辣椒种子拮抗青枯病菌内生细菌的分离、鉴定.pdf

中 中 国 国 瓜 瓜 菜 菜 2020 33 2 42 47 试验研究 收 稿 日 期 2019 10 29 修 回 日 期 2019 12 11 基 金 项 目 贵 州 省 农 科 院 专 项 黔 农 科 院 院 专 项 2015 25 作 者 简 介 牟 玉 梅 女 助 理 研 究 员 主 要 从 事 辣 椒 育 种 与 栽 培 研 究 工 作 E mail gzzymymei 通 信 作 者 范 高 领 男 助 理 研 究 员 主 要 从 事 园 艺 作 物 栽 培 与 育 种 研 究 E mail fan gaoling 辣 椒 种 子 拮 抗 青 枯 病 菌 内 生 细 菌 的 分 离 鉴 定 牟 玉 梅 范 高 领 邢 丹 贵州省农业科学院辣椒研究所 贵阳 550006 摘 要 为 了 探 究 抗 青 枯 病 辣 椒 品 种 种 子 中 拮 抗 青 枯 病 菌 内 生 细 菌 的 种 群 组 成 及 其 在 青 枯 病 防 治 中 可 能 发 挥 的 生 态 学 功 能 从 抗 青 枯 病 辣 椒 品 种 种 子 中 分 离 筛 选 出 拮 抗 青 枯 病 菌 的 内 生 细 菌 对 其 进 行 抑 菌 广 谱 性 分 析 测 定 其 对 青 枯 病 的 生 防 效 果 结 果 表 明 从 抗 青 枯 病 辣 椒 品 种 种 子 中 分 离 出14 株 内 生 细 菌 通 过 平 板 对 峙 筛 选 出6 株 拮 抗 青 枯 病 菌 的 内 生 细 菌 初 步 鉴 定 它 们 分 别 为 假 单 胞 菌 Pseudomonas 苍 白 杆 菌 Ochrobactrum 和 微 杆 菌 Microbac terium 对6 株 内 生 细 菌 进 行 抑 菌 广 谱 性 研 究 所 有 内 生 细 菌 均 至 少 对1 种 病 原 真 菌 有 拮 抗 作 用 将6 株 内 生 细 菌 的 菌 悬 液 分 别 对 辣 椒 种 子 进 行 浸 种 处 理 后 育 苗 辣 椒 苗 抗 青 枯 病 能 力 显 著 提 升 辣 椒 种 子 中 拮 抗 青 枯 病 菌 的 内 生 细 菌 具 有 多 样 性 用 其 菌 悬 液 处 理 辣 椒 种 子 后 植 株 对 青 枯 病 具 有 较 好 的 抗 病 能 力 为 开 展 辣 椒 青 枯 病 微 生 物 防 治 提供了理论依据及菌种资源 关键词 辣椒 种子 内生细菌 拮抗作用 生物防治 中图分类号 S641 3 文献标志码 A 文章编号 1673 2871 2020 02 042 06 Isolation and identification of endophytic bacteria against bacterial wilt inpepperseeds MOUYumei FANGaoling XINGDan PepperResearchInstitute GuizhouAcademy of Agricultural Sciences Guizhou550006 Guiyang China Abstract This experiment is to investigate the population composition of antagonistic endophytic bacteria and its potential ecological function in the prevention and treatment of green dead pepper varieties To isolate and screen the endophytic bacteria that antagonize the green dead bacteria from the seeds of pepper varieties with anti green dead disease and to analyze their antimicrobial spectrum to determine their effect on the prevention of green dead disease Fourteen strains of endophytic bacteria were isolated from the seeds of capsicum varieties resistant to bacterial wilt Six