北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定.pdf

Molecular Identification of Tomato mottle mosaic virus CHEN Ling-zhi 1，ZHANG Ru 1，WEI Bing-qiang 1 ，WANG Lan-lan 1 ，GAO Yan-ping 2 ，ZHANG Wu 2 〔 1 Institute of Vegetables，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，Gansu，China； 2 Gansu Potato Seed （Seedling）Virus Detection and uation of Engineering Technology Research Center，Lanzhou 730070，Gansu， China〕 Abstract Using DAS-ELISA and RT-PCR s，this study identified pepper pathogenetic virus in experimental fields of Vegetable Insititute，Gansu Academy of Agricultural Sciences. The results showed that in 72 disease infected samples，the total TMV detection rate was 66.7，whereas CMV had not been detected as positive. Three pairs of primers were designed to amplify positive samples. A strip with similar segments was amplified only from primer TMV1，which had 97 sequence similarity with ToMMV by BLASTN comparison. Aiming at ToMMV，3 pairs of primers ToMMV1，ToMMVcp and ToMMVspe were designed to amplify ToMMV. A single target band with same size as expected was amplified. Its sequence was 98 accorded with ToMMV by sequencing，proving the virus found in the experimental fields of Vegetable Insititute was truly ToMMV. Key wordsPepper；Virus disease；DAS-ELISA；ToMMV；RT-PCR 北京地区南瓜病毒病病原种类鉴定 陈利达 曹金强 石延霞 柴阿丽 谢学文 *李宝聚 *（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081） 摘 要为明确北京地区南瓜病毒病种类及其主要侵染病原，2016～2017年在北京周边采集疑似感染病毒的南瓜病样84份， 并根据南瓜上的6种病毒特异性引物对其进行反转录PCR（RT-PCR）检测。结果表明共有79份南瓜病样检测显示阳性， 其中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus ，CMV）的检出率最高，为52.38；其次是小西葫芦黄花叶病毒（ Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）和西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus ，WMV），检出率分别为44.01、14.29，其他病毒暂未检出。 此外，16.67的样品受2种病毒复合侵染，CMV和ZYMV复合侵染占7.14，ZYMV和WMV复合侵染占9.52。北京地区 南瓜上优势病毒种类为CMV，且存在病毒复合侵染现象。 关键词南瓜；病毒病；种类鉴定 ficifolia Bouché）并列为世界上南瓜属作物的5个 栽培种（李昕升 等，2017） 。南瓜因产量高、效益 好，且具有一定的保健作用，成为我国北方地区菜 粮兼用作物之一。据联合国粮农组织（FAO）统计， 2014年全世界南瓜产量约为2 519万t，我国占世 界当年总产量的28.74 ，居世界第1位（王璐， 2017） 。随着南瓜种植规模的扩大，病毒病也愈发 严重，成为制约南瓜产业发展的主要因素之一，尤 其在高温干旱的年份，严重影响南瓜的品质与产 量。据报道，能够侵染南瓜的病毒种类有80多种， 其中小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic 陈利达，男，硕士，科研助理，专业方向蔬菜病害检测，E-mail *通讯作者（Corresponding authors） 谢学文，男，博士，专业方向蔬 菜病害综合防治，E-；李宝聚，男，研究员， 专业方向蔬菜病害综合防治，E-mailL 收稿日期2017-12-04；接受日期2018-03-06 基金项目国家重点研发计划项目（2016YFD0201010），公益性行业（农 业）科研专项经费课题项目（201303112） 南瓜（Cucurbita moschata Duch.