 表1 扩 增 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 基 因 组 不 同 区 域 的 引 物 对 引物名称 A11 B11 C11 D11 E11 F11 A22 B22 C22 D22 E22 F22 引物序列 5 3 GTAAATTTTTCACAATTTAA GCGTCACAATGCTCAAAAGG CGTTTGAGAGGCCTACCG GTCTAGGCATACAAGGTCGATC CCTTCTCTGGAATTTTGAAGCC GTGTGTCAGAAGGAGGACCCG GGTTGCAATGCAAGTGCGAC GGTTGCAATGCAAGTGCGAC CTCACACACTCCAGATCTC GCACATCACAAAGAGAGGTCC TCTGTCAGCCATTGGAACTG TGGGCCGCTACCCGCGGTT 注 M DL2000 Marker 1 6 6个辣椒轻斑驳病毒基因组不同 片段 引物组合分别为A11 A22 B11 B22 C11 C22 D11 D22 E11 E22 F11 F22 图1 利 用RT PCR 技 术 扩 增 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 中 国 分 离 物 Hrb 基 因 组 不 同 区 域 片 段 2000bp 1000bp 2000bp 1000bp 13 中 国 瓜 菜 第33卷 试验研究 失其并未造成移码突变 在GenBank中未见类似缺 失核苷酸的辣椒轻斑驳病毒分离物 获得的基因组序列包含 4个开放阅读框 ORF ORF1 70 4 842 nt ORF2 70 3 357 nt ORF3 4 843 5 616 nt ORF4 5 619 6 092 nt 分别 编码183 KDa蛋白 126 KDa蛋白 运动蛋白 28 KDa 外壳蛋白 17KDa 3 非编码区 5 非编码 区分别为198nt 69nt 图2 辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组序列与 GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因组 序列同源性为94 0 99 6 中国分离物Hrb的 ORF1 ORF2 ORF3 ORF4所编码蛋白分别与其他 分离物氨基酸序列同源性为96 2 97 7 95 4 96 8 96 5 99 6 94 3 98 1 表2 中国分 离物Hrb非编码区序列与其他分离物同源性分别为 95 7 98 6 97 5 100 将得到的辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因 组序列与烟草花叶病毒属内其他病毒进行了序列 注 下划线标记区为非编码区序列 图2 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 中 国 分 离 物Hrb 的 基 因 组 序 列 14 第6期 等 基因组测序及分析 试验研究 李丽丽 等 一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物的基因组测序及分析 比较 此分离物与番茄花叶病毒 Tomato mosaic virus ToMV 亲缘关系最近 核苷酸序列相似性为 68 5 与郁金香脉明病毒 Turnip vein clearing virus TVCV 亲缘关系最远 ORF1 ORF2 ORF4 的核苷酸序列相似性 氨基酸序列相似性均与番茄 花叶病毒相似性最高 其次为烟草花叶病毒 Tobacco mosaic virus TMV 与郁金香脉明病毒 Turnip veinclearingvirus TVCV 相似性最低 基于辣椒轻斑驳病毒基因组运动蛋白及外壳 蛋白序列 对不同辣椒轻斑驳病毒分离物进行了系 统进化分析 获得的分离物与日本分离物 PM MoV J C 1421 Pa18 TPO 2 19 亲缘关系较近 并 聚集在一起形成一个小的进化枝 图3 与西班牙 分离物Ia亲缘关系较远 表2 中 国 分 离 物Hrb 不 同ORF 与 与 其 他 分 离 物 氨 基 酸 序 列 的 同 源 性 GenBank登陆号 ALT54482 AKL59778 AND76923 BAJ19100 AQN78275 BAD90600 AIC77170 AVP80828 BAE92304 BAS32797 CCJ27723 ORF1 97 5 97 7 97 7 97 7 97 7 97 1 97 5 97 3 97 2 96 2 ORF2 96 8 96 8 96 7 96 7 96 7 96 3 96 4 96 6 96 4 95 4 ORF3 98 1 99 6 99 2 98 8 98 4 97 7 98 8 98 4 97 7 96 5 ORF4 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 96 2 94 3 分离物起源 加拿大 中国 委内瑞拉 巴西 韩国 韩国 印度 美国 日本 韩国 土耳其 注 