strains of endophytic bacteria were screened out through plate confrontation They were identified as Pseudomonas Pallidobacterium and Microbacterium Six strains of endophytic bacteria were studied for broad spectrum bacteriostasis Allendophyticbacteriahadantagonisticeffectonatleastonekindofpathogenicfungi Sixstrainsofendophyticbacteria were soaked in pepper seeds and then cultured The ability of pepper seedlings to resist bacterial wilt was significantly improved Theendophyticbacteriathatantagonizegreenpepperbacteriainpepperseedsarediverse Aftertreatingpepper seeds with their suspension the plants have a good effect on green dead disease and provide theoretical basis and bacterialresourcesforthepreventionandtreatmentofpeppergreendeaddisease Keywords Pepper Seeds Endophyticbacteria Antagonisticeffect Biologicalcontrol 辣 椒 是 我 国 种 植 面 积 最 大 的 蔬 菜 作 物 1 辣 椒 青 枯 病 是 我 国 各 辣 椒 主 产 区 普 遍 发 生 的 一 种 毁 灭 性 土 传 病 害 防 治 难 度 较 大 2 采 用 常 规 方 法 选 育 抗 病 品 种 存 在 选 育 周 期 长 抗 性 单 一 的 缺 点 采 用 分 子 育 种 技 术 其 过 程 非 常 复 杂 且 在 辣 椒 育 种 中 成 功 应 用 的 还 不 多 3 采 用 化 学 药 剂 又 涉 及 到 食 品 安 全 性 和 环 境 安 全 性 安 全 评 价 问 题 内 生 菌 生 物 防 治 可 以 较 好 地 解 决 上 述 问 题 4 不 仅 可 以 促 进 作 物 生 长 增 产 增 收 还 可 以 提 高 植 物 抗 病 性 改 善 品 质 以 及 改 良 土 壤 国 内 外 科 研 人 员 针 对 辣 椒 青 枯 病 生 物 防 治 做 了 不 少 研 究 筛 选 了 很 多 新 的 防 控 辣 椒 青 枯 病 的 生 防 菌 但 还 没 有 发 现 一 个 成 功 应 用 于 大 批 量 生 产 和 推 广 且 能 较 好 防 治 辣 椒 青 枯 病 的 生 防菌 42 第2 期 等 辣椒种子拮抗青枯病菌内生细菌的分离 鉴定 试验研究 牟玉梅 内 生 菌 是 一 类 生 活 在 植 物 体 内 且 对 植 物 无 明 显 不 利 影 响 的 微 生 物 的 总 称 5 植 物 携 带 丰 富 的 内 生 菌 资 源 这 些 微 生 物 对 植 物 的 生 长 发 育 代 谢 过 程 和 抗 逆 抗 病 等 性 状 产 生 重 要 影 响 种 子 作 为 植 物 物 种 延 续 的 重 要 繁 殖 器 官 是 植 物 内 生 菌 垂 直 传 播 的 重 要 方 式 种 子 内 生 菌 与 植 物 经 过 长 期 稳 定 的 进 化 选 择 相 比 于 从 其 他 植 物 器 官 中 分 离 的 内 生 菌 更 易 长 期 定 殖 生 存 也 更 易 演 化 出 与 宿 主 互 惠 互 利 的 代 谢 途 径 6 种 子 中 的 内 生 菌 防 效 具 有 较 为 稳 定 持 久 的 优 点 可 作 为 拮 抗 菌 剂 的 菌 种 资 源 具 有 很好的应用前景 因 此 笔 者 以 抗 青 枯 病 辣 椒 品 种 的 种 子 为 材 料 从 中 分 离 筛 选 出 对 辣 椒 青 枯 病 菌 有 较 强 拮 抗 作 用 的 内 生 菌 株 并 鉴 定 其 