，中国南瓜）、 笋瓜（Cucurbita maxima Duch. ex Lam.，印度南瓜）、 西葫芦（Cucurbita pepo L.，美洲南瓜） 、墨西哥南 瓜（ Cucurbita mixta Pangalo）和黑籽南瓜（ Cucurbita 43 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 43 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（6）43 - 47 virus，ZYMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV） 、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV） 、南瓜花叶病毒（ Squash mosaic virus，SqMV） 、番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）和马铃薯Y病毒（Potato viurs Y， PVY）（Lecoq et al.，1997；Fletcher et al.，2000；周 贤，2013；刘嘉峪 等，2017）发生相对普遍。 近年来北京地区南瓜的种植面积逐年增加，南 瓜病毒病危害日趋严重，本文针对北京周边地区采 集的疑似感染病毒病的南瓜叶片，采用反转录PCR （RT-PCR）技术进行检测，以期了解北京地区南 瓜上主要病毒种类及其分布，为当地南瓜病毒病的 防控和抗病品种的选育提供参考。 1 材料与方法 1.1 样品采集 2016～2017年，在北京周边地区采集疑似感 染病毒病的南瓜样本（叶片）共84份顺义区32 份、昌平区15份、大兴区12份、海淀区25份。 所采样品均保存在-80 ℃冰箱备用。 1.2 试剂与仪器 试剂TRIzol Reagent购自英潍捷基（上海） 贸易有限公司；反转录试剂盒FastQuant RT Kit 购自天根生物科技（北京）有限公司；2 Taq Mix（MT201）购自博迈德科技（北京）有限公司。 仪器设备3K15型高速离心机，德国Sigma 公司生产；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂 生产；移液枪，德国Eppendorf公司生产；Jel Doc 2001型凝胶成像系统、Bio-Rad S1000 PCR仪，美 国伯乐公司生产。 1.3 植物总 RNA提取 采用TRIzol法提取南瓜叶片总RNA。取100 mg南瓜叶片于液氮中研磨，将0.2 g粉末转入1.5 mL离心管，迅速加入1 mL TRIzol试剂，振荡混匀， 室温下静置5 min；4 ℃下12 000 r·min -1 离心10 min；将上清液转入1.5 mL离心管，加入0.2 mL氯 仿混匀，室温放置5 min；4 ℃下12 000 r·min -1 离 心10 min；取水相（约400 μL）加入等体积的异 丙醇，室温下静置10 min；4 ℃下12 000 r·min -1 离心10 min；弃上清液，加入1 mL 75乙醇洗涤 沉淀2次，4 ℃下12 000 r·min -1 离心5 min；自然 干燥，加入50 μL RNase-Free ddH 2 O溶解；以健 康南瓜叶片总RNA为阴性对照，-80 ℃保存备用。 1.4 南瓜病毒病样本 RT-PCR检测 以提取总RNA为模板，用FastQuant RT Kit试 剂盒反转录合成病毒的cDNA第一条链。使用已报 道的CMV-F/CMV-R、SqMV-1/SqMV-2、PRSV-F/ PRSV-R和PVY-1/PVY-2特异性引物（表1）对 不同样本进行RT-PCR扩增，其中ZYMV-1/2和 WMV-1/2是根据GenBank已有的病毒外壳蛋白基 因（Coat Protein，CP）序列所设计。所用引物均 由博迈德科技（北京）有限公司合成。 表1 用于南瓜病毒病分子检测的引物信息 引物编号引物序列（5′-3′） PCR产物/bp参考文献 CMV-F CGTTTAGTGACTTCA GACAG 735 宋婷婷 CMV-R ATG GACAAATCTGAATCAAC 等，2007 ZYMV-1 AAAGAAGAAGACAAAGGGAA 582 自行设计 ZYMV-2 AGCGTATCGTGCTAAACT WMV-1 ACACCAGTGGCAAAGGG 697 自行设计 WMV-2 CCATCAAGTCCAAATAACC SqMV-1 CATGGTACAGCAGCTTGGAAC 597 廖富荣 SqMV-2 GAAGCCACAACAAAACCCAGA 等，2013 PRSV-F ATGAGGCTGTGGATGCTGGTTTA 325 任春梅 PRSV-R GATTGAGTGGCACGAGTATTAGA 等，2015 PVY-1 GCCAACTGTGATGAATGGGC 400 冯光惠 PVY-2 TGTACTGATGCCACCGTCCA 等，2014 PCR扩 增 体 系2Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA模板 1 μL， ddH 2 O补足至20 μL。