美洲南瓜枯萎病菌分离鉴定及其生物学特性.pdf

中 中 国 国 瓜 瓜 菜 菜 2020 33 3 23 28 试验研究 收 稿 日 期 2020 02 13 修 回 日 期 2020 02 26 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 31460518 甘 肃 农 业 大 学 科 技 创 新 基 金 GAU XKJS 2018 156 作 者 简 介 李 金 峰 男 在 读 硕 士 研 究 生 研 究 方 向 为 植 物 病 理 学 E mail lijinfeng5323 通 信 作 者 徐 秉 良 男 教 授 主 要 从 事 植 物 病 理 学 研 究 E mail xubl 美 洲 南 瓜 Cucurbita pepo 属 于 葫 芦 科 南 瓜 属 Cucurbita 别 名 为 西 葫 芦 番 瓜 等 原 产 于 北 美 洲 南 部 地 区 因 其 含 有 多 种 营 养 成 分 具 有 很 高 的 食 用 和 药 用 价 值 在 我 国 大 部 分 地 区 普 遍 栽 培 1 甘 肃 省 武 威 市 是 美 洲 南 瓜 的 重 要 育 种 研 发 和 生 产 基 地 也是当地重要的经济作物之一 2 瓜 类 枯 萎 病 是 瓜 类 生 产 上 最 难 防 治 的 土 传 性 病 害 之 一 3 其 中 以 西 瓜 发 病 最 重 南 瓜 次 之 一 般 可 导 致 减 产20 30 严 重 时 可 达50 60 其 中 连 作 地 的 发 病 情 况 最 为 严 重 常 可 导 致 全 田 无 收 加 之 近 年 来 枯 萎 病 对 美 洲 南 瓜 的 危 害 日 益 严 重 但 其 防 治 较 为 困 难 因 此 枯 萎 病 的 危 害 是 瓜 类 生 产 上 急 需 解 决 的 重 要 问 题 4 也 成 为 限 制 美 洲 南 瓜 生 产的重要因素之一 5 研 究 表 明 瓜 类 枯 萎 病 的 病 原 菌 多 为 尖 孢 镰 孢 菌 6 引 起 甜 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 为 尖 孢 镰 孢 菌 甜 瓜 专 化 型Fusariumoxysporumf sp melonls 7 徐 彦 刚 等 8 研 究 表 明 尖 孢 镰 孢 菌 黄 瓜 专 化 型 F oxysporum f sp cucumerinum 是 造 成 黄 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 吕 佩 珂 等 9 研 究 认 为 尖 镰 孢 菌 西 瓜 专 化 型 F oxysporum f sp niveum 为 侵 害 西 瓜 的 枯 萎 病 病 原 菌 但 是 关 于 近 几 年 来 甘 肃 省 武 威 地 区 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 原 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 分 离 鉴 定 及 其 生 物 学 特 性 李 金 峰 1 刘 佳 1 侯 敏 1 张 树 武 1 沈 志 彦 1 徐 秉 良 1 陈 荣 贤 2 1 甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室 甘肃农业大学植物保护学院 兰州 730070 2 甘肃省武威金苹果有限责任公司 甘肃武威 733000 摘 要 通 过 采 用 病 原 菌 形 态 学 观 察 ITS 分 子 鉴 定 病 原 菌 生 物 学 特 性 测 定 明 确 甘 肃 省 武 威 地 区 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 及 其 生 物 学 特 性 结 果 表 明 引 起 甘 肃 省 武 威 地 区 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 为 尖 孢 镰 孢 菌 Fusarium oxysporum 该 病 原 菌 在 25 12 h 光 暗 交 替 pH 为 8 以 淀 粉 为 碳 源 时 生 长 最 好 以 硝 酸 钠 和 尿 素 为 氮 源 时 其 生 长 速 率 最 快 以 牛 肉 浸 膏 为 氮 源 时 最 有 利 于 产 孢 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 及 生 物 学 特 性 的 