分 类 地 位 开 展 抑 菌 广 谱 性 研 究 以 期 丰 富 现 有 的 生 防 菌 种 资 源 为 辣 椒 种 子 内 生 细 菌 及 其 生 物 防 治 的 研 究 提 供 一 定 的 理 论 基础 1 材料与方法 1 1 材料 优 质 地 方 辣 椒 种 质 资 源 18 份 由 贵 州 省 辣 椒 研 究 所 在 多 年 连 作 重 茬 的 辣 椒 地 自 然 诱 发 筛 选 出 的 具 有 较 好 综 合 抗 病 性 的 辣 椒 种 质 青 枯 病 菌 为 贵 州 省 农 业 科 学 院 辣 椒 研 究 所 保 存 的 茄 科 雷 尔 氏 菌 株 EP1 登 录 号 CP015116 1 培 养 基 为 NA 固 体培养基 NA 液体培养基 固体LB 培养基 1 2 方法 1 2 1 辣 椒 抗 青 枯 病 品 种 筛 选 鉴 定 对18 份 地 方 优 质 辣 椒 种 质 资 源 进 行 苗 期 青 枯 病 抗 性 表 型 鉴 定 进 一 步 确 认 材 料 抗 性 水 平 2016 年10 月 在 贵 州 省 辣 椒 研 究 所 贵 阳 试 验 基 地 进 行 将 供 试 材 料 采 用 160 穴 漂 浮 育 苗 盘 进 行 育 苗 每 个 品 种 育 苗160 株 待 幼 苗 长 至5 6 片 真 叶 时 选 择 健 壮 的 植 株 移 栽 至 10cm 10cm 的 塑 料 杯 内 数 量 在70 106 株 之 间 完 全 随 机 排 列 置 于 26 2 人 工 气 候 室 继 续 生 长 正 常 肥 水 管 理 待 长 到 7 8 片 叶 期 采 用 伤 根 灌 根 接 种 法 接 种 青 枯 病 菌 进 一 步 筛 选 高 抗 辣 椒 青 枯 病品种 青 枯 病 病 情 调 查 方 法 接 种 后 每 天 调 査 和 记 录 辣 椒 植 株 的 发 病 情 况 待 病 情 稳 定 后 按 病 情 分 级 标 准 统 计 发 病 情 况 计 算 发 病 率 和 病 情 指 数 参 试 各 种 质 对 青 枯 病 的 抗 性 表 型 最 终 评 价 以 第30 天 的 发 病 率 和 病 情 为 准 青 枯 病 病 情 分 级 标 准 参 照 刘 富 中 7 党 峰 峰 8 等 对 青 枯 病 的 分 级 标 准 表1 2 发 病 率 发 病 株 数 接 种 株 数 l00 病 情 指 数 DI 病 级 该 病 级 株 数 最 髙 病 级 接 种 株数 l00 1 2 2 辣 椒 种 子 内 生 细 菌 的 分 离 纯 化 保 存 种 子 消 毒 将 辣 椒 种 子 在 70 酒 精 中 浸 泡 5 min 0 1 升 汞 消 毒40s 然 后 转 入 到 体 积 分 数2 5 的 次 氯 酸 钠 溶 液 中 浸 泡5min 最 后 用 无 菌 水 冲 洗3 次 将 最 后 一 次 冲 洗 用 的 无 菌 水 涂 布 分 离 培 养 基 营 养 琼脂平板 置于30 培养3d 验证表面消毒情况 内 生 细 菌 分 离 纯 化 保 存 将 彻 底 消 毒 后 的 种 子置于无 菌研钵中 加入质量 分数0 85 的NaCl 溶 液 充 分 研 磨 后 吸 取1mL 上 清 液 进 行 梯 度 稀 释 营 养 琼 脂 平 板 涂 布 30 培 养 箱 内 培 养2d 挑 取 不 同 形 态 颜 色 大 小 的 菌 落 划 线 纯 化3 次 直 到 平 板 上 菌 落 的 颜 色 大 小 和 形 态 完 全 一 致 然 后 将 纯 化 后 的 菌 株 保 存 在 含 有 20 甘 油 的 菌 种 保 藏 管 中 80 冻存 1 2 3 内 生 细 菌 对 青 枯 病 菌 的 抑 制 作 用 测 定 采 用 纸 蝶 法 测 定 内 生 细 菌 对 青 枯 病 菌 的 抑 制 作 用 筛 选 对 青 枯 病 菌 具 有 拮 抗 作 用 的 内 生 细 菌 吸 取1mL 浓 度 为 5 l0 8 cfu mL 1 的 青 枯 病 菌 悬 浮 液 放 入 灭 菌 培养皿中 将45 NA 培养基倒入 培养皿中与 菌液 摇 匀 待 冷 却 后 对 称 放 置2 张5mm 灭 菌 滤 纸 片 距 离 培 养 皿 中 心 距 离 约 为25mm 每 张 滤 纸 片 上 滴 入 内 生 细 菌5 L 每 处 理 重 复3 皿 以 无 菌 水 为 对 照 置 于 28 30 恒 温 箱 中 培 养 48 h 观 察 抑 菌 效 果 拮 抗 作 用 强 弱 以 