PCR扩增条件94 ℃预变 性4 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延 伸45 s，共34个循环；72 ℃补充延伸10 min。扩 增结束后，取5 μL PCR产物于1.5琼脂糖凝胶 电泳检测，使用全自动凝胶成像系统记录结果。 PCR产物送至博迈德科技（北京）有限公司进行 测序，并利用NCBI序列比对工具BLAST（http// blast.ncbi.nlm.nih.gov/）程序，根据核酸序列同源性 确定病毒种类。 2 结果与分析 2.1 RT-PCR扩增结果 对采集的84份南瓜病毒病样本（叶片）提取 总RNA，利用不同特异性引物进行RT-PCR检测， 部分检测结果见图1。待测样品中引物CMV-F/ CMV-R可扩增出大小735 bp的条带（图1-a）， 44 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 44 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 引物ZYMV-1/ZYMV-2可扩增出大小582 bp的条 带（图1-b），引物WMV-1/WMV-2可扩增出大小 697 bp的条带（图1-c），阴性对照均未扩增出目的 条带。表明在待检样品中能分别测出CMV、ZYMV 和WMV，但未检测到SqMV、PRSV、PVY。 2.3 南瓜植株上病毒的复合侵染情况 北京地区84份南瓜病毒病样品中，发现14份 病样为2种病毒复合侵染，复合侵染率为16.67 （表3） 。其中，北京顺义区南瓜病毒病复合侵染 种类为CMV和ZYMV，侵染率为18.75；海淀区 南瓜病毒病复合侵染种类为ZYMV和WMV，侵染 率为32.00，未检出3种病毒复合侵染。 表3 北京地区南瓜病毒复合侵染类型及分布 采样地 样品 数量 CMVZYMV ZYMVWMV CMVWMV 检出 数 检出 率/ 检出 数 检出 率/ 检出 数 检出 率/ 顺义区 32 6 18.75 0 0 0 0 昌平区 15 0 0 0 0 0 0 大兴区 12 0 0 0 0 0 0 海淀区 25 0 0 8 32.00 0 0 总计 84 6 7.14 8 9.52 0 0 2.4 北京地区南瓜病毒病田间症状 南瓜病毒病的发生可贯穿植株整个生长发育 期，为系统性侵染。北京地区南瓜病毒病主要包括 花叶、褪绿和皱缩等症状，经室内分子检测后得知 田间病毒种类为CMV、ZYMV和WMV 3种。CMV 田间症状（图2-a） 叶片叶绿素分布不均，易出 现黄色或淡黄色病斑。严重时叶片变小变脆，出现 浅黄色部分斑驳，呈现黄绿分布不均的镶嵌状花叶 症状。ZYMV田间症状（图2-b）叶面出现花叶及 斑驳症状，部分叶肉逐渐褪绿黄化，易出现明脉。 严重时植株矮化，节间变短，叶缘卷曲形成鸡爪状， 图1 南瓜部分样品 RT-PCR检测结果 a为CMV引物扩增结果，b 为ZYMV引物扩增结果，c 为WMV 引物扩增结果；M，BM5000 DNA Marker；N，健康植株；1～11， 部分感病植株。 M N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp a 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp b M N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp c M N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2.2 南瓜主要病毒种类检测结果 对采集的84份南瓜病毒病样本进行PCR检 测，其中79份病样检测显示阳性，检出3种病 毒分别为CMV、ZYMV和WMV，病毒检出率 94.05。其中CMV检出率最高，可达52.38；其 次为ZYMV，检出率44.01；WMV检出率14.29 （表2） 。因此，CMV在北京地区南瓜上侵染最普 遍，为优势病毒种类。 北京不同地区南瓜病毒种类及发生程度有所 差异（表2） 。在南瓜植株上检出的病毒种类最多 的是顺义区和海淀区，检测到3种病毒，这2个地 区南瓜病毒病发生最为严重；其次是昌平区和大兴 区，分别检测出2种病毒，该地区病毒病危害较轻。 表2 北京地区南瓜病毒种类及分布 采样地 样品 数量 CMV ZYMV WMV 检出 数 检出 率/ 检出 数 检出 率/ 检出 数 检出 率/ 顺义区 32 21 65.63 11 34.38 4 12.50 昌平区 15 10 66.67 2 13.33 0 0 大兴区 12 8 66.67 4 33.33 0 0 海淀区 25 5 20.00 20 80.00 8 32.00 总计 84 44 52.38 37 44.01 12 14.29 图2 南瓜病毒病田间发病症状 a，CMV侵染南瓜叶片症状；b，ZYMV侵染南瓜叶片症状；c，WMV侵染南瓜叶片症状；d，CMVZYMV复合侵染南瓜叶片症状；e， ZYMVWMV复合侵染南瓜叶片症状。彩色图版见中国蔬菜网站veg.org。 a b c d e 45 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 45 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 并常伴有蕨叶及叶面凹凸起伏症状。WMV田间症 状（图2-c） 叶片变小变硬，叶缘部分失绿并伴 有斑驳等症状。发病中后期植株表现皱缩矮化、叶 片卷曲，发病严重时茎蔓变短，发病组织呈瘤状突 起。