草莓灰霉病菌拮抗放线菌的筛选及活性测定.pdf

    北方园艺（）： 研究论文第一作者简介：赵娟（），女，博士，助理研究员，研究方向为微生物资源利用与果蔬病害生物防治。：责任作者：刘伟成（），男，博士，研究员，研究方向为资源微生物及植物病害生物防治。：基金项目：北方果树病虫害绿色防控北京市重点实验室资助项 目 （）；北 京 市 科 技 计 划 资 助 项 目（，）；北京市优秀人才资助项目（）；北京市农林科学院所级创新团队资助项目（）。收稿日期：草莓灰霉病菌拮抗放线菌的筛选及活性测定赵娟，贾 卫 国，刘 伟 成，刘 德 文，张 殿 朋，卢 彩 鸽（北京市农林科学院 植物保护环境保护研究所，北京；固安县牛驼镇林城驻军生产基地，河北 廊坊）摘要：以分离自新疆古尔班通古特沙漠土壤的放线菌为试材，采用琼脂块法和生长速率法，研究了供试放线菌对草莓灰霉病菌的抑菌活性；采用形态学特征、生理生化特性、序列分析等方法对筛选出的高活性拮抗菌株进行种类鉴定。结果表明：从株放线菌中筛选出株对草莓灰霉病菌的抑菌圈直径为的高活性拮抗菌株。该菌株无菌发酵滤液对多种植物病原真菌具有明显抑制作用，抑菌率为；处理其抑菌率未见明显变化，在 范围内其抑菌活性稳定，在可见光和紫外线照射内亦保持良好的抑菌活性。拮抗菌株经鉴定为唐德链霉菌（ ）。拮抗放线菌具有广谱抑菌活性，对环境有良好的稳定性，可作为防治果蔬草莓灰霉病的生物农药潜力菌株进行开发应用。关键词：草莓灰霉病菌；唐德链霉菌；抑菌活性；发酵液稳定性中图分类号： ； 文献标识码： 文章编号：（）灰霉病是草莓开花后危害最严重的一种真菌性病害，该病害由灰葡萄孢（ ）侵染引起，主要危害果实、果梗、花瓣、叶片和叶梗，在草莓生产中严重降低了果实的产量和品质。目前生产上防治果蔬灰霉病仍以化学防治为主，虽然防治效果比较显著，但是长期大量使用化学农药造成了病原菌产生抗药性、农药残留及环境污染等系列问题。生物防治以其环境友好，成本低、无污染等特点被人们所重视，因此关于筛选和利用拮抗微生物防治果蔬灰霉病已成为研究热点。李德全等筛选到株对草莓灰霉病具有较好防治效果的枯草芽孢杆菌（）。黄静等从草莓根际土壤中分离到株解淀粉芽孢杆菌，该菌株对草莓灰霉病具有明显抑菌作用。秦晓杰等从草莓果实， ， ， ： ； ； ； 上分离筛选到株对灰霉病具有明显抑制效果的拮抗酵母菌季也蒙毕赤酵母（ ）。但由于灰霉病具有适应性强、繁殖速度快、病原菌易变异等特点，因此从实际生产中不断寻找新的不同种类的拮抗微生物资源是一项长期且重要的工作。放线菌是土壤中广泛分布的微生物，可产生抗菌活性物质和胞外水解酶从而抑制病原菌生长或溶解病原菌菌体，是具有生物农药开发潜力的微生物。孙平平等研究表明，分离自果树根际土壤的多产色链霉菌（ ）处理梨果实能显著降低梨灰霉病菌的扩展，并提高了果实的防御酶系活性。朱海云等采用平皿渗透法筛选出株对猕猴桃细菌性溃疡病具有生防潜力的内生放线菌，其中肉桂地链霉菌（ ）发酵液倍稀释处理猕猴桃植株，对猕猴桃细菌性溃疡病的防效可达。但是目前利用放线菌进行草莓灰霉病防治的研究相对较少。根据课题组前期研究发现，分离自新疆通古特沙漠土壤的可培养放线菌类群具有丰富的多样性。该研究以草莓灰霉病菌为靶标，通过琼脂块法筛选出高活性拮抗放线菌，并对其种类进行鉴定；在此基础上对该拮抗菌的抑菌谱和发酵液稳定性进行研究，以确定该菌株抑菌作用广谱性和抑菌活性成分对不同环境因素的耐受能力，为草莓灰霉病绿色防控中高效微生物农药的开发应用提供菌株资源和科学依据。 