湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定_班一云.pdf

，（）：   研 究 简 报 收稿日期 ：   修订日期 ：基金项目 ：国家自然科学基金重大项目 （）通信作者 ：；湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定班一云 ，丁波，周雪平（中国农业科学院植物保护研究所 ，植物病虫害生物学国家重点实验室 ，北京）摘要双生病毒是一类在全世界范围内广泛发生的单链环状 病毒 。本文对从湖南采集到的 例 （洋姜 、番茄 、萝卜 、赛葵 、甘薯 、牵牛花 ）疑似双生病毒侵染的植物叶片进行了分子鉴定 。利用滚环扩增技术 （）对样品进行扩增，分别对其产物进行酶切，并将酶切得到的片段测序后进行比对，结果显示番茄样品中的病毒分离物与番茄黄化曲叶病毒相似性最高 （），牵牛花样品中的病毒分离物与甘薯卷叶病毒相似性最高（），证明这两个分离物是单组分双生病毒。这是在湖南省首次发现并报道双生病毒的全核酸序列 。关键词番茄黄化曲叶病毒 ；甘薯卷叶病毒 ；中图分类号 ：  文献标识码 ：  ： ， （ ， ， ， ，） （）， （） （）， ， ； ；双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链病毒 ，一般发生在热带和亚热带地区 ，寄主范围十分广泛 ，在全球范围内造成重大损失。番茄黄化曲叶病毒 （）和甘薯卷叶病毒 （）均属于双生病毒科的菜豆金色花叶病毒属，该属病毒主要以烟粉虱传播 ，危害极为严重。番茄黄化曲叶病毒是侵染番茄 的主要病毒之一 ，最早在以色列被发现 ，年正式被命名。该病毒引起植株曲叶 、黄化 、矮化等症状 ，常对番茄栽培地区造成毁灭性危害。我国是世界上最大的甘薯 生产国 ，而甘薯卷叶病毒主要侵染旋花科植物 ，其危害严重阻碍了甘薯产业的发展。牵牛花 是一种观赏植物 ，并且具有药用价值 ，其生长适应性强 ，田间路边随处可见 。研究表明 ，双生病毒可经烟粉虱在牵牛花与作物之间相互传播，因此牵牛花对双生病毒重组 、传播及扩散都有重要的作用 ，对作物生产构成了严重的威胁。目前 ，受全球气候变暖 、国际贸易加强及人类活动等影响 ，双生病毒病害在我国的危害范围不断扩大。因此 ，对不同地区 、不同寄主卷第 期 班一云等：湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定的双生病毒进行鉴定 ，进一步明确该病害在我国的发生 、分布及危害情况可为病毒病防控打下基础 。本研究对从湖南省采集的样品进行了分子鉴定 ，发现番茄样品被侵染 ，而牵牛花样品被侵染 ，和分离物的全基因组大小均约的单链环状分子 。病毒基因组共编码个开放阅读框 （ ，），分别为 、 、和，并未检测到和组分 。 材料与方法 材料 样品采集年月在湖南省长沙市采集到疑似被双生病毒侵染的植物叶片样品份 ，分别为洋姜 、番茄（图）、萝卜 、赛葵 、甘薯和牵牛花 （图）。阳性对照为本实验室保存的番茄黄化曲叶病毒和甘薯卷叶病毒 。图 从湖南省采集的番茄和牵牛花样品的感病症状 试剂及仪器内切酶 ，购自 公司 ；零背景快速克隆试剂盒 ，购自天根生化科技公司 ； ，购自全式金生物技术公司 ；高保真酶试剂盒 ，购自公司 ； ，购自 公 司 ； ，购自公司 ； 离心机 ，购自公司 ； 凝胶成像系统 ， 仪 ，购 自公 司 ；全自动快速样品研磨仪 ，购自上海净信科技公司 。 方法 叶片总提取采用法提取样品叶片总。分别取叶片组织放入预先加入一枚钢珠的离心管中 ，液氮速冻后利用全自动快速样品研磨仪将样品研磨至粉状 ，加入 水浴预热的抽提缓冲液 ，水浴保温后加入等体积的的氯仿 异戊醇振荡混匀 ， 离心，转移上清至新的离心管中 。然后加入体积醋酸钠 （）和倍体积的预冷的无水乙醇 ，混匀后于放置， 离心以沉淀，弃上清后用 乙醇将沉淀清洗次 ， 离心弃上清后干燥 ，最后加入适量去离子水溶解，置于保存 。 