混合侵染的植株发病症状表现较为复杂，发病 较重。CMV和ZYMV复合侵染后植株矮化，叶缘 卷曲，叶片颜色变浅，出现蕨叶及叶面不平现象（图 2-d）。ZYMV和WMV复合侵染现象广泛存在，其 症状在叶片上表现明显，叶片出现褪绿黄化，易形 成深浅绿色相间花叶，伴有皱褶卷曲现象。有时叶 缘处有斑驳突起，病株生长迟缓，开花结果后病情 趋于加重（图2-e）。 3 结论与讨论 病毒病是制约南瓜生产的重要因素之一，随着 我国南瓜种植面积逐年增加，病毒病的危害日益加 重，给南瓜生产造成严重的经济损失。南瓜病毒病 在我国长江地区、内蒙古、新疆、黑龙江等地普遍 发生（马英，2017） 。不同地区引起南瓜病毒病的 毒源种类不尽相同，新疆石河子地区南瓜病毒病毒 源种类主要为CMV、ZYMV、WMV、PRSV-W（任 琛荣 等，2016） ；黑龙江地区南瓜病毒病的毒源 种类为CMV和WMV（杨国慧，2003）。本试验结 果表明，侵染北京地区南瓜的主要毒源有CMV、 ZYMV和WMV 3种，未检测到SqMV、PRSV、 PVY等其他病毒，由于病毒分布具有区域性，目 前SqMV只在黑龙江南瓜上有相关报道（李凤梅， 2002） 。其他病毒种类也未检出，可能是由于采样 数量少或部分南瓜植株病毒症状表现不明显，导致 漏采。在所有检测样品中CMV的检出率较高，可 能是由于CMV寄主范围广，可侵染1 000多种单、 双子叶植物（王海河 等，2001），且CMV可由60 多种蚜虫进行非持久性传播，因此成为北京地区 南瓜病毒病优势毒源。此外，本次采集样本共84 份，其中有79份病样显示阳性，5份疑似感染南 瓜病毒病，但在该样本内未检测到病毒，可能是生 理性病害或药害所致。 瓜类病毒复合侵染现象在不同地区均有报道， 部分学者对我国瓜类主产区进行病毒种类调查， 发现存在多种病毒复合侵染现象，其中以PRSV和 WMV组合最为常见，占复合侵染组合的31.25 （尤毅 等，2016） ；重庆地区南瓜检测样品中有 93.22的样品受2种以上病毒复合侵染（青玲 等， 2010） 。本试验中2种病毒复合侵染率为16.67， 可能与连作、传毒媒介、种子与土壤带毒有关。 尤其是昆虫传毒，CMV、ZYMV 、WMV均可通过 蚜虫进行传播，部分蚜虫可携带多种病毒进行再 侵染，导致一种植株上出现2种或2种以上病毒复 合侵染现象。也可能与病毒越冬习性有关，如国 内学者在重庆地区对南瓜病毒病进行鉴定，发现 农田周围葎草上存在7 种病毒，且复合侵染的比 例高达80（青玲 等，2009）。CMV、ZYMV和 WMV均为种传病毒（杨国慧，2003） ，再加上田 间管理不当、单一品种种植模式等，成为南瓜病 毒病发生严重且存在复合侵染的主要原因。 本试验已检测出北京地区南瓜病毒病的毒源种 类主要有CMV、ZYMV和WMV，但受采集数量和 地域性的限制，无法涵盖北京地区南瓜病毒所有种 类， 因此， 是否存在其他病毒种类还有待进一步研究。 参考文献 冯光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁.2014.陕北地区马铃薯Y病 毒的RT-PCR检测及其序列分析.山西农业科学，42（9） 941-944. 李凤梅.2002.黑龙江省南瓜病毒病毒原鉴定和品种资源抗性筛选 的研究〔硕士论文〕.哈尔滨东北农业大学. 李昕升，吴昊，刘宜生.2017.南瓜属作物与南瓜品种资源.中国 野生植物资源，36（5）1-6. 廖富荣，叶志红，陈青，吴媛，陈红运，林石明.2013.应用RT- PCR和IC-RT-PCR方法检测南瓜花叶病毒.植物检疫，27 （2）60-64. 刘嘉裕，戴良英，刘勇，张德咏，谭新球，李迅，唐前君.2017. 长沙地区南瓜的小西葫芦黄花叶病毒检测及其分子进化分 析.湖南农业大学学报自然科学版，43（3）274-281. 马英.2017.籽用西葫芦病毒病发病流行原因分析及防治.中国蔬 菜，（7）86-88. 青玲，杨水英，孙现超，王进军，周常勇.2009.从葎草中检出复 合侵染的多种病毒.植物保护，35（4）138-139. 青玲，包凌云，周常勇，杨水英，孙现超.2010.重庆南瓜病毒病病 原 ELISA 检测及CMV变异分析.园艺学报，37（3）405-412. 任春梅，程兆榜，杨柳，缪倩，周益军.2015.江苏省葫芦科作物 6种病毒的多重 RT-PCR 方法及应用.江苏农业学报，31（4） 756-763. 任琛荣，郝小军，都业娟，向本春.2016.新疆石河子及新湖籽用 西葫芦病毒病分子检测.北方园艺，（1）102-106. 宋婷婷，陈荣溢，杨雷亮.2007.应用多重RT-PCR 检测烟草上的 46 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 46 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES TMV和CMV.辽宁农业科学，（1）53-54. 王海河，林奇英，谢联辉，吴祖建.2001.黄瓜花叶病毒三个毒株 对烟草细胞内防御酶系统及细胞膜通透性的影响.植物病理 学报，31（1）43-49. 王璐.2017.南瓜籽不同干燥方式及工艺对南瓜籽油功能性品质的 影响〔硕士论文〕.北京中国农业大学. 杨国慧.2003.滇黑两省南瓜病毒病病原鉴定及其外壳蛋白基因克 隆〔博士论文〕.哈尔滨东北农业大学. 尤毅，李华平，谢大森.2016.侵染冬瓜的病毒病原种类鉴定.