陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测_王志荣.pdf

，（）： 收稿日期 ： 修订日期 ：基金项目 ：国家自然科学基金 （，）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金 （）通信作者 ：陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测王志荣，李晓东，朱玉，黄泽军，高建昌，国艳梅，杜永臣，王孝宣（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京；西安金鹏种苗有限公司，西安）摘要近年来在陕西番茄生产区出现了一种新病害 ，病株表现为叶片褪绿 ，叶脉颜色变深及叶片增厚 ，果实变小发白 ，严重影响番茄产量及经济效益 ，年发病极为严重 ，部分产区甚至绝收 。该病疑似由番茄褪绿病毒 （）引起 。利用特异引物对感病番茄样品进行 检测，结果从所采集的份病样中均检测到 预期大小的特异片段 。对 外壳蛋白 基因和类热激蛋白 基因进行克隆与序列分析 ， 基因 个核苷酸序列与已报道的 基因有较高的一致性 ，与山东青岛和山西晋中分离物同源性为 。 基因 个核苷酸序列与已报道的 基因有较高的同源性 ，与中国 、韩国 、日本 、美国 、希腊分离物同源性达到 以上 。研究表明 已传播至陕西地区 。关键词番茄 ；番茄褪绿病毒病 ；基因 ；基因中图分类号 ： 文献标识码 ： ： ， ， ， ， ， ， ， ， （ ， ， ，； ， ，） ， ， ， ， ， （） （） （） ， （ ） ， ， ； ；番茄褪绿病毒 （）属于 长 线 形 病 毒 科毛 形 病 毒 属。基 因 组 含 有 两 条 正 义 单 链，是一种病毒 ，其中有 个核苷酸 ，有 个核苷酸 。是韧皮部病毒不能通过机械摩擦接种传播。在自然条件下 ，只能依靠媒介昆虫烟粉虱传播，型烟粉虱 、型烟粉虱 、型烟粉虱 、温室白粉虱 、银叶粉虱和纹翅粉虱等介体均可传播，该病毒是唯一能通过种分属于两个属的粉虱传播的病毒。寄主范围广泛 ，可以侵染茄科、菊科、藜科、苋科、番杏科、夹竹桃科及白花丹科等科种植物 。其中 ，茄科寄主数最多 ，如番茄 、辣椒 、马铃薯 、普通烟 、本生烟等多种烟草。番茄褪绿病毒病最早于年在美国佛罗里达州温室栽培番茄上出现 ，年在美国佛罗里达州该病原首次被鉴定为番茄褪绿病毒。该病毒现已蔓延至世界各地 ，可危害多种作物，在北美洲 、南美洲 、欧洲 、非洲和亚洲均有报道 。我国最早于年在台湾地区发现，年后在北京 、江苏 、山东 、河北 、天津 、河南 、辽宁 、广东等地区陆续有关于的报道。年在陕西杨凌番茄主产区发现番茄疑似感染，感病面积较大 ，表现为番茄整株褪绿黄化 ，果实变小发白 ，严重影响番茄生长并造成很大经济损失 ，部分产区绝收 。本研究对采集的感病番茄样品进行了分子检测与鉴定 ，并对外壳蛋白基因和类热 激 蛋 白基 因 进 行 克 隆 与 序 列 分析 ，以探讨引起该病害的原因 ，并对其进行有效防控提供参考 。 材料与方法 试验材料 样品采集年月在陕西省杨凌番茄生产区的感病区采集份感病番茄材料叶片 ，编号为，同时采集该生产区非感病区健康番茄叶片作为对照 。 生化试剂和菌株 、载体提取试剂盒 、反转录 试 剂 盒 、 聚合酶 、凝胶回收试剂盒 、克 隆 载 体 、感受态细胞均由北京全式金生物技术有限公司提供 。分子量标准 由天根生化科技有限公司提供 ， 由北京依联轩科技有限公司提供 。 试验方法 番茄叶片总的提取及检测使用提取试剂盒提取番茄叶片总。取番茄编号为和健康番茄样品的叶片，依照试剂盒提取说明步骤提取总，最终将溶解于 中 。保存于用于后续试验 。以番茄叶片总作 为 模 板 ，使用反转录试剂盒反转录合成。反应体系及具体试验步骤如下 ： ， （） ， ；变性，迅速冰浴。再加 ， ， ，孵育，加 热失 活与。利用技术对番茄褪绿病毒进行检测 ，以为模板利用引物进行扩增 。反 应 体 系 为 ： ，上 下 游 引 物 各， ，灭菌水，总体积为。反应程序 ：预变性；变性，退火，延伸，个循环 ；终延伸。产物经的琼脂糖凝胶电泳检测 。 