明 确 为 后 续 的 病害防治等方面提供了理论基础 关键词 美洲南瓜 枯萎病 分离鉴定 尖孢镰孢菌 生物学特性 中图分类号 S642 6 文献标志码 A 文章编号 1673 2871 2020 03 023 06 Identificationandbiologicalcharacteristicsofthepathogencausing CucurbitapepoFusariumwilt LIJinfeng 1 LIUJia 1 HOUMin 1 ZHANGShuwu 1 SHENZhiyan 1 XUBingliang 1 CHENRongxian 2 1 Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province College of Plant Protection Gansu Agricultural University Lanzhou730070 Gansu China 2 WuweiGoldenAppleCo Ltd Wuwei733000 Gansu China Abstact In this study morphological observation of pathogens molecular identification of ITS and determination of biological characteristics of pathogens were used to determine the pathogens and biological characteristics of Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province The results showed that the pathogen causing Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province was Fusarium oxysporum The fungi was alternated in light and dark at 25 12h pH 8 and grew best when starch was used as the carbon source When sodium nitrate and urea were used as nitrogensources thegrowthratewasfastest andwhenbeefextractwasusedasnitrogensource itwasmostconduciveto spore production The pathogens and biological characteristics of the Cucurbita pepo Fusarium wilt disease provide a theoreticalbasisforsubsequentdiseasecontrol Keywords Cucurbitapepo Fusariumwilt Isolationandidentification Fusariumoxysporum Biologicalcharacteristics 23 中 国 瓜 菜 第33 卷 试验研究 菌的相关报道相对较少 明 确 病 原 菌 的 种 类 及 其 生 物 学 特 性 是 进 行 病 害 防 治 的 基 础 工 作 因 此 笔 者 对 甘 肃 省 武 威 地 区 的 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 原 菌 进 行 分 离 鉴 定 并 对 其 生 物 学 特 性 进 行 研 究 以 期 为 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 防 治 奠定基础 1 材料与方法 1 1 材料 供 试 的 美 洲 南 瓜 品 种 金 苹 果12 号 金 苹 果9 号 三 星 四 星 P3 和 P13 均 由 甘 肃 省 武 威 市 金苹果有限责任公司提供 1 2 方法 1 2 1 病 样 采 集 2018 年 6 月 15 日 在 甘 肃 省 武 威 市 金 苹 果 有 限 责 任 公 司 种 质 资 源 试 验 基 地 随 机 采 集 美 洲 南 瓜 金 苹 果12 号 金 苹 果9 号 三 星 和 四 星 品 种 的 枯 萎 病 发 病 植 株 共20 株 将 病 样 带 回 甘 肃 农 业 大 学 植 物 