病毒基因组的滚环扩增及酶切鉴定利用 对样品总进行滚环扩增 。将 （约）加入到样品缓冲液中 ，变性后立即置于冰上，然后加入反应缓冲液和 聚合酶 ，混匀后置于反应，最后加热以终止反应 。选取多种双生病毒含有的酶切位点 ，采用相应的限制性内切酶分别对个样品的产物进行酶切以获得特异性片段 。 病毒基因组的克隆测序及全长序列获取将酶切得到的片段连接至载体 ，由北京擎科生物公司进行测序 ，在网站对测序结果进行比对 ，结果表明番茄样品分离物与的相似性最高 ，牵牛花样品分离物与的相似性最高 。根据测得的部分序列设计 特 异 引 物 对 ：（）（）和（）（）分别扩增番茄样品和牵牛花样品分离物的全长 。同时分别利用组分的通用引物和的通用引物对 样 品 进 行扩 增 ，以 期 获 得和序列 。 病毒基因组序列比对及进化树构建利用 软件对筛选的阳性克隆序列进行比对 ，最终确定病毒分离物的基因组全序列 。在数据库中进行相似性比对分析 ，并从中选取已报道的和的代表性同 源 序 列 ，在 中 采 用 邻 接 法（）构建全基因组序列进化树 ，系统进化树中参数值设置为 。 结果与分析 产物酶切检测以提取的植物基因组总为模板分别进行扩增 ，通过酶切样品的产物 ，从番茄和牵牛花样品中均得到了左右的条带 （图），割胶纯化后克隆测序 ，序列比对结果显示 ，番茄样品的分离物与中番茄黄化曲叶病毒 （）的 相 似 性 最 高 （），命 名 为（）；牵牛花样品中的分离物与甘薯卷叶病毒 （）的相似性最高 （），命名为（）。利 用 通 用 引 物和对样品进行扩增 ，结果均未检测到或组分 ，推测和均 为 仅 含 有组分的单组分双生病毒 。图 湖南省采集样品的 产物的酶切鉴定 病毒基因组的序列测定和分析通过酶切产物得到番茄和牵牛花样品分离物的基因组片段 ，分别设计特异引物扩增全长 （图），每个分离物均检测个阳性克隆 ，测序结果表明各分离物病毒基因组序列之间无任何差异 。其中 ，全长为 ，为单链闭合环状，共编码个，其中病毒链编码个：（）和（），互补链编码个：（）、（）、（）和（）。全长为 ，为单链闭合环状，共编码个，其中病毒链编码个：（）和（），互 补 链 编 码个：（）、（）、（）和（）。图 利用特异引物扩增番茄样品和牵牛花样品中双生病毒分离物基因组全长 及的序列分析从中选取有代表性的同源序列和和序列进行序列比对 ，采用邻接法 （）分别对和构建进化树 （图）。从进化树图中可以看出 ，与云 南 分 离 物 的 亲 缘 关 系 最 近 （图），与江苏 、安徽等地分离物的亲缘关系最近 （图）。 讨论本研究通过对从湖南省采集的例样品进行检测及鉴定 ，证明双生病毒的危害进一步扩大到了卷第 期 班一云等：湖南省番茄和牵牛花上双生病毒的分子鉴定湖南省 ，为进一步研究我国双生病毒的分布情况及分子变异情况提供了一定的科学依据 。根据双生病毒科病毒的命名规则 ，全基因组核酸序列的相似性大于被命名为同种病毒的不同株系 ，小于则被命 名 为 不 同 种 的 病 毒，因 此 将确 定 为的 一 个 分 离 物 ，为的一个分离物 。这是首次在湖南省发现并报道双生病毒 。图 和 不同分离物的核苷酸序列进化树 番茄在湖南省的生产生活中占有重要地位 ，它不仅是人们日常食用的主要蔬菜 ，番茄产业也为当地的农民增加了收入 。然而 ，番茄黄化曲叶病毒病是一种发生于番茄上的毁灭性病害，它严重制约了番茄产业的发展 。目前 ，该病害在我国传播呈现出由南向北的发展趋势 ，并且逐年加重。从进化树关系图中可以看出 ，和云南等省市的分离物的序列亲缘关系最近 ，并且其保守性也很高 ，所以我们推测从湖南省检测到的双生病毒很可能是从周边省份传入 。湖北省与湖南省相邻 ，并且在年已有双生病毒发生的报道，但是两地分离物的亲缘关系却不是最近 （图），可见分离物亲缘关系的远近并不与地域呈正相关 。由于可随种苗等传播 ，所以有必要在调种前进行检测 ，同时也建议加强田间管理工作 ，及时清除病苗和适时施肥等；而积极培育选择抗病品种也会在很大程度上减少经济损失 。