材料与方法 试验材料供试放线菌由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所生防微生物研究室分离自新疆通古特沙漠特殊生境土壤。供试靶标菌草莓灰霉病菌（ ），由该研究室分离自京郊科技园区保护地草莓发病果实。其它供试植物病原真菌包括番茄灰霉病菌（ ）、桃褐腐病菌（ ）、番茄叶霉病菌（ ）、辣椒炭疽病菌（ ）、小麦纹枯病菌 （ ）、黄瓜 枯 萎 病 菌（ ）、甘蓝枯萎病菌（ ），均由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所生防微生物研究室保存。供试培养基：病原真菌培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（）；放线菌培养采用高氏一号培养基；放线菌发酵液制备采用高氏一号液体培养基。 试验方法 放线菌分离培养采用稀释平板法分离放线菌。根据程丽娟等的方法进行土壤悬浮液的制备和梯度稀释，吸取不同浓度的悬浮液各加到高氏一号培养基（加入终浓度为的）平板上，涂布均匀后置于培养观察，后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，保存备用。 草莓灰霉病菌拮抗放线菌筛选采用琼脂块法进行草莓灰霉病菌拮抗放线菌的筛选。培养后十字交叉法测量抑菌圈直径。 拮抗菌种类鉴定）形态学观察和生理生化指标的检测。将供试拮抗菌接种于国际链霉菌计划（）指定的培养基上，培养观察菌株生长情况，记录气生菌丝、基内菌丝颜色以及可溶性色素的有无及颜色。将灭菌的盖玻片斜插入高氏一号培养基内，供试菌株划线接种于盖玻片内侧，培养取出盖玻片在倍光学显微镜下观察菌丝、孢子形态。菌株碳源利用试验与生理生化反应参照文献。）分子生物学鉴定。采用细菌基因组提取试剂盒提取供试拮抗菌基因组。细菌通用引物：和：扩增菌株序列。扩增体系：上下游引物各， （），聚合酶， ，基因组模板， 。扩增产物用的琼北方园艺月（下）脂糖凝胶电泳检测，目标条带经切胶回收纯化后，送至北京博迈德生物技术有限公司测序。对获得的序列提交数据库，并采用在网站进行序列相似性搜索。采用 软件进行多序列比对，利用 软件中法构建系统进化树。 项目测定 拮抗菌抑菌谱的测定采用生长速率法对获得的高活性菌株进行抑菌谱测定，抑菌率（）（对照菌落直径处理菌落直径）对照菌落直径。 拮抗菌活性产物稳定性的测定）对温度稳定性的测定。将供试菌株的无菌发酵滤液在、条件下，处理；在条件下，高压蒸汽灭菌处理，快速冷却。）对酸碱稳定性的测定。将供试菌株无菌发酵滤液装入离心管，用已经配好的盐酸和氢氧化钠分别调节，使各组分别为、，放置后调回至初始。）对可见光和紫外光稳定性的测定。将供试菌株无菌发酵滤液在可见光和波长为的紫外灯处，分别照射、。以上个项目均以草莓灰霉病菌为指示菌，采用生长速率法测定不同处理后无菌发酵滤液的抑菌率，每处理重复次。 数据分析采用 软件作图并对试验数据进行分析，采用软件进行差异显著性分析。 结果与分析 草莓灰霉病菌拮抗放线菌筛选采用稀释平板法从采集自新疆通古特沙漠的土样中分离纯化共得到株放线菌，又通过琼脂块法筛选到株对草莓灰霉病菌具有良好抑菌活性的放线菌，其中菌株对草莓灰霉病菌的抑菌圈直径最高，为（表），因此利用菌株进行后续试验。