保 护 学 院 植 物 病 毒 与 分 子 学研究实验室进行分离鉴定 1 2 2 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 原 菌 分 离 与 纯 化 供 试 培 养 基 PDA 培 养 基 马 铃 薯 200 g 葡 萄 糖 15 g 琼 脂 粉 进 口 10g 用 水 定 容 至1000mL 用 于 病 原 菌的分离纯化培养 CLA 培 养 基 新 鲜 康 乃 馨 叶 片 小 块 灭 菌 后 放 入 培 养 皿 中 每 皿5 10 片 琼 脂 粉 进 口 10g 加 水 定 容 至 1000mL 用于病原菌大小型分生孢子的观察 培 养 Czapek 培 养 基 1gKH2PO4 0 5gMgSO4 7H2O 0 01 g FeSO4 7H2O 30 g 蔗 糖 0 5 g KCl 2 g Na NO3 琼 脂 粉 进 口 10 g 用 水 定 容 至 1 000 mL 用 于不同碳氮源对美洲南瓜枯萎病菌的培养 组 织 分 离 法 用 无 菌 水 将 病 株 样 品 茎 基 部 和 根 部 冲 洗 干 净 用 无 菌 滤 纸 将 水 分 吸 干 在 超 净 工 作 台 中 将 发 病 茎 基 部 和 根 部 的 病 健 交 界 处 切 成 5 mm 5 mm 的 小 块 将 处 理 好 的 小 块 用 75 乙 醇 浸 润10s 再 用0 1 升 汞 溶 液 消 毒2 3min 然 后 用 无 菌 水 漂 洗3 次 用 无 菌 滤 纸 吸 干 残 余 水 分 将 此 病 健 交 界 小 块 采 用 五 点 法 接 于 PDA 平 板 上 然 后 将 其 放 入 恒 温 培 养 箱 中 培 养 约 3 4 d 温 度 25 16h 光 照 8h 黑 暗 及 时 挑 取 根 段 周 围 长 出 的 菌 落 接 种 于 新 的PDA 平 板 上 置 于25 培 养 箱 中 恒 温 培 养 10 待 纯 化 的 菌 落 生 长5 10d 用 无 菌 水 冲 洗 菌 丝 表 面 收 集 孢 子 或 菌 丝 悬 浮 液 采 用 稀 释 法 进 行 单 孢 分 离 纯 化 病 原 菌 待 PDA 平 板 上 长 出 单 菌 落 用 接 种 针 挑 取 少 量 菌 丝 或 孢 子 至 新 的PDA 平 板 上 培养 即获得单孢或单菌丝分离物 1 2 3 致 病 性 测 定 病 原 菌 孢 子 悬 浮 液 的 配 制 将 分 离 得 到 的 病 菌 在 PDA 平 板 上 培 养 7 d 后 用 0 025 的 吐 温 80 溶 液 和 无 菌 水 洗 下 孢 子 用 无 菌 的 玻 棒 搅 拌 均 匀 血 球 计 数 板 观 察 计 数 配 制 成 浓 度为1 10 5 个 mL 1 孢子悬浮液备用 首 先 对 美 洲 南 瓜 种 子 进 行 催 芽 处 理 然 后 移 入 育 种 盘 等 幼 苗 生 长 7 d 后 在 其 根 部 和 茎 基 部 制 造 微 伤 口 在 伤 口 处 喷 洒 分 离 得 到 的 浓 度 为 1 10 5 个 mL 1 的 病 菌 孢 子 悬 浮 液 后 在 恒 温 培 养 箱 中 继 续 培 养 温 度 25 16 h 光 照 8 h 黑 暗 以 无 菌 水 处 理 为 对 照 观 察 并 记 录 10 待 发 病 后 取 茎 基 部 发 病 组 织 再 次 进 行 病 原 菌 分 离 纯 化 与 鉴 定 1 2 4 病 原 菌 的 形 态 学 鉴 定 将 病 原 菌 在PDA 平 板 上 纯 化 后 用 直 径 为5mm 打 孔 器 打 取 菌 饼 接 种 于 新 的PDA 平 板 和CLA 平 板 上 每 种 病 原 菌6 次 重 复 然 后 置 于 25 恒 温 培 养 箱 培 养 7 d 后 观 察 记 录 培 养 于PDA 平 板 上 的 病 原 菌 菌 落 形 态 特 征 及 培 养 皿 背 面 着 色 情 况 15 d 后 挑 取 CLA 平 板 上 的 菌 丝 在 光 学 显 微 镜 下 观 察 其 大 小 型 分 生 孢 子 等 并 进 行 拍 照 参 照LeslieJ F 等 11 的 方 法 对 病 原 菌进行鉴定 1 2 5 病 原 菌 的 分 子 生 物 学 鉴 定 参 照 OMEGA 公司 的HPPlantDNAKit 试剂 盒说 明书 提取 病原 菌 DNA 利 用 真 核 生 物 基 因 组 中 的rDNA ITS 区 段 通 用 引 物ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 和ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 对 病 原 菌 基 因 组DNA 进 行PCR 扩 增 12 PCR 扩 增 产 物 经1 2 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 后 送 至 西 安 擎 科 生 物 科 技 有 限 公 司 测 序 将 测 序 结 果 在NCBI 网 站 的 数 据 库 中 比 对 测 序 结 果 在 线 搜 索 同 源 性 较 高 的 已 知 序 列 将 序 列 信 息 导 入 MEGA7 软 件 通 过 邻 接 法 neighbor joining 构 建 系 统 聚 类 树 分 析 其 亲 缘 关 系 根据比对结果 进行分子生物学鉴定 1 2 6 温 度 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的 影 响 将 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 接 种 于 PDA 培 养 基 上 分 别 置 于5 15 20 25 30 35 40 无 光 照 保 湿 培 养7d 每 处 理5 次 重 复 用 十 字 交 叉 法 每2d 测 量1 次 菌 落 的 直 径 取 其 平 均 值 并 计 算 菌 丝 平 均 生 长 速 度 在 培 养 7 d 后 用 无 菌 水 洗 下 孢 子 制 作 成 孢 子 悬 浮 液 并 将 体 积 定 容 到 10 mL 取 50 L 孢 子 悬浮液滴于血球计数板上进行病原菌孢子计数 13 1 2 7 光 照 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的 影 响 将 已 接 种 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 的PDA 培 养 基 24 第3 期 等 美洲南瓜枯萎病菌分离鉴定及其生物学特性 试验研究 分 为3 组 25 持 续 光 照 培 养96h 25 持 续 黑 暗 培 养96h 25 黑 暗12h 与 光 照12h 交 替 培 养96h 每 处 理 重 复5 次 按1 2 6 中 的 方 法 测 量 菌 丝 生 长 和产孢量 1 2 8 碳 源 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的 影 响 采 用 查 彼 Czapek 培 养 基 14 作 为 基 础 培 养 基 将 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 分 别 接 入 以 相 同 质 量 的 麦 芽 糖 葡 萄 糖 淀 粉 甘 露 醇 和 乳 糖 代 替 查 彼 培 养 基 中 的 蔗 糖 的 培 养 基 中 并 以 不 加 碳 源 的 培 养 基 作 为 对 照 室 温 培 养 每 处 理 5 次 重 复 7 d 后 观 察 菌 落 形 态 和 孢 子 形 成 情 况 并 按 照1 2 6 中 的 方 法 测 量 菌丝生长和产孢量 1 2 9 氮 源 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的 影 响 将 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 分 别 接 入 以 相 同 质 量 氮 的 硝 酸 铵 尿 素 氯 化 铵 硫 酸 铵 和 牛 肉 浸 膏 替 代 替 基 础 培 养 基 中 的NaNO3 的 培 养 基 中 并 以 不 加 氮 源 的 培 养 基 为 对 照 室 温 培 养 每 处 理 5 次 重 复 7 d 后 观 察 菌 落 形 态 和 孢 子 形 成 情 况 并 按 照 1 2 6 中的方法测量菌丝生长和产孢量 1 2 10 pH 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的 影 响 将 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 接 种 于 不 同 pH 的 PDA 培 养 基 上 设 置 5 个 处 理 pH 分 别 为 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 每 处 理 5 次 重 复 在 室 温 下 培 养 按 1 2 6 中的方法测量菌丝生长和产孢量 2 结果与分析 2 1 