特异引物设计根据网站上已公布的北京分离物基因组序列设计了对特异引物 （表）。是根据 （登录号 ：）序列设计的特异引物 ，、是根据 （登录号 ：）序列设计的特异引物 。能扩增基因的序列 ，、扩增序列进行拼接得到 的基因序列 。 的基因及基因扩增 、序列克隆及测序扩增体系，包括 ， ，上下游引物各，灭菌水。反应程序 ：预变性；变性，退火，延伸，个循环 ；终延伸。产物经琼脂糖凝胶电泳检测 ，使用凝胶回收试剂盒回收目的谱带 ，回收产物克隆到 载体上 。转化到大肠杆菌，经验证每对引物均得到个阳性克隆后 ，再分别选取个阳性克隆送北京六合华大基因科技有限公司进行测序 。卷第 期 王志荣等：陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测表 本试验中用到的引物信息 引物名称引物序列 （）引物中基因组中的位置 产物大小 序列分析将得到的基因序列和基因序列在网站中进行分析比对 ，根据比对结果 ，再选取上已发表的分离物的基因完整序列份和基因完整序列份 （表）。利用中的软件对选定的序列进行同源性比对 ，利用软件的 法进行多序列比对分析以及邻接法 （，）构建系统进化树 ，系统进化树中各分支置信度 （）进行 次重复分析 。 结果与分析 检测结果利用特 异 标 记进 行分析 ，份感病番茄材料均能检测到与预期大小一致的特异片段 ，而健康番茄样品中未检测到目的片段 （图），结果表明陕西杨凌出现的新病害为番茄褪绿病毒病 。图 番茄样品 检测结果及 和 基因 扩增结果 基因序列分析利用基因的特异引物进行分析 ，从感病材料中扩增出片段 ，利用网站中功能对所得分离物的扩增序列进行比对 ，扩增产物包括完整基因（个核苷酸 ），与预期结果相符 ，初步证明陕西杨凌番茄新病害是由番茄褪绿病毒的危害所致 。基因的个阳性克隆测序结果一致 。将 基因全长个核苷酸 （登录号 ：）与在上收集的来自亚洲 、欧 洲 、北 美 洲 、南 美 洲 的个 国 家 的份基因序列进行同源性分析及进化树构建 。结果 表 明 基因序列与山东青岛（）和山西晋中（）序列同源性达到，与国内其他地区及日本 、韩国 、美国地区的同源性在以上 ，而与希腊 、巴西 、以色列 、西班牙等地样品基因序列同源性在。这些结果表明 ， 基因序列在不同地区存在一定差异 ， 基因与国内其他地区及亚洲地区基因具有较高同源性 ，相比之下 ， 基因与欧洲地区分离物基因同源性较低 （表）。从构建的基因序列进化树可以看出 ， 基因与山东青岛和山西晋中分离物 基因在一个小分支上 ，亲缘关系一致 。中国的份材料的基因序列聚集在一个大的分支上 。不同地区的 基因序列存在一定差异 ，同一国家的 基因序列亲缘关系较近 ，亚洲与欧洲 基因亲缘关系相对较远（图）。表 用于序列比较和进化分析的 基因序列信息 病毒分离物 登录号 地理来源 同源性 病毒分离物 登录号 地理来源 同源性 （） 中国 （） 中国 （） 中国 （） 中国 （） 中国 （） 中国 （） 日本 （） 中国 （） 韩国 （） 希腊 （） 韩国 （） 希腊 （） 韩国 （） 希腊 （） 韩国 （） 希腊 （） 韩国 （） 韩国 （） 韩国 （） 韩国 （） 中国 （） 中国 （） 中国 （） 希腊 （） 中国 （） 希腊 （） 中国 （） 希腊 （） 中国 （） 希腊 （） 中国 （） 巴西 （） 中国 （） 以色列 （） 中国 （） 巴西 （） 中国 （） 西班牙 （） 中国 （） 韩国 （） 中国 （） 法国 （） 中国 （） 西班牙 （） 美国 （） 西班牙 （） 美国 （） 西班牙 （） 中国 （） 西班牙 （） 中国 基因序列分析扩 增 结 果 表 明 ，扩 增 出片段 ，扩增出 片段 ，与预期结果相符 。分别将这两个扩增片段的个阳性克隆进行测序拼接得到个 片段 ，该片段包括完 整基 因 （ 个 核 苷 酸 ），使 用软件对这个 片段进行比对 ，序列结果一致 ，重复性较好 。将陕西省杨凌分离物 基因全长 个核苷酸 （登录号 ：）与在上收集的来自亚洲 、欧洲 、北美洲 、南美洲的个国家的份 基因序列进行同源 性 分 析 及 进 化 树 构 建 。