表 示 表 示 拮 抗 活 性 很 强 抑 菌 带 宽 度 大 于8 0mm 表 示 拮 抗 活 性 中 等 强 度 抑 菌 带 宽 度 在3 0 8 0mm 之 间 表 示 拮 病情级别 0 1 2 3 4 5 植株地上部分症状 植株表现正常 植株有1 片叶出现萎蔫 植株有2 3 片叶出现萎蔫 除顶端1 2 片叶外 其他叶片全部萎蔫 除生长点外 其他叶片全部萎蔫 植株整株发生枯萎 或者植株死亡 表1 辣椒青枯病病情分级 表2 辣椒青枯病的抗性评价标准 病情指数 0 DI 15 15 DI 30 30 DI 45 45 DI 60 60 DI 100 抗性水平 高抗 HR 抗病 R 中抗 MR 感病 S 高感 HS 43 中 国 瓜 菜 第33 卷 试验研究 抗 活 性 弱 或 无 活 性 抑 菌 带 宽 度 小 于3 0mm 或 者 无抑菌带 病菌正常生长 且可覆盖内生细菌 1 2 4 拮 抗 青 枯 病 菌 内 生 细 菌 的 鉴 定 对 青 枯 病 菌 具 有 拮 抗 作 用 的 内 生 细 菌 进 行 形 态 学 和 分 子 生 物学鉴定 形 态 学 鉴 定 在 固 体 LB 培 养 基 上 划 线 接 种 待 鉴 定 菌 株 28 恒 温 培 养24h 记 录 菌 落 的 颜 色 形 状 透 明 度 以 及 表 面 边 缘 隆 起 程 度 等 性 状 对 细 菌 进 行 革 兰 氏 染 色 和 形 态 观 察 对 种 属 进 行 初 步 鉴 定 分 子 生 物 学 鉴 定 对 菌 株 16S rDNA 序 列 进 行 测 定 使 用 细 菌 基 因 提 取 试 剂 盒 进 行 基 因 组DNA 提 取 以 提 取 的 待 鉴 定 菌 株 DNA 为 模 板 以 细 菌 的 16S 引 物 序 列 27f 1492 进 行 内 生 细 菌 的 16S rDNA 扩 增 PCR 以30 L 的 体 系 进 行 体 系 如 下 H2O17 8 L Buffer3 L dNTP2 L Primer13 L Primer2 3 L DNA 模 板 1 L 酶 0 2 L PCR 反 应 条 件 为 95 预 变 性3min 循 环1 次 95 变 性 30 s 55 退 火 30 s 72 延 伸 2 min 循 环 35 次 最 后 72 延 伸 10 min 用 1 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 PCR 扩 增 结 果 利 用 凝 胶 成 像 系 统 观 察 PCR 扩 增 结 果 将 辣 椒 种 子 内 生 细 菌PCR 扩 增 结 果 送 往 北 京 六 合 华 大 基 因 科 技 有 限 公 司 武 汉 分 公 司 进 行 分 子 鉴 定 将 菌 株 的 测 序 结 果 与GenBank 数 据 库 中的序列进行比对 1 2 5 拮 抗 青 枯 病 菌 内 生 细 菌 的 抑 菌 广 谱 性 研 究 对 已 筛 选 出 的 拮 抗 内 生 细 菌 采 用 平 板 对 峙 生 长 法 测 定 其 对 辣 椒 炭 疽 病 疫 病 立 枯 病 病 菌 的 拮 抗作用 将 内 生 菌 株 划 线 活 化 培 养 后 挑 取 单 菌 落 接 种 于 20 mLLB 培 养 液 中 置 于 30 摇 床 中 200 r min 1 振 荡 培 养 过 夜 辣 椒 立 枯 炭 疽 疫 病 病 原 菌 接 种 到 PDA 培 养 基 平 板 上 于28 恒 温 条 件 下 培 养 待 菌 丝长满整个培养皿后 制成5mm 的菌饼备用 在 直 径9cm 的PDA 平 板 中 央 接 入 直 径5mm 的 病 原 菌 菌 饼 视 病 原 真 菌 生 长 速 度 选 择 合 适 时 期 接 种 分 离 到 的 细 菌 炭 疽 和 立 枯 丝 核 菌 与 细 菌 同 时 接 种 疫 霉 待 菌 丝 扩 增 1 cm 后 再 接 种 待 测 细 菌 在 距 中 央 25 mm 处 对 称 放 置 2 张 5 mm 灭 菌 滤 纸 片 每 张 滤 纸 片 上 滴 入 活 化 培 养 的 分 离 菌 株 菌 液5 L 28 左 右 继 续 黑 暗 培 养 设 不 接 种 分 离 菌 株 的 处 理 为 对 照 每 个 菌 株 重 复 处 理3 皿 待 对 照 皿 中 真 菌 菌 丝 即 将 长 满 皿 时 测 量 抑 菌 圈 大 小 计 算 抑 菌 率 抑 菌 率 1 处理菌落直径 对照菌落直径 100 