美洲南瓜枯萎病田间发病症状 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 初 期 表 现 为 植 株 下 层 叶 片 下 垂 或 萎 蔫 叶 片 颜 色 稍 有 加 深 向 主 叶 脉 轻 微 皱 缩 似 缺 水 状 图1 b 病 株 茎 基 部 维 管 束 茎 秆 表 皮 变 褐 腐 烂 图1 c d 出 现 初 期 症 状 后3 4d 植 株 死 亡 2 2 美洲南瓜枯萎病病原菌的分离鉴定 2 2 1 病 原 菌 的 分 离 在 PDA 培 养 基 上 对 20 株 美 洲 南 瓜 病 株 全 部 进 行 分 离 与 纯 化 共 得 到 16 种 分 离 物 根 据 形 态 学 特 征 归 为 Ng 6 Ng 7 和 Ng 8 三 个 不 同 的 类 群 其 中Ng 6 包 含3 个 分 离 物 占 总 分 离 物 的 18 75 Ng 7 包 含 11 个 分 离 物 占 总 分 离 物 的68 75 Ng 8 包 含2 个 分 离 物 占 总 分 离 物 的 12 5 分 别 选 取 三 个 类 群 中 最 具 代 表 性 的 Ng 6 1 Ng 7 1 和Ng 8 1 用于后续试验 2 2 2 致 病 性 测 定 从 2 2 1 分 离 得 到 的 Ng 6 1 Ng 7 1 和 Ng 8 1 进 行 纯 化 分 别 用 纯 化 后 的 菌 株 回 接 到 美 洲 南 瓜 相 同 品 种 健 康 幼 苗 图 2 其 中 Ng 7 1 的 处 理 组 美 洲 南 瓜 在7d 后 发 病 且 表 现 为 叶 片 和 茎 秆 萎 蔫 失 水 茎 基 部 变 褐 对 照 组 均 未 发 病 且 根 系 发 达 根 据 柯 赫 氏 法 则 对 接 种 病 原 菌 后 发 病 植 株 的 病 健 交 界 处 再 次 进 行 组 织 分 离 和 纯 化 得 到 的 病 原 菌 与 Ng 7 1 一 致 故 初 次 分 离 到 的 Ng 7 1 为美洲南瓜枯萎病的致病菌 2 2 3 病 原 菌 的 形 态 学 鉴 定 将 纯 化 后 的 Ng 7 1 菌 株 在PDA 培 养 基 上 进 行 培 养 在 培 养5 7d 后 可 形 成 边 缘 较 整 齐 的 圆 形 单 菌 落 菌 落 正 面 为 白 色 或 紫 色 突 起 絮 状 绒 毛 状 菌 丝 体 纤 细 背 面 产 生 紫 色 色 素 图 3 a b 在 CLA 培 养 基 上 进 行 培 养 15d 后 观 察 到 病 原 菌 菌 株 的 分 生 孢 子 有 两 种 形 态 小 型 分 生 孢 子 数 量 居 多 呈 椭 圆 形 卵 形 多 为 单 孢 大 小 为 5 5 15 0 3 0 6 8 m 图3 c 大 型 分 生 孢 子 数 量 较 少 呈 镰 刀 形 中 间 略 弯 曲 两 端 细 胞 稍 尖 多 数 为 3 隔 大 小 为 17 8 35 5 4 0 5 8 m 图 3 c 根 据 菌 落 特 征 及 病 原 菌 分 生 孢 子 的 形 状 初 步 鉴 定 分 离 纯 化 的 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 为 尖孢镰孢菌F oxysporum 注 a 健 康 植 株 b 萎 蔫 症 状 c 主 根 表 皮 腐 烂 d 茎 基 部 腐 烂症状 图1 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 田 间 发 病 症 状 a b d c 注 a 对照 b 菌株Ng 7 1 接种 图2 病 原 菌 对 美 洲 南 瓜 致 病 性 测 定 接 种7d 李金峰 a a b 25 中 国 瓜 菜 第33 卷 试验研究 2 2 4 分 子 生 物 学 鉴 定 将Ng 7 1 菌 株 的ITS 序 列 的 测 序 结 果 提 交 至 GenBank 获 得 注 册 号 为 MN814027 通 过 与NCBI 网 站 的 数 据 库 进 行 比 对 分 析 结 果 显 示 该 序 列 与 尖 孢 镰 孢 菌 F oxysporum 的 相 似 性 达 到 了99 建 立 系 统 发 育 树 图4 结 果 表 明 Ng 7 1 菌 株 与 尖 孢 镰 孢 菌 聚 在 同 一 分 支 亲 缘 关 系 最 近 从 而 确 定 从 甘 肃 省 武 威 地 区 采 集 的 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 株 的 病 原 菌 为 尖 孢 镰 孢 菌F oxysporum