结 果 表 明 ， 基因与中国大部分地区 、日本 、韩国大部分地区 、美国 、巴西分离物 基因同源性在以上 ，与西班牙的个地区分离物 基因同源性在以上 ，而与中国广东分离物 基因同源性最低 ，为（表）。从构建的基因序列进化树可以看出 ，分离物基因与中国大部分地区基因在一个分支上 。不同地区的 基因序列存在一定差异 ，同一国家的 基因序列亲缘关系较近 ，亚洲地区的 基因亲缘关系较近 ，亚洲与欧洲 基因亲缘关系相比较远 （图）。这个结果与的基因有相似之处 。卷第 期 王志荣等：陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测图 基于 基因核苷酸序列构建的 与其他 个地区分离物 基因的系统进化树 表 用于序列比较和进化分析的 类热激蛋白 基因序列信息 病毒分离物 登录号 地理来源 同源性 韩国 日本 韩国 韩国 韩国 韩国 韩国 中国 中国 中国 中国 中国 中国 中国 中国 中国 美国 中国 中国 中国 中国 美国 中国 中国 中国 中国 中国 中国 中国 巴西 中国 韩国 韩国 希腊 中国 韩国 西班牙 西班牙 西班牙 西班牙 西班牙 中国 讨论本研究对西北地区陕西杨凌番茄疑似感病株进行分子检测 ，确定该地区番茄已经感染，而且有扩大的趋势 。提醒西北地区番茄生产者注意该病毒病的危害 ，加强防控 ，减少经济损失 。本研究对陕西省杨凌分离物的外壳蛋白基因 （登 录 号 ：）和 类 热 激 蛋 白基因 （登录号 ：）片段进行克 隆 与 序 列 分 析 ，基因序列与中国各地区分离物同源性较高 ，和山东青岛 、山西晋中分离物基因同源性达到，相比之下 ，与欧洲其他国家同源性较低 。基因与中国各地区及亚洲地区的韩国 、日本分离物同源性较高 ，而与欧洲国家分离物基因同源性较低 。由此可见 ，番茄褪绿病毒在不同地区其基因组保守区域有一定差异性 ，该差异是否影响其对作物的侵染作用尚不清楚 。近几年 ，番茄褪绿病毒病传播迅速 ，寄主范围也进一步扩大 ，除目前报道的茄科植物外 ，在国外有研究表明野生萝卜 、芝麻菜 （ ）、龙葵 、苦苣菜 、反枝苋 、藜等植物都是番茄褪绿病毒的寄主植物，但和番茄相比其传播病毒的效率较低 ，目前受该病毒危害最严重的仍是番茄。番茄褪绿病毒的传播介体主要是烟粉虱 ，而型烟粉虱是粉虱中传毒效率较高的传播载体。另外 ，番茄褪绿病毒还会和番茄黄化曲叶病毒一起复合侵染番茄 ，导致番茄严重减产甚至绝收 。在我国番茄褪绿病毒目前在 东 北 、华 北 、华 中 、华东和华南地区均有分布，现已蔓延至西北地区 。该病害在我国迅速传播的原因可能是带毒种苗的运输以及带毒烟粉虱的传播 。番茄褪绿病毒病具有暴发性和流行性 ，较难防治 。针对番茄褪绿病毒对番茄的侵害 ，在保护地中育苗和定植后利用目以上的网纱进行物理隔离 ，并从播种 、定植至采收的全过程喷施杀虫剂可防止各类烟粉虱对的传播 ，从而达到控制的目的 。在栽培管理方面 ，适当调整播种和定植期 ，高温 、干燥的气候条件对粉虱的发生 、繁殖及传播有利 ，各种植基地根据具体情况可适当提前或延迟定植时间 ，尽量避开粉虱的活动高峰期 ，选择无虫 、无毒健苗定植 ，严禁将带虫 、带毒苗移入棚室。防治的最好手段是利用抗病番茄品种 ，而国内外目前尚未有抗病品种育成的报道 ，因此培育抗番茄品种将是未来番茄育种的重点 。卷第 期 王志荣等：陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测图 基于 基因核苷酸序列构建的 与其他 个地区 分离物的系统进化树 参考文献 ， ， ： ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：王富 ，李文丽 ，王辉 番茄褪绿病毒病与黄化曲叶病毒病的区别及防控 长江蔬菜 ，（）：刘永光 ，魏家鹏 ，乔宁 ，等 番茄褪绿病毒在山东暴发及其防治措施 中国蔬菜 ，（）： ， ， ， ，： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，：， ， ，： ， ， ，（）：王志荣 ，王孝宣 ，杜永臣 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