9 1 2 6 内 生 细 菌 对 辣 椒 青 枯 病 生 物 防 治 效 果 的 测 定 将 辣 椒 种 子 置 于 浓 度 为10 9 cfu mL 1 内 生 细 菌 菌 悬 液 中 浸 泡 4 h 无 菌 水 冲 洗 3 次 后 进 行 漂 浮 育 苗 待 幼 苗 长 至 5 6 片 真 叶 从 育 苗 盘 中 选 取 健 壮 植 株 拔 出 洗 净 根 部 分 别 浸 泡 在 对 应 的 菌 株 菌 悬 液 中20min 以LB 培 养 液 替 代 菌 悬 液 浸 泡 作 为 对 照 每 处 理6 8 株 3 次 重 复 采 用 伤 根 灌 根 接 种 法 接 种 青 枯 病 菌 观 察 记 录 发 病 情 况 计 算 相 对 防 效 相 对 防 效 BE CK 的 病 情 指 数 试 验 处 理 的病情指数 CK 病情指数 100 1 3 数据分析 利 用 软 件 DPS 7 05 进 行 方 差 分 析 利 用 Excel 2007 进行常规数据及表格处理 2 结果与分析 2 1 抗青枯病辣椒种子样品的筛选 通 过 苗 期 青 枯 病 抗 性 鉴 定 从 抗 性 表 现 良 好 的 18 份 辣 椒 种 质 资 源 中 筛 选 出 对 青 枯 病 抗 性 最 好 最 稳 定 的 辣 椒 种 质 资 源 2 份 试 验 序 号 为 7 号 8 号 将其种子作为本次试验的样品材料 表3 2 2 辣椒种子内生细菌的分离纯化 将 上 述 抗 性 最 佳 的 2 份 抗 青 枯 病 辣 椒 种 子 经 外 表 消 毒 杀 菌 后 混 合 研 磨 成 浆 在 培 养 基 中 进 行 培 养 分 离 纯 化 获 得 14 株 内 生 细 菌 编 号 为 gz1 gz14 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 接种 株数 90 90 74 94 72 82 70 80 74 90 92 80 94 106 84 90 82 88 发病率 22 22 57 78 24 32 72 34 22 22 34 15 17 14 10 00 21 62 33 33 60 87 30 00 57 45 69 81 35 71 31 11 36 59 25 00 枯死率 20 00 44 44 18 92 55 32 22 22 26 83 11 43 2 50 8 11 22 22 54 35 15 00 44 68 54 72 28 57 22 22 21 95 15 91 褐变率 28 57 53 33 24 32 65 96 22 22 34 15 14 29 10 00 13 51 33 33 54 35 25 00 51 06 64 15 35 71 31 11 29 27 25 00 病情指数 21 67 53 33 22 97 65 96 22 22 32 32 15 00 8 13 16 22 30 56 57 61 25 00 52 13 64 62 33 93 28 89 31 10 22 73 抗性 评价 R S R HS R MR HR HR R MR S R S HS MR R MR R 表3 辣椒种质对青枯病苗期抗性表型 44 第2 期 等 辣椒种子拮抗青枯病菌内生细菌的分离 鉴定 试验研究 牟玉梅 2 3 拮抗青枯病菌内生细菌的筛选 将 获 取 的14 株 内 生 细 菌 与 青 枯 病 菌 进 行 平 板 对 峙 6 株 内 生 细 菌 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 对 青 枯 病 菌 有 拮 抗 作 用 表 4 其 中 菌 株 gz6 gz7 gz11 gz13 对 辣 椒 青 枯 病 菌 的 抑 菌 圈 直 径 25 mm 抑 菌 带 宽 度 8mm 表 现 拮 抗 活 性 很 强 抑 菌 作 用 强 度 为 菌 株 gz13 对 辣 椒 青 枯 病 菌 的 抑 菌 圈 直 径 达 到 42 22 mm 抑 菌 带 宽 度 达 到 15 60 mm 对 辣 椒 青 枯 病 菌 表 现 出 很 强 的 拮 抗 活 性 图1 2 4 拮抗青枯病菌内生细菌的鉴定 对 筛 选 出 的 对 青 枯 病 菌 具 有 拮 抗 作 用 的 6 株 内生细菌 进行形态学和分子生物学方法鉴定 形 态 学 鉴 定 gz1 菌 落 呈 圆 形 光 滑 微 凸 边 缘 整 齐 湿 润 菌 落 颜 色 为 无 色 革 