a b c 注 a PDA 菌落正面 b PDA 菌落背面 c 大小型分生孢子 CLA 培养基 图3 病 原 菌 形 态 学 鉴 定 2 3 温 度 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的 影响 不 同 的 温 度 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 的 菌 株 生 长 和 产 孢 量 具 有 一 定 的 影 响 表 1 菌 株 在 10 35 范 围 内 均 能 生 长 产 孢 在20 30 的 温 度 范 围 内 菌 丝 生 长 较 好 其 中 生 长 最 快 产 孢 量 也 最 多 的 温 度 为25 该 菌 在 温 度 低 于5 或 高 于40 的 条 件 下不生长也不产生分生孢子 2 4 光 照 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的 影响 该 菌 在25 条 件 培 养24h 后 进 行 不 同 光 照 处 理 后 菌 丝 生 长 和 产 孢 量 呈 现 出 一 定 的 差 异 表2 其 中 12 h 光 暗 交 替 培 养 96 h 的 菌 丝 生 长 速 率 最 快 产 孢 量 最 多 持 续 黑 暗 菌 丝 生 长 速 率 最 慢 持 续光照产孢量最少 2 5 不 同 碳 源 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的影响 该 病 原 菌 在 不 同 的 碳 源 培 养 基 上 均 能 生 长 并 且 都 与 对 照 差 异 显 著 表 3 其 中 最 适 碳 源 为 淀 图4 基 于ITS 序 列 建 立 菌 株Ng 7 1 系 统 发 育 树 注 同列不同小写字母表示在0 05 水平差异显著 下同 表1 温 度 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 丝 生 长 及 产 孢 量 的 影 响 温度 5 15 20 25 30 35 40 菌丝生长速率 cm d 1 0 00f 0 69e 0 84d 1 15a 0 94c 0 63f 0 00f 产孢量 10 6 个 mL 1 0 00d 4 83c 4 98c 13 50a 6 58b 6 55b 0 00d 26 第3 期 等 美洲南瓜枯萎病菌分离鉴定及其生物学特性 试验研究 粉 病 原 菌 生 长 速 率 最 快 产 孢 量 最 多 而 该 菌 在 葡 萄 糖 培 养 基 上 生 长 速 率 最 慢 且 产 孢 量 最 少 在 对 照培养基上菌丝几乎不生长 2 6 不 同 氮 源 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 长 和 产 孢 量 的影响 该 病 原 菌 在 不 同 的 氮 源 培 养 基 上 均 能 生 长 产 孢 但 不 同 氮 源 之 间 存 在 一 定 的 差 异 表 4 其 中 在 硝 酸 钠 和 尿 素 培 养 基 上 菌 丝 生 长 速 率 较 快 且 无 显 著 性 差 异 在 硫 酸 铵 培 养 基 上 菌 丝 生 长 最 慢 在 牛 肉 浸 膏 培 养 基 上 产 孢 量 最 多 与 其 他 氮 源 差 异 显 著 在 硫 酸 铵 尿 素 和 硝 酸 铵 培 养 基 上 产 孢 量 较 少 且 无 明 显 差 异 缺 氮 时 菌 丝 生 长 较 快 但 只 是 稀 疏 的气生菌丝 几乎不产孢 2 7 pH 对美洲南瓜枯萎病菌生长和产孢量的影响 该 病 原 菌 在pH 为5 0 9 0 范 围 内 均 能 生 长 产 孢 表5 其 中pH 为8 0 时 菌 丝 生 长 最 快 产 孢 量 最 多 而pH 为5 0 时 菌 丝 生 长 速 率 最 慢 产 孢 量 最 少 说 明 该 菌 在 中 性 及 偏 碱 性 条 件 下 生 长 快 容 易 产 孢 3 讨 论 研 究 表 明 瓜 类 香 蕉 茄 子 向 日 葵 等 植 物 的 枯 萎 病 均 由 尖 孢 镰 孢 菌 侵 染 所 致 15 16 该 病 菌 具 有 不 同 的 专 化 型 17 据 报 道 引 起 瓜 类 枯 萎 病 的 致 病 菌 至 少 存 在8 个 专 化 型 18 笔 者 对 采 集 到 的 甘 肃 省 武 威 地 区 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 进 行 病 原 菌 的 分 离 纯 化 和 鉴 定 结 合 