甘薯卷叶病毒主要侵染旋花科植物 ，在中国从南到北均有发生 ，不但危害了甘薯产业的发展 ，还严重影响了牵牛花的经济价值。作为一种主要的观赏植物 ，牵牛花在田间路边随处可见 。研究表明 ，双生病毒可经烟粉虱在牵牛花与作物之间互传 ，作为双生病毒的中间寄主 ，牵牛花对其重组 、传播及扩散都有重要的作用。因此 ，在平时作物生产过程中应加 强 检 疫 ，使 用 无 毒 种 苗 ，发 现 病 株 后 及 时拔除 。是一种新近发展起来的恒温核酸扩增方法 ，可以直接从样品总扩增目的，实现对靶病毒的信号放大 ，在生物大分子检测方面有重要的应用价值 ，同时也提高了双生病毒的检出率。本研究通过酶切样品的产物快速准确地检测到番茄和牵牛花样品中的双生病毒序列 ，进一步明确了该病害在我国的发生及分布情况 ，为双生病毒病害的防控提供了参考 。参考文献 ， ， ， ： ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ： ，（）： ， ， ， （ ） ，（）：宋建军 ，刘红宵 ，仇燕 ，等 番茄黄化曲叶病毒病的发生分布及防治对策 北方园艺 ，（）：乔贞贞 ，秦艳红 ，乔奇 ，等 甘薯卷叶病毒江苏分离物基因组全长序列测定及其外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达 河南农业科学 ，（）：， ， ， ，（）： ， ， ， ： ， （：） ，（）： ， ， ， ，（）：王向阳广西胜红蓟黄脉病样中发现多种菜豆金色花叶病毒属的病毒 植物病理学报 ，（）：周雪平双生病毒种类鉴定、分子变异及致病机理研究 中国植物保护学会 年学术年会 ， ， ， ，（）： ， ， ：， ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ， ，植物病理学报，（）： ， ， ， ： ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ， ，（）：苗相伟番茄黄化曲叶病毒病的研究进展中 国 果 菜，（）：汤亚飞 ，何自福 ，杜振国 ，等番茄黄化曲叶病毒在湖北首次报道 植物保护 ，（）：徐德利 ，杨静 ，鲍继友 ，等番茄黄化曲叶病毒病综合防控技术研究进展 农业科技通讯 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：（责任编辑 ：杨明丽櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍）（上接页）李儒海 ，褚世海 二氯喹啉酸对水稻后茬作物的安全性研究湖北农业科学，（）：黄翅 ，罗坤 降解菌 对茄科作物二氯喹啉酸药害的修复作用现代农业科技，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ，（）：王一茹 ，刘长武 ，牛成玉 ，等 二氯喹啉酸及其代谢物在稻田水土作物中的气谱和液谱残留分析方法研究 农业环境保护 ，（）：陈泽鹏 ，王静 ，万树青 ，等 广东部分地区烟叶畸形生长的原因及治理的研究 中国烟草学报 ，（）：李晶新 ，韩锦峰 ，刘华山 ，等 二氯喹啉酸对烤烟种子萌发及幼苗生长的影响 河南农业科学 ，（）：李丽春 ，陈泽鹏 ，张万良 ，等二氯喹啉酸在土壤、畸形烟叶和烤烟中残留量的比较分析 农药 ，（）：张倩 ，郭伟 ，宋超 ，等二氯喹啉酸在不同土壤中的降解规律及其影响因子 中国烟草科学 ，（）：贾菲 ，高贵 ，郑良玉除草剂二氯喹啉酸的毛细管电泳分析分析化学，（）：陈虹 ，钟明 ，唐昊冶 ，等高效液相色谱法测定土壤中的二氯喹啉酸 土壤 ，（）：郑雄志 ，曾维爱 ，赵松义 ，等高效液相色谱技术检测烟草和植烟土壤中的二氯喹啉酸残留量 中国烟草学报 ，（）：陈泽鹏 ，王静 ，万树青 ，等烟区土壤残留二氯喹啉酸的消解动态 农药 ，（）：（责任编辑 ：杨明丽 ）