兰 氏 染 色 结 果 为 阴 性 菌 体 呈 杆 状 gz6 菌 落 边 缘 光 滑 凸 起 呈 脓 液 状 菌 落 颜 色 为 浅 灰 绿 色 革 兰 氏 染 色 结 果 为 阴 性 菌 体 呈 球 杆 状 gz7 菌 落 边 缘 光 滑 微 凸 呈 脓 液 状 菌 落 颜 色 为 绿 色 革 兰 氏 染 色 结 果 为 阴 性 菌 体 呈 杆 状 或 长 丝 状 图1 A gz11 菌 落 多 呈 圆 形 边 缘 光 滑 整 齐 微 凸 湿 润 菌 落 颜 色 为 无 色 革 兰 氏 染 色 结 果 为 阴 性 菌 体 呈 杆 状 或 丝 状 gz13 菌 落 表 面 光 滑 半 透 明 边 缘 整 齐 有 光 泽 菌 落 颜 色 为 淡 黄 色 革 兰 氏 染 色 结 果 为 阳 性 细 胞 呈 球 状 或 细 长 不规则的杆 状 图1 B gz14 菌落边缘光 滑 微凸 呈 脓 液 状 菌 落 颜 色 为 浅 绿 色 革 兰 氏 染 色 结 果 为 阴性 菌体呈球杆状 分 子 生 物 学 鉴 定 6 株 内 生 细 菌 的 16S rDNA PCR 产 物 均 在750bp 左 右 条 带 清 晰 将6 株 内 生 细 菌 的 16S rDNA 序 列 与 GenBank 数 据 库 中 的 序 列 进 行 比 对 找 到 了 同 源 性 高 的 相 似 菌 株 序 列 结 果 为 3 株 属 于 或 与 黏 液 型 铜 绿 假 单 胞 菌 最 相 似 属 于 变 形 菌 门 变 形 菌 纲 假 单 胞 菌 目 假 单 胞 菌 科 假 单 胞 菌 属 2 株 属 于 或 与 苍 白 杆 菌 最 相 似 属 于 变 形 菌 门 变 形 菌 纲 根 瘤 菌 目 布 鲁 氏 菌 科 苍 白 杆 菌 属 1 株 属 于 或 与 微 杆 菌 最 相 似 属 于 放 线 菌 门 微杆菌科 微杆菌属 表5 结 合 形 态 学 和 16S rDNA 序 列 同 源 性 分 析 将 菌 株 gz6 gz7 gz14 鉴 定 为 黏 液 型 铜 绿 假 单 胞 菌 Pseudomonas aeruginosa 菌 株 gz1 gz11 鉴 定 为 苍 白 杆 菌 Ochrobactrum 菌 株gz13 鉴 定 为 微 杆 菌 Microbacterium 2 5 内生细菌抑菌广谱性测定 由 表 6 可 知 6 株 内 生 细 菌 均 至 少 对 其 中 一 种 病 原 真 菌 有 拮 抗 作 用 其 中 有3 株 内 生 细 菌 gz6 gz7 gz14 对3 种 植 物 病 原 真 菌 均 有 拮 抗 作 用 有2 株 内 生 细 菌 gz11 gz13 对2 种 植 物 病 原 菌 有 抑 制 作用 有1 株内生细 菌 gz1 只对1 种植物病 原菌有 抑 制 作 用 总 体 而 言 大 部 分 内 生 细 菌 对 立 枯 丝 核 病 菌 辣 椒 炭 疽 病 菌 拮 抗 作 用 强 gz6 gz7 gz14 对 辣 椒 疫 霉 菌 立 枯 丝 核 病 菌 炭 疽 病 菌 均 有 较 好 抑 制 作 用 且 对 辣 椒 青 枯 病 菌 也 有 很 明 显 的 抑 制 作 菌株 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 抑菌圈直径 mm 16 79 0 38d 32 55 1 17b 28 59 6 13bc 29 94 0 36bc 42 22 2 74a 25 63 2 76c 抑菌带宽度 mm 3 70 0 38d 10 30 0 42b 8 39 1 29c 9 00 0 67bc 15 60 0 92a 7 91 0 79c 抑菌作用强度 B 表4 辣椒种子内生细菌对青枯病菌的抑制作用 注 A gz7 B gz13 图1 拮抗菌对辣椒青枯病菌的抑制作用 A 45 中 国 瓜 菜 第33 卷 试验研究 图2 内生细菌菌株抑菌带宽与温室辣椒青枯病防效的关系 用 具 有 广 谱 抑 菌 性 可 作 为 有 应 用 前 景 的 生 物 资 源加以研究 2 6 内生细菌对辣椒青枯病的生防效果 对 6 株 内 生 细 菌 进 行 辣 椒 青 枯 病 的 温 室 控 病 试 验 表 7 结 果 表 明 均 具 有 不 同 程 度 的 生 防 效 果 6 株 内 生 细 菌 菌 株 处 理 后 的 辣 椒 植 株 发 病 率 病 情 指 数 均 低 于 对 照 接 种28d 时 仍 有5 株 株 菌 具 有 