菌 落 形 态 特 征 显 微 特 征 及ITS 分 子 鉴 定 结 果 对 病 原 菌 进 行 鉴 定 确 定 引 起 甘 肃 省 武 威 地 区 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 为 尖 孢 镰 孢 菌 F oxysporum 病 原 菌 的 生 物 学 特 性 研 究 是 病 原 菌 的 基 础 研 究 尤 其 为 抗 病 育 种 和 生 物 防 治 研 究 提 供 理 论 依 据 本 研 究 结 果 表 明 该 菌 在10 35 范 围 内 均 能 生 长 产 孢 25 为 最 适 生 长 温 度 菌 丝 生 长 最 佳 的 光 照 条 件 为12h 光 暗 交 替 最 适 碳 源 为 淀 粉 这 与 沈 文 渊 19 报 道 的 尖 孢 镰 孢 菌 黄 瓜 专 化 型 尖 孢 镰 孢 菌 冬 瓜 专 化 型 尖 孢 镰 孢 菌 西 瓜 专 化 型 尖 孢 镰 孢 菌 苦 瓜 专 化 型 的 最 适 温 度 光 照 和 碳 源 的 研 究 结 果 相 似 根 据 肖 昌 华 等 20 的 报 道 苦 瓜 枯 萎 病 病 原 菌 的 生 长 最 适 pH 为 6 3 产 孢 最 适 pH 为 6 3 8 5 而 本 试 验 中 病 原 菌 菌 丝 生 长 及 产 孢 最 适 pH 为 8 分 析 原 因 可 能 是 因 为 不 同 的 专 化 型 菌 对 生 长 所 需 的 酸 碱 度 不 同 以 及 病 原 菌 分 离 地 的 土 壤 酸 碱 度 有 关 但 在 总 体 上 来 看 尖 孢 镰 孢 菌 适 合 在 中 性 及 偏 碱 性 条 件 下 生 长 在 沈 文 渊 19 的 报 道 中4 种 尖 孢 镰 孢 菌 专 化 型 的 最 适 氮 源 都 为 蛋 白 胨 而 本 试 验 中 病 原 菌 生 产 速 率 最 好 的 氮 源 为 硝 酸 钠 和 尿 素 产 孢 量 最 多 的 是 牛 肉 浸 膏 分 析 原 因 可 能 是 因 为 不 同 专 化 型 菌 之 间 存 在 着 对 氮 源 的 利 用 有 一 定 的 差 异 同 时 说 明 该 菌 在 菌 丝 的 生 长 和 产 孢 过 程 中 不 同 的 氮 源 起 着不同的作用 笔 者 鉴 定 了 甘 肃 省 武 威 地 区 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 为 尖 孢 镰 孢 菌 F oxysporum 并 对 其 生 物 学 特 性 进 行 了 测 定 但 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 原 菌 是 否 存 在 专 化 型 以 及 该 病 原 菌 的 传 播 途 径 等 问 题 有 待 于进一步研究 表2 光 照 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 丝 生 长 及 产 孢 量 的 影 响 光照条件 持续光照 持续黑暗 12h 光暗交替 菌丝生长速率 cm d 1 1 53b 1 16c 1 59a 产孢量 10 6 个 mL 1 4 51c 7 15b 9 62a 表5 不 同pH 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 丝 生 长 及 产 孢 量 的 影 响 pH 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 菌丝生长速率 cm d 1 0 59c 0 64b 0 78b 0 81a 0 66b 产孢量 10 6 个 mL 1 1 28d 1 55c 1 90b 2 56a 1 55c 李金峰 表3 不 同 碳 源 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 丝 生 长 及 产 孢 量 的 影 响 碳源 CK 蔗糖 葡萄糖 麦芽糖 淀粉 乳糖 甘露醇 菌丝生长速率 cm d 1 0 55f 0 94d 0 72e 1 06cd 1 21a 1 10ab 1 09bc 产孢量 10 6 个 mL 1 0 45c 2 80b 2 75b 3 00b 3 70a 3 15ab 3 00b 表4 不 同 氮 源 对 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 丝 生 长 及 产 孢 量 的 影 响 氮源 CK 尿素 硫酸铵 硝酸铵 氯化铵 牛肉浸膏 硝酸钠 