表供试放线菌对草莓灰霉病菌的抑菌活性  菌株编号 抑菌圈直径 菌株编号 抑菌圈直径                                     拮抗菌种类 形态学观察和生理生化特性菌株在甘油硝酸盐琼脂、淀粉琼脂、蔗糖察氏琼脂培养基上无气生菌丝，在马铃薯蔗糖琼脂、高氏一号琼脂以及、培养基上气生菌丝呈白色或白灰色，在葡萄糖天门冬素琼脂培养基上气生菌丝呈肉桂褐色；各培养基中基内菌丝浅黄色至深褐色；菌株在甘油硝酸盐琼脂、马铃薯蔗糖琼脂、淀粉琼脂、蔗糖察氏琼脂、培养基上无可溶性色素，在高氏一号、葡萄糖天门冬素琼脂、培养基上可溶性色素呈浅黄色、褐色或深褐色（表）。通过光学显微镜观察发现，在高氏一号培养基上，菌株菌丝细长、发达、不断裂、多分枝，孢子卵圆形至椭圆形，呈链状（图）。 第期北方园艺表拮抗菌在不同培养基上的培养特征 培养基气生菌丝 基内菌丝 可溶性色素 甘油硝酸盐琼脂 浅黄色 马铃薯蔗糖琼脂 白色 褐色 高氏一号琼脂白色 深褐色 褐色葡萄糖天门冬素琼脂 肉桂褐色 浅黄 浅黄色淀粉琼脂 浅黄 蔗糖察氏琼脂 浅黄 酵母膏麦芽膏琼脂 白灰色 褐色 深褐色燕麦粉琼脂白灰色 浅黄 无机盐淀粉琼脂 白灰色 浅黄 浅黄色注：箭头指菌株产生的孢子链。： 图拮抗菌菌落（）、菌丝（）及孢子链（）形态特征 （），（） （） 根据碳源利用和生理生化特性检测结果，菌株能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、甘露醇、肌醇、蔗糖，不能利用半乳糖、棉子糖；明胶液化、淀粉水解微弱，不产生类黑色素和硫化氢。 分子生物学鉴定结果将拮抗菌的基因进行扩增测序，得到 的序列，将其序列相关信息提交到，获得登录号。进行比对后选取与菌株同源性较高的序列，通过进化树发 现 菌 株与 （、）聚在同一分支，相似性达到（图）。由此结合形态学特征和培养特征，将菌株鉴定为唐德链霉菌（ ）。 拮抗菌抑菌谱由表可知，菌株对株供试植物病原真菌生长具有抑制作用，抑菌圈直径为；对草莓灰霉病菌、桃褐腐病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制效果较明显，抑菌率分别为、和。 拮抗菌活性物质的稳定性 温度由图可知，菌株无菌发酵滤液在及以下温度处理后依然保持较高的抑菌活性（），且与对照差异不显著。经高温处理后，发酵液抑菌率明显下降，但仍能达到；在高压蒸汽灭菌处理后，发酵液抑菌率急速下降至，这个处理均显著低于对照。说明菌株发酵液在温度低于的环境条件下具有较好的热稳定性。北方园艺月（下）图基于序列的拮抗菌系统进化分析 表菌株对植物病原真菌的抑制效果 植物病原真菌 抑菌圈直径 抑菌率 草莓灰霉病菌    桃褐腐病菌    辣椒炭疽病菌    黄瓜枯萎病菌    番茄灰霉病菌    番茄叶霉病菌    小麦纹枯病菌    甘蓝枯萎病菌     光照由图可知，拮抗菌无菌发酵滤液对可见光和紫外光具有较好的稳定性，在连续照射后，抑菌活性较对照均没有显著性差异。当紫外光照射时间不断延长，抑菌活性呈逐渐降低趋势，但处理时菌株无菌发酵滤液抑菌活性仍然维持在。说明菌株无菌滤液的对可见光和紫外光稳定，在田间应用时可保持较好的抑菌活性。 由图可知，拮抗菌无菌发酵滤液在为时具有较强的抑菌活性，抑菌率保持在。发酵液在低于或高于时，其抑菌作用下降较明显；在为和时抑制率明显降低（），但抑制率仍可达到和。说明菌株无菌发酵液的抑菌活性物质对酸碱条件有较强的耐受性。 结论与讨论从放线菌及其次生代谢产物中筛选广谱、稳定、低毒的农用抗生素在植物病害绿色防控具有广阔的应用前景。