表示无该序列信息 注 不同分离物的 GenBank登陆号如下 PMMoV J AB000709 C 1421 AB069853 S M81413 Pa18 AB113116 TPO 2 19 AB113117 PMMoV CN AY859497 BR DF01 AB550911 P AB084456 Kr AB126003 L4BV AB276030 Iw AB254821 Ia AJ308228 图3 基 于 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 基 因 组 运 动 蛋 白 及 外 壳 蛋 白 的 系 统 进 化 树 3 讨论与结论 我国自1994年首次报道了辣椒轻斑驳病毒后 已有较多关于辣椒轻斑驳病毒危害辣椒的报 道 1 3 4 9 然而 当前尚未引起辣椒生产及科研人员 的广泛重视 辣椒种子可携带辣椒轻斑驳病毒 因 而利于其快速传播 此外 人类粪便中的辣椒轻斑 驳病毒也具有侵染性 即使常规堆肥也难以彻底杀 灭植物残体 粪便中的辣椒轻斑驳病毒 5 因而 当 前我国辣椒轻斑驳病毒的危害范围可能远远超过 现有报道中的分布范围 目前已有的辣椒轻斑驳病毒的报道主要集中 于华北 华东等地 1 4 9 其他地域的相关报道较少 且 该病毒中国分离物的分子变异特点也尚不明晰 东北林业大学生命科学学院植物病原微生物课题 组前期研究中已获得了一个辣椒轻斑驳病毒中国 分离物 笔者获得了其基因组序列并分析了其分子 变异特点 当前我国已报道的辣椒轻斑驳病毒分 离物较少 有必要通过大规模筛选分离 获得更多 辣椒轻斑驳病毒中国分离物 并进一步分析当前主 要抗辣椒轻斑驳病毒基因对不同病毒分离物的有 效性 15 中 国 瓜 菜 第33卷 试验研究 经RT PCR 克隆 测序 获得了6290nt的辣椒 轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组全序列 该序列 与GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因 组的序列同源性为94 0 99 6 系统进化分析显 示辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb与日本分离物亲 缘关系较近 与西班牙分离物Ia亲缘关系较远 参考文献 1 王亚南 赵绪生 袁文龙 等 辣椒轻斑驳病毒研究现状 J 安徽农业科学 2010 38 14 7401 7402 2 ANTIGNUS Y LACHMAN O PEARLSMAN M et al A new pathotype of Pepper mild mottle virus PMMoV over comes the L 4 resistance genotype of pepper cultivars J Plant Disease 2008 92 1033 1037 3 向本春 谢浩 崔星明 等 新疆辣椒轻微斑驳病毒的分离鉴 定 J 病毒学报 1994 10 3 240 245 4 陈青 余芳平 林石明 等 进境辣椒种子中检测出辣椒轻斑 驳病毒 J 植物检疫 2005 19 5 295 296 5 COLSONP RICHETH DESNUESC etal Pepper mild mot tlevirus aplantvirusassociatedwithspecificimmuneresponses fever abdominal pains and pruritus in humans J PLOS ONE 2010 5 4 10041 6 TENLLADO F GARCIA LUQUE I SERRA M T et al Pepper resistance breaking tobamoviruses Can they co exist in single pepper plant J European Journal of Plant Pathology 1997 103 3 235 243 7 HIROYUKIH REIKOT YASUYAI etal Cooperativeeffect of two amino acid mutations in the coat protein of Pepper mild mottle virus overcomes L3 mediated resistance in Capsicum plants J VirusGenes 2007 34 2 205 214 8 KAZUHIRAT YASUFUMI H SHIGEHARU T et al Epide miological aspects of the Japanese tobamovirus strain Pepper mild mottle virus infecting the L2 resistance of green pepper J Scientific Reports of the Faculty of Agriculture Okayama University 2004 93 19 27 9 郑敏 辣椒轻斑驳病毒的鉴定及基因组分析 D 哈尔滨 东 北林业大学 2013 16