较 明 显 的 相 对 防 效 其 中 相 对 防 效 大 于 60 的 有 3 株 分 别 是 gz7 gz11 gz14 相 对 防 效 介 于 30 60 的 有2 株 从 大 到 小 依 次 为gz13 gz6 且 有5 株株菌能使辣椒推迟发病 将 内 生 细 菌 对 青 枯 病 菌 的 抑 菌 带 宽 与 它 们 对 表5 基于16SrDNA 基因序列分析的辣椒种子内生菌鉴定结果 序号 1 2 3 4 5 6 菌株 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 NCBI 数据库中最相似的菌种及中文名 苍白杆菌Ochrobactrumsp strainSZ036 黏液型铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosastrainCAU342A 黏液型铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosastrainD 1 苍白杆菌Ochrobactrumsp CRRI29 微杆菌Microbacteriumsp HBUM178620 黏液型铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosastrainWZ029 分类鉴定 苍白杆菌 假单胞菌 假单胞菌 苍白杆菌 微杆菌 假单胞菌 菌株 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 疫霉病菌 病菌直径 mm 28 75 1 16a 26 18 1 85b 29 99 2 61a 抑菌率 67 70 1 30b 70 59 2 08a 66 30 2 94b 立枯丝核病菌 病菌直径 mm 51 01 5 02a 16 08 2 00c 14 55 3 38c 14 39 7 47c 26 33 5 88b 10 92 2 63c 抑菌率 42 69 5 64c 81 94 2 24a 83 66 3 80a 83 83 8 33a 70 42 6 61b 87 74 2 95a 炭疽病菌 病菌直径 mm 14 33 1 77ab 11 60 2 32bc 10 00 4 43c 17 17 1 67a 18 33 3 94a 抑菌率 83 90 1 99bc 86 97 2 61ab 88 76 4 98a 80 71 1 88c 79 40 4 43c 表6 内生菌对辣椒疫霉菌 立枯丝核病菌 炭疽病菌的拮抗作用 表7 温室盆栽试验辣椒青枯病初测结果 菌株 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 CK 初始发 病时间 d 6 4 10 10 7 12 5 发病率 7d 25 00 8 09b 10 00 7 36bc 0 00 0 00c 0 00 0 00c 5 00 7 86c 0 00 0 00c 80 00 13 47a 15d 70 00 14 68ab 50 00 23 19bc 9 52 13 47d 20 00 13 47cd 35 00 27 58bcd 12 50 16 84cd 100 00 0 00a 25d 95 00 6 73ab 65 00 24 28abc 28 57 0 00c 25 00 5 61c 50 00 35 63bc 50 00 26 94abc 100 00 0 00a 病情指数 7d 8 00 2 50b 9 00 6 52b 0 00 0 00b 0 00 0 00b 1 00 1 57b 0 00 0 00b 31 00 8 67a 15d 51 00 7 50b 34 00 17 51bc 4 76 6 73c 13 00 9 43c 20 00 15 37bc 7 50 22 93c 80 00 5 06a 25d 83 00 8 44a 53 00 24 92ab 20 95 5 39b 24 00 7 18b 43 00 35 62ab 28 75 34 29ab 90 00 6 73a 相对防效 7d 74 19 0 79b 70 97 20 79b 100 00 0 00a 100 00 0 00a 96 77 5 89a 100 00 0 00a 15d 36 25 6 01b 57 50 25 56ab 94 05 9 18a 83 75 11 72a 75 