由于从普通环境中筛选出的放线菌抑菌活性低且同种属菌株重复性高，研究人员对一些极端环境中的放线菌资源进行了探究。新疆通古特沙漠西部和中部以中亚荒漠植被区系占优势，蕴藏有丰富的微生物资源。该研究从分离自新疆通古特沙漠的株放线菌中筛选到株对草莓灰霉病菌具有高抑菌活性的广谱拮抗放线菌，并鉴定为链霉菌属唐德链霉菌（ ）。从唐德链霉菌发酵 第期北方园艺图不同温度（）、光照（）、（）处理对拮抗菌活性物质稳定性的影响 （），（） （） 液中分离到的核苷肽次级代谢产物尼可霉素（）是几丁质合成酶的竞争性抑制剂，抗真菌活性强但抗菌谱相对较窄，主要应用于医药领域。林真亭等研究表明，从海洋放线菌库中筛选到的唐德链霉菌（）对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著抗菌活性，其产生的抗菌活性化合物为环二肽衍生物。该研究中菌株及其产生活性物质对草莓灰霉病菌、桃褐腐病菌、黄瓜枯萎病菌等多种重要植物病原真菌均具有明显的抑菌活性。由此推测分离自新疆特殊生境的 菌株发酵液中可能含有新的抑菌活性物质，但其具体类型还需对其活性产物进行进一步的分离纯化和结构鉴定研究。拮抗微生物及其产生的活性抑菌物质无论是施用到作物表面还是进入植物根际土壤，都要受到温度、光照及土壤酸碱性的影响。因此微生物次生代谢产物在自然环境中的稳定性直接生产菌种作为生物农药进行开发应用。该研究结果表明，发酵液耐高温，在强酸碱条件下较稳定，在可见光及紫外光处理后，对指示菌依然具有显著抑菌活性，说明菌株发酵液中的抗菌活性物质具有较强的热、酸碱和光稳定性。综上所述，将唐德链霉菌（ ）活菌及其活性代谢产物作为防治果蔬作物灰霉病的生物农药具有一定的应用价值和开发前景。参考文献秦晓杰，许皎姣，索娜，等草莓灰霉病拮抗酵母菌的筛选鉴定及对采后草莓品质的影响食品工业科技，（）：高翠珠，杨红玲，黄夏宇骐，等湖北省设施草莓灰霉病发生规律及流行因子分析中国农业科学，（）： 刘永春，张红玲腈苯唑与氟啶胺混剂防治草莓白粉病和灰霉病农药，（）： ， ， ， ，（）：孙平平，贾晓辉，崔建潮，等梨灰霉病拮抗的筛选、鉴定及作用机制研究园艺学报，（）：李德全，钱亚明，周鸣鸣，等海洋细菌防治草莓灰霉病机理及其抗菌物质分析植物保护学报，（）： 黄静，赵佳，陈哲，等抗草莓灰霉病的芽孢杆菌的分离与筛选北方园艺，（）：邱并生灰葡萄孢分生孢子产生相关基因的功能分析微生物学通报，（）：张志斌，敖武，熊瑶瑶，等内生拮抗放线菌的鉴定及抑菌活性物质的分离微生物学通报，（）： 马爱爱，徐世健，敏玉霞，等祁连山高山植物根际土放线菌生物多样性生态学报，（）：王开梅，万中义，张志刚，等植物内生放线菌及其作为微生物农药开发的潜力湖北农业科学，（）：朱海云，马瑜，柯杨，等猕猴桃细菌性溃疡病生防菌的筛选、鉴定及其防效初探微生物学杂志，（）：程丽娟，薛泉宏，来航线，等微生物学实验技术西安：世界图书出版社，：朱文杰，薛泉宏，曹艳茹，等秦岭太白山北坡土壤拮抗性放北方园艺月（下）线菌分布及特性应用生态学报，（）：中国科学院微生物研究所放线菌分类组链霉菌鉴定手册北京：科学出版社，方中达植病研究方法北京：中国农业出版社，安登第，陈玉梅，李进，等银沙槐内生放线菌抗菌活性及其与内生细菌的拮抗关系应用生态学报，（）： ：， ， 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