菌丝生长速率 cm d 1 0 88b 1 09a 0 40e 0 69d 0 56e 0 77c 1 07a 产孢量 10 6 个 mL 1 0 00e 1 32d 1 37d 1 36d 3 75b 6 63a 1 90c 27 中 国 瓜 菜 第33 卷 试验研究 参考文献 1 TEPPNER H Cucurbita pepo Cucurbitaceae history seed coat types thin coated seeds and their genetics J PHYTON AnnalesReiBotanicae 2000 40 1 1 42 2 邹 伶 威 李 柱 刚 韩 俊 岩 等 裸 仁 南 瓜 研 究 进 展 概 述 J 中 国瓜菜 2012 25 6 42 44 3 BEZOLDTN MATHEWS D LOYB J et al Molecular anal ysis of the hull less seed trait in pumpkin expression profiles of genes related to seed coat development J Seed Science Research 2005 15 205 217 4 王 拱 辰 叶 琪 铭 镰 刀 菌 在 生 物 防 治 中 的 作 用 J 生 物 防 治 通报 1990 6 2 80 84 5 王 萍 肖 艳 曾 敬 富 等 瓜 类 枯 萎 病 的 识 别 与 诊 断 及 综 合 防 控技术初报 J 现代园艺 2010 2 46 48 6 南 宇 航 朱 子 成 王 学 征 等 甜 瓜 种 质 资 源 苗 期 对 枯 萎 病 和 白粉病的抗性评价 J 中国蔬菜 2016 35 1 37 44 7 周 小 林 陈 功 友 邵 元 建 等 甜 瓜 枯 萎 病 菌 Fusarium oxysporum 专 化 型 的 初 步 研 究 J 植 物 保 护 2008 34 6 80 84 8 徐 彦 刚 贺 振 李 瑞 等 黄 瓜 枯 萎 病 研 究 进 展 J 中 国 瓜 菜 2018 31 6 1 6 9 吕 佩 珂 李 明 远 吴 钜 文 等 中 国 蔬 菜 病 虫 原 色 图 谱 M 北 京 农业出版社 1992 10 董 鲜 马 晓 惠 陈 传 娇 等 三 七 根 腐 病 尖 孢 镰 刀 菌 分 离 鉴 定 及致病作用研究 J 中药材 2018 41 1 8 12 11 LESLIE J F SUMMERELL B A The Fusarium laboratory manual M Ames IA USA BlackwellPub 2006 12 郭 炜 西 北 地 区 冬 小 麦 普 通 根 腐 病 和 茎 基 腐 病 病 原 鉴 定 及 种 质资源抗性筛选 D 兰州 甘肃农业大学 2018 13 周 慧 敏 谢 学 文 石 延 霞 等 大 白 菜 褐 腐 病 茎 基 腐 病 的 病 原菌鉴定 J 中国蔬菜 2012 31 22 70 74 14 杨 克 泽 南 瓜 叶 枯 病 病 原 菌 鉴 定 及 品 种 抗 病 性 研 究 论 文 D 兰州 甘肃农业大学 2009 15 MUSHTAQ M Pathogenecity and transmission studies of seed borne Fusarium species sec Liseola and Sporo trich iella in sunflower J Pakistan Journal of Botany 2006 38 2 487 492 16 张 宏 宇 陈 霞 左 洪 波 等 中 国 现 行 推 广 黄 瓜 品 种 及 种 质 资 源 对 枯 萎 病 的 抗 病 性 评 价 J 东 北 农 业 大 学 学 报 2010 41 5 36 41 17 胡 海 娇 魏 庆 镇 王 五 宏 等 茄 子 枯 萎 病 研 究 进 展 J 分 子 植物育种 2018 16 8 2630 2637 18 符 冬 妹 陈 汉 清 郭 素 霞 等 香 蕉 枯 萎 镰 刀 菌 致 病 性 快 速 测 定 方 法 的 建 立 J 基 因 组 学 与 应 用 生 物 学 2015 34 2 408 416 19 沈 文 渊 瓜 类 枯 萎 病 菌 四 种 专 化 型 的 生 物 学 特 性 及 瓜 类 枯 萎 病生物防治研究 D 成都 四川农业大学 2012 20 肖 昌 华 余 席 茂 何 玉 英 等 苦 瓜 枯 萎 病 的 生 物 学 特 性 研 究 J 植物保护 2008 34 2 83 85 28