00 20 69ab 90 63 31 39ab 25d 7 78 15 00b 41 11 34 46a 76 72 5 12a 73 33 6 43a 52 22 35 07a 68 06 30 16a 抑 菌 圈 直 径 mm 相 对 防 效 菌 株 编 号 50 00 40 00 30 00 20 00 10 0 0 00 100 00 80 00 60 00 40 00 20 00 0 00 相 对 防 效 抑 菌 圈 直 径 mm gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 46 第2 期 等 辣椒种子拮抗青枯病菌内生细菌的分离 鉴定 试验研究 牟玉梅 辣 椒 青 枯 病 的 温 室 控 病 效 果 相 比 较 从 图2 可 以 看 出 随 着 抑 菌 带 宽 度 的 增 加 相 对 防 病 效 果 并 没 有 完 全 呈 现 增 加 趋 势 可 能 是 因 为 种 子 浸 种 后 部 分 内 生 菌 株 的 定 殖 效 果 不 好 或 者 菌 株 生 长 环 境 的 变 化 导 致 其 不 能 正 常 发 挥 抑 菌 功 效 因 此 在 应 用 这 些菌株前 仍然需要进行大量的验证试验 3 讨论与结论 在 已 有 拮 抗 青 枯 病 菌 内 生 细 菌 的 筛 选 及 其 对 青 枯 病 生 物 防 治 的 研 究 报 道 中 拮 抗 内 生 细 菌 大 部 分 是 从 植 株 根 茎 叶 等 部 位 分 离 的 从 种 子 中 分 离 内 生 细 菌 的 研 究 较 少 且 分 离 的 对 青 枯 病 菌 具 有 抗 性 和 生 物 防 效 的 内 生 细 菌 多 为 芽 孢 杆 菌 如 刘 杰 凤 等 10 从 番 茄 辣 椒 和 茄 子3 种 茄 科 果 蔬 中 筛 选 出 的 14 株 对 青 枯 病 菌 有 强 拮 抗 性 的 内 生 细 菌 分 属 为 芽 孢 杆 菌 属 埃 希 氏 菌 属 克 雷 伯 氏 菌 属 土 壤 单 胞 菌 属 欧 文 氏 菌 属 短 小 杆 菌 属 其 中 芽 孢 杆 菌 为 优 势 种 群 而 且 芽 孢 杆 菌 属 菌 株 对 青 枯 病 菌 的 拮 抗 作 用 最 强 蔡 长 平 11 从 多 年 连 作 重 茬 的 辣 椒 地 健 康 植 株 根 系 中 分 离 的1 株 内 生 拮 抗 细 菌PEB 99 对 辣 椒 青 枯 雷 尔 氏 菌 辣 椒 疫 霉 菌 辣 椒 炭 疽 病 菌 辣 椒 镰 刀 枯 萎 病 菌 都 有 显 著 抑 制 效 果 属 于 贝 莱 斯 芽 孢 杆 菌 江 欢 欢 等 12 从 辣 椒 根 际 土 壤 中 分 离 筛 选 出1 株 对 青 枯 病 菌 具 有 较 强 拮 抗 作 用 的 菌 株4S 鉴 定 为 枯 草 芽 孢 杆 菌 孔 凡 玉 等 13 在 福 建 广 东 贵 州 等 地 感 染 青 枯 病 的 烟 株 根 部 及 番 茄 根 部 分 离 出 的 对 青 枯 病 具 有 拮 抗 作 用 的 内 生 细 菌 3 个 属 于 芽 孢 杆 菌 属 2 个属于假单胞杆菌 笔 者 从 抗 青 枯 病 辣 椒 种 子 中 分 离 出14 株 内 生 细 菌 其 中6 株 内 生 细 菌 对 青 枯 病 菌 有 较 好 的 拮 抗 作 用 结 合 形 态 学 和16SrDNA 序 列 同 源 性 分 析 对6 株 内 生 细 菌 进 行 鉴 定 发 现3 株 属 于 黏 液 型 铜 绿 假 单 胞 菌 2 株 属 于 苍 白 杆 菌 1 株 属 于 微 杆 菌 6 株 菌 株 均 具 有 生 防 效 果 其 中 菌 株gz7 gz11 gz14 对 辣 椒 青 枯 病 的 生 防 效 果 最 佳 具 有 防 治 疫 病 炭 疽 病 立 枯 病 等 多 种 病 害 的 潜 力 是 一 种 潜 在 的 有 效 的 生 防 菌 株 但 未 对 其 进 行 田 间 生 物 防 效 试 验 需 要 在 后 续 研 究 中 继 续 完 成 试 验 还 发 现 随 着 抑 菌 带 宽 度 的 增 加 内 生 细 菌 对 辣 椒 青 枯 病 的 控 病 效 果 并 没 有 完 全 呈 现 增 加 趋 势 可 能 是 因 为 种 子 浸 种 后 部 分 内 生 菌 株 的 定 殖 效 果 不 好 或 者 菌 株 生 长 环 境 的 变 化 导 致 其 不 能 正 常 发 挥 抑 菌 功 效 因 此 在 应用这些菌株前