植 物保护，42（2）182-186. 周贤.2013.苏丹首次报道南瓜感染番木瓜环斑病毒.植物检疫， （3）100. Fletcher J D，Wallace A R，Rogers B T.2000.Potyviruses in New Zealand buttercup squash（Cucurbits maxima Duch. ） yield and quality effects of ZYMV and WMV 2 virus infections.New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，28（1）17-26. Lecoq H，Dafalla G，Desbiez C，Wipfscheibel C，Delecolle B.1997. Biological and molecular characterization of Moroccan Watermelon mosaic virus and a potyvirus isolate from Eastern Sudan.Plant Disease，85（5）547-552. Identification of Pathogen Species of Virus Diseases Infecting Squash in Beijing Area CHEN Li-da，CAO Jin-qiang，SHI Yan-xia，CHAI A-li，XIE Xue-wen *，LI Bao-ju * （Insititute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China） Abstract In order to clear and definite species of squash virus diseases in Beijing area and their main infection pathogens，this paper collected 84 squash samples with suspected virus-like symptoms during 2016- 2017 from Beijing area，and carried out detection by RT-PCR used 6 pairs of specific virus primers.The results showed that 79 samples were positive，among which Cucumber mosaic virus （CMV） had the highest detection rate -52.38，followed by Zucchini yellow mosaic virus （ZYMV） and Watermelon mosaic virus （WMV）.Their detection rate were 44.01 and 14.29，respectively.Other viruses were not yet detected.In addition，16.67 samples were mix-infected by 2 kinds of viruses.Mix infection of CMV and ZYMV took 7.14.Mix infection of ZYMV and WMV took 9.52.CMV was the prent pathogenic virus in Beijing area，where the mix infection of viruses on squash was existed. Key wordsSquash；Virus diseases；Species identification 早佳（8424） 该品种为吴明珠院士选配的早熟西瓜一代杂种，为保 护地专用品种。果实发育期30～35天，单瓜质量3～6 kg， 中心含糖量12以上，每667 m 2 （1亩）产量2 000～3 000 kg；果实圆球形，果皮薄、绿色底覆青黑色条纹，果肉粉 红色，质地细松脆，品质佳。 S-甜王 植株生长强健，坐果率高，早熟，坐果后28天左右 成熟；果实高圆形，果皮绿色覆明显的深色条纹，单果质 量8～10 kg左右，果肉鲜红，细腻、甜脆，中心含糖量 13；耐贮运，适合南北方保护地及露地栽培，深受市场 欢迎。 玉娘 生长势强，耐枯萎病，坐果率高；果实高球至短椭圆 形，单瓜质量1.5 kg左右，果皮白色，表面光滑或偶有稀疏 网纹，果肉淡绿色，肉厚，中心可溶性固形物含量17左 右，肉质柔软细腻；播种至始收80～100天，坐果至采收 40～50天。 美都 中熟，开花至果实成熟约40天，一般单瓜质量约5 kg以上；果实圆球至高球形，果皮绿色覆墨绿条纹，如 果实膨大期遇低温，果皮底色和条纹会加深，果肉桃红 色，中心含糖量约11～12，品质好；果皮稍硬，较耐 贮运。 · 封面说明 · 温州市神鹿种业有限公司 地址浙江省温州市瓯海经济开发区西经二路 17号 邮编 325014 电话0577-88623355 88623344 传真 0577-88623838 http// 47 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 47 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES