番茄叶片DNA提取_SSR_PCR反应体系优化及引物筛选

分 子植物育种， 2018 年，第 16 卷，第 7 期，第 2230- 2236 页Molecular Plant Breeding, 2018, Vol.16, No.7, 2230- 2236基金组织：本研究由宁夏回族自治区农业育种专项 (NXNYYZ20150303)、宁夏大学研究生创新试验 (GI2017039)和宁夏自治区农业育种专项 (NXNYYZ20150301)共同资助引用格式： Rui W.J., Wang X.M., Zhang Q.N., Zhang X.Q., Lv Y., Hu X.Y., Gao Y.M., and Li J.S., 2018, DNA extraction, optimizationof SSR-PCR reaction system and primer screening of tomato leaf, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 16(7): 2230-2236(芮文婧 , 王晓敏 , 张倩男 , 张学琴 , 吕原 , 胡学义 , 高艳明 , 李建设 , 2018, 番茄叶片 DNA 提取 、SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选 ,分子植物育种 , 16(7): 2230-2236)研究报告Research Report番茄叶片 DNA 提取 、SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选芮文婧1王晓敏1,2,3*张倩男1张学琴1吕原1胡学义3高艳明1,2,3李建设1,2,3*1 宁夏大学农学院 , 银川 , 750021; 2 宁夏设施园艺 (宁夏大学 )技术创新中心 , 银川 , 750021; 3 宁夏现代设施园艺工程技术研究中心 , 银川 , 750021* 通讯作者 , wangxiaomin_1981163.com; jslinxcnyahoo.com.cn摘 要 为了进一步开发利用番茄种质资源和开展分子标记辅助选择育种，本研究利用高通量组织研磨机研磨微量叶片，通过改良 CTAB 法快速提取 DNA，并利用 L16(45)正交设计试验，综合采用直观量化分析和方差分析两种方法，分析 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 、引物 、模板 DNA 浓度 5 个因素对番茄 SSR-PCR 扩增的影响，比较不同处理组合扩增效果的差异，最终筛选与验证最优的番茄 SSR-PCR 反应体系，并在此体系下对SSR 引物进行筛选 。结果表明番茄 SSR-PCR 最佳反应体系 (20L)为 Mg2+3.0 mmol/L、dNTPs0.4 mmol/L、TaqDNA 聚合酶 0.5 U、引物 0.5 mol/L、模板 DNA 40 ng；且利用优化后的反应体系，从 540 对 SSR 引物中筛选出 373 对 (占 69.07%)扩增条带清晰 、多态性丰富的引物 。该 SSR-PCR 体系的建立为番茄种质资源遗传多样性分析，品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序 。关键词 番茄 , 正交设计 , SSR-PCR, 体系优化 , 引物筛选DNA Extraction, Optimization of SSR-PCR Reaction System and PrimerScreening of Tomato LeafRuiWenjing1WangXiaomin1,2,3*ZhangQiannan1ZhangXueqin1Lvyuan1HuXueyi3GaoYanming1,2,3Li Jianshe1,2,3*1 School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan, 750021; 2 Ningxia Facility Horticulture (Ningxia University) Technology Innovation Center,Yinchuan, 750021; 3 Ningxia Modern Faciliry Horticulture Engineering Technology Research Center, Yinchuan, 750021* Corresponding authors, wangxiaomin_1981163.com; jslinxcnyahoo.com.cnDOI: 10.13271/j.mpb.016.002230Abstract In order to further develop and utilize tomato germplasm resources and carry out molecular marker-assisted selection breeding, few fresh tomato leaves were grinded by high throughput tissue grinding machine, andtotal DNA of tomato were extracted rapidly by a modified CTAB method. A research about the impacts of 5reactionfactors(Mg2+,dNTPs,TaqDNApolymerase,primerconcentrationsandDNAtemplate)onSSR-PCR ampli-fication of tomato was carried out by using an orthogonal experimental design of L16(45), visual quantitative analysisand analysis of variance. The effect of different treatment combinations were compared, the optimized tomatoSSR-PCR reaction system was selected and verified, and the SSR primers were screened under this system. TheresultsshowedthattheoptimalSSR-PCRreaction mixture wasasfollows: 20 Ltotal volume including3.0 mmol/LMg2+, 0.4 mmol/L dNTPs, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.5 mol/L primer, and 40 ng template DNA. 373 pairs ofSSR primers with clear and rich polymorphic bands were screened from 540 pairs of primers (69.07%) using theoptimized reaction system. The establishment of this optimal system for SSR-PCR would provide a standardprotocol for the investigation on genetic diversity analysis of germplasm resources, cultivar identification, and番 茄是全世界广泛栽培的蔬菜，也是中国主要栽培蔬菜之一，为了明确番茄种质资源之间的亲缘关系，选育优良品种，有必要对番茄种质资源进行分类定位，系统分析 。分子标记技术育种已经成为目前番茄育种中极为重要的工具 。快速提取植物 DNA 是分子生物学最基本的操作，高质高量的 DNA 样品的获取是进行 PCR 扩增 、限制性酶切 、遗传多态性分析 、分子杂交 、以及基因组学等分子生物学研究的基础 。因此，获取高质高量的 DNA 显得极其重要 (李金璐等 , 2013)。由于番茄叶片中含有严重影响 DNA提取质量的酚类，蛋白和多糖等物质，传统的 DNA提取方法需要用液氮和研钵研磨，反复抽提，在进行大量样本分析时， DNA 的提取浪费较多时间和样本，而且也不能很好地去除酚类物质，致使 DNA 样品褐化，对 PCR 的分析结果造成一定的影响 (王飞等 , 2006)。简单序列重复 (simple sequence repeats, SSR)，是以 16 个碱基为基本单元的串联重复序列，在植物基因组中广泛分布 (LittandLuty,1989;Tautz,1989)。SSR标记具有许多其他分子标记技术无法比拟的优势，如包含的信息含量高，分布比较广泛，呈共显性遗传，以孟德尔方式遗传，操作简单，特异性强，对 DNA要求低，重复性好等特点 (何仁锋等 , 2015)。因而近几年被广泛的应用到加工番茄 (王柏柯等 , 2014)，茄子(韩洪强 , 2009)，辣椒 (罗玉娣 , 2006)等蔬菜的遗传多样性分析，遗传图谱的绘制和基因标记等研究领域 。但其反应条件容易受其他因素干扰，从而影响整个实验的结果 。目前关于 SSR 体系优化的方法有很多种，单因素设计试验不能考察 PCR 体系中各组分的交互作用，也不能完全保证各组分最佳处理组合后就是最佳反应体系；完全组合设计要做大量的 PCR 扩增工作，试验周期长，正交设计克服了这些缺陷，能够很好的建立最优反应体系 (王欢欢等 , 2009, 江苏农业科学 , 2(78): 48-50)。因此，利用正交试验建立适合番茄的 SSR-PCR 检测体系是进一步探究番茄分子多态性与遗传多样性的技术基础与前提条件 。本研究拟采用一种高质量番茄基因组改良 CTAB快速微量提取方法，通过 SSR-PCR 反应体系中 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 、引物 、模板 DNA 量五因素四水平 L16(45)正交试验，以期筛选出的番茄 SSR-PCR反应体系重复性好，稳定性高且多态性丰富，同时利finger printing construction of tomato.Keywords Tomato, Orthogonal design, SSR-PCR, System optimization, Primer screening用优化的反应体系进行多态性引物筛选，以期为番茄种质资源遗传多样性评价 、亲缘关系研究，品种鉴定，系统分类提供科学依据 。1 结果与分析1.1 DNA的提取质量检测1.1.1 DNA 浓度和纯度的检测用核酸蛋白检测仪测得的番茄叶片 DNA 的浓度和纯度， DNA 样品的浓度 A260/A280比值均在 1.82.0之间， A260/A230比值均大于 2.0，研究表明提取的 DNA杂质少，纯度较好 (表 1)。1.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测 (图 1)提取到的 10 份番茄叶片基因组 DNA (稀释到 100 ng/L 左右 )，显示所有序号No.12345678910浓度 (ng/L)Concentration (ng/L)90.10200.30230.10175.50278.00178.60260.00186.21241.21177.74A260/A2801.9221.9371.9231.9661.9291.9471.9211.9311.9561.869A260/A2302.0482.2342.1802.2592.1012.2422.1342.1802.2342.221表 1 10 份番茄 DNA 样品的浓度和纯度Table 1 The concentrations and purities of 10 DNA samples oftomato图 1 番茄叶片 DNA 的凝胶电泳检测注 : M: DL2000 DNA marker; 110: 10 份番茄 DNAFigure 1 The electrophoretogram of DNA samples of tomatoNote: M: DL2000 DNA marker; 110: Stand for DNA samples番茄叶片 DNA 提取 、SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选DNA Extraction, Optimization of SSR-PCR Reaction System and Primer Screening of Tomato Leaf2231分 子植物育种Molecular Plant BreedingDNA 样品均只有 1 条清晰并且完整的带，质量高，完整性好，能满足 SSR-PCR 分析的需要 。1.2 正交试验设计的电泳分析采用 L16(45)正交设计的方法对影响 PCR 扩增结果的 5 个因素设置 4 个不同的水平，对组成的 16 个不同处理进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示， 16 个不同处理的最终电泳条带差异明显 (图 2)。其中处理11 几乎看不到扩增条带，处理 1， 2， 12 和 14 得到的电泳条带背景颜色相对其他处理较模糊，处理 3 和 13 重复性和稳定性差，其余处理条带数量丰富，清晰度高 。据此对 16 个处理的 3 次重复进行独立打分，计算其平均值，所得结果依次为： 2.67， 4.00， 7.68， 11.33，6.67， 6.33， 3.33， 4.00， 5.00， 3.33， 1.00， 3.67， 6.33， 3.67，9.00， 9.00。1.2.1 SSR-PCR 正交试验直观分析假设各个因素之间不存在交互作用，根据试验的打分结果进行直观分析，试验的各个处理的平均值能够反映各因素对反应体系的影响情况，计算同一影响因素不同水平打分结果的均值和极差 (表 2)，极差越大，表明该因素对 PCR 扩增结果的影响越显著，最终结果表明引物对番茄 SSR-PCR 反应体系影响最大，各因素影响程度依次为：引物 >Mg2+>dNTPs>Taq酶 >模板 DNA。各因素的最佳水平 (表 2)，即 Mg2+、dNTPs、Taq 酶和引物都以水平 4 最佳，模板 DNA 量以水平 3 最佳，综合以上结果分析可以选出最优组合 。1.2.2 SSR-PCR 正交试验设计的方差分析直观分析不能很好的估计在试验过程中出现的许多无法避免的误差 。因此对结果利用 SPSS 20.0 进行方差分析 (表 3)，结果表明 Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶 、引物 、模板 DNA 量这 5 个因素对 PCR 扩增图 2 SSR-PCR 反应体系正交试验电泳注 : M: DL2000 marker; 116: 16 个处理依次编号 ; A,B,C: 16个处理的 3 次重复Figure 2 Electrophoretogram of tomato by SSR-PCR orthogonaldesignNote: M: DL2000 marker; 116: 16 treatment followed by num-ber; A,B,C: 16 treatment of three replicates水平Levels1234极差RangeMg2+6.4175.0833.2507.0003.750dNTPs5.1674.3335.2507.0002.667Taq 酶Taq polymerase4.7505.8335.0836.6671.333引物Primer3.3333.8336.6677.9174.583模板 DNATemplate DNA4.7505.3336.0005.6671.250因素Factors表 2 番茄 SSR-PCR 正交试验 L16(45)均值和极差Table 2 The mean and range of SSR-PCR reaction of tomato byan orthogonal design L16(45)结果影响均十分显著，方差分析的 PCR 各因素对本体系的影响与直观分析结果一样，引物浓度对扩增影响最大，模板 DNA 对扩增影响最小，最终结果显示，误差对本试验结果影响较小，试验结果可行 。1.2.3 五因素各水平的综合优化直观分析和方差分析得出的结果一致，最后结果都表明，对番茄 SSR-PCR 扩增影响最大的因素是引物浓度 。研究表明，在 0.20.5 mol/L 范围内， PCR扩增产物随着引物浓度的增加而增加，引物浓度以0.5 mol/L 为最佳反应水平 。对番茄 SSR-PCR扩增反应影响其次为 Mg2+，本研究表明 Mg2+在 3.0mmol/L，其PCR 扩增的条带均优于其他水平 。dNTPs 浓度是另一个影响番茄 SSR-PCR 的重要因素， dNTPs 浓度大小直接影响 PCR 扩增产物的多少 (图 2)，当 dNTPs 浓度在 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L 的时候，都有扩增产物，但以0.4 mmol/L 时最优 。2232误 差来源Source校正模型Corrected model截距InterceptMg2+dNTPTaq 酶Taq Polymerase引物Primer模板 DNATempletDNA误差Error总计Total校正的总计Corrected total 型平方和SS345.1461 419.18899.72945.22914.062175.89610.229208.6671 973.000553.812自由度DF15133333324847均方MS23.0101419.18833.24315.0764.68758.6323.4106.521-F3.529217.6395.0982.3120.7198.9910.523-显著性P 值Sig.0.0010.0000.0050.0950.5480.0000.670-表 3 番茄 SSR-PCR 正交实验方差分析Table 3 Variance analysis for the different factors of SSR-PCRreaction注 : 可决系数 R=0.623 (调整的可决系数 R=0.447)Note: R squared=0.623 (adjusted R squared=0.447)Taq DNA 聚合酶的活性和用量是 SSR-PCR 反应中重要因子之一，其用量直接影响 PCR 扩增反应的成败，研究表明，当 Taq DNA 聚合酶用量为 0.5 U和 1.0 U 时 PCR 扩增的产物稳定性基本一致，条带丰富且清晰明亮，但从节约成本角度考虑， Taq DNA 聚合酶用量为 0.5 U 时，就能保证 PCR 的扩增正常 。在PCR 反应中适宜的模板 DNA 量是保证反应正常进行的前提，模板 DNA 量太多会增加非特异性扩增产物，对 Mg2+的有效浓度产生影响，量少又会导致 PCR扩增得到的电泳条带太弱或试验失败 。本研究表明在20 L 番茄 SSR-PCR 反应体系中模板 DNA 量为40 ng 时， PCR 扩增条带最优 。方差分析结果显示，模板 DNA的 F 值小于 P值，表明在 2050ng范围内，模板 DNA 浓度变化对 SSR 扩增几乎无差异 。综上所述，筛选出的理论上最优的番茄 SSR-PCR反应体系 (20L)为 0.5mol/L 引物 、3.0mmol/LMg2+、0.4mmol/LdNTPs、0.5UTaqDNA聚合酶 、40ngDNA。1.3 最优反应体系扩增稳定性 、适用性验证将上述得出的理论最优反应体系处理 17 与 16 个处理中打分最高的处理 3 进行比较，并对其结果 (图 3)再次打分，处理 3 与处理 17 的平均得分分别为 11.34和 12.67，最终结果显示处理 17 的反应体系得分均高于前面所有处理，表明处理 17 扩增效果最佳，为最优反应体系 。同时随机选取 1 份番茄 DNA 样品，运用前期已筛选出的 ND264- ND267 这 4 对多态性引物，利用处理 17 反应体系，进行 PCR 扩增检测多态性 。4 个引物的电泳条带均相对清晰 、质量较好 (图 4)。说明该番茄 SSR-PCR 反应体系适用性较强，可以用于番茄的分子生物学研究中 。1.4 SSR-PCR 引物筛选本实验室选择处于不同类群的 4 种番茄材料为DNA 为模板，利用最优 SSR-PCR 体系对收集到的540 个引物进行多态性筛选，最后成功筛选出 373 对(占 69.07%)目标条带清晰，多态性丰富，稳定的SSR 引物 。2 讨论传统研钵研磨需要叶片样本 0.1 g，样本用量大，研磨时间长 (510 min/ 样本 )，需液氮，样本损耗严图 3 SSR-PCR 反应体系正交试验电泳注 : M: DL2000 marker; 17: 理论最优反应体系 ; 3: 16 个处理中打分最高的处理 3Figure 3 Electrophoretogram of tomato by SSR-PCR orthogonaldesignNote: 17: M: DL2000 marker; Theoretical optimal reaction sys-tem; 3: The highest score in 16 treatment is 3图 4 4 对引物的 SSR-PCR 扩增注 : M: DL2000 marker; ND264ND267 为 4 对 SSR 引物Figure 4 SSR-PCR amplification of four pairs of primersNote: M: DL2000 marker; ND264ND267 are 4 pairs of SSRprimers番茄叶片 DNA 提取 、SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选DNA Extraction, Optimization of SSR-PCR Reaction System and Primer Screening of Tomato Leaf2233分 子植物育种Molecular Plant Breeding重 。本研究采用的番茄叶片快速微量提取 DNA 的方法利用高通量组织研磨机，仅使用微量的叶片样本0.02 g，研磨时间仅 3 min/384 个样本，效率高，无需液氮与苯酚，简化了步骤，大大节约了时间，且提取的 DNA 纯度与完整性好，浓度高，能够满足后续PCR 需要 。在番茄辅助育种和基因组研究中 SSR 分子标记技术目前已经成为比较成熟和应用广泛的标记技术之一， Mg2+、dNTPs、Taq 酶 、引物浓度及模板 DNA 量等因素会对 PCR 扩增结果产生影响 。因此，建立最优 SSR-PCR 的反应体系，利用优化的反应体系进行多态性引物筛选是利用 SSR 分子标记进行番茄种质资源遗传多样性评价 、亲缘关系研究，品种鉴定和系统分类的基础 。有关 SSR-PCR 反应体系优化的研究很多 (苏辉等 , 2009; 龙萄等 , 2016)，不同植物 SSR-PCR反应体系不相同，即使是同一植物，不同研究者也会得出不同结论，这可能跟仪器 、试剂 、实验环境以及操作人员有关，故而筛选出适合自己的 SSR 体系尤为重要 (龙萄等 , 2016)。本研究对影响番茄 SSR-PCR 反应的 5 个因素采用正交试验设计对 4 个不同水平进行优化，建立稳定 、重复性好的 SSR-PCR20L 反应体系： 0.5mol/L引物 、3.0 mmol/L Mg2+、0.4 mmol/L dNTPs、0.5 U TaqDNA 聚合酶 、40 ng DNA。同时，从试验结果看出，试验中各个因素对番茄SSR-PCR 体系的影响排序依次为引物 >Mg2+>dNTPs>Taq 酶 >模板 DNA，其中引物浓度相对其他 4 种因素对 PCR 扩增的影响最大，这与赵建涛等 (2014, 黑龙江农业科学 , (12): 15-18)的研究结果相似；游离的Mg2+对 PCR 扩增效果间接影响，主要通过影响 Taq酶活性，同时影响 DNA 模板和引物退火和解链的温度，进一步影响扩增的真实性和产物的特异性 (吴春燕等 , 2013)。本研究得出的 3.0 mmol/L Mg2+浓度与何仁锋等 (2015)对药用菊花 SSR-PCR 反应体系优化得到最佳 Mg2+浓度一致 。其次，一般而言， DNA 纯度对反应体系影响较大，本研究所用的模板 DNA 纯度高，因此在满足纯度的基础上，适量的模板 DNA 不会对反应体系产生显著影响 。同时本研究用 1 份番茄种质采用 4 对引物对优化后的最优体系进行验证，均能获得清晰稳定的扩增，优化后的体系为进一步应用于番茄基因定位 、品种鉴定 、遗传多样性分析及遗传图谱构建提供依据 。另外，本研究利用 SSR-PCR 最优体系从收集到的540对 SSR 引物中成功筛选出 373 对 (占 69.07%)稳定性好，多态性高，条带清晰的 SSR 引物，为下一步 SSR自动毛细管电泳检测番茄种质资源的遗传多样性提供帮助 。3 材料与方法3.1 试验材料与仪器设备以宁夏大学农学院园林系蔬菜课题组和宁夏巨丰种苗有限责任公司收集的番茄种质资源幼苗为材料，摘取其幼嫩叶片，- 80保存备用 。DNA 提取的试验选取 10 份材料，引物筛选以番茄形态标记的聚类结果为依据 (芮文婧 , 2017, 私人通讯 )，选择不同类群4 种番茄材料为 DNA 模板，体系优化随机性抽取一份番茄材料为固定 DNA 模板 。SSR 引物由北京奥科生物技术有限公司合成， PCR 所用 dNTPs (10 mmol/L)、Taq DNA 聚合酶 (5 U/L)购自 TaKaRa 公司 、Mg2+(25 mmol/L)、10PCR Buffer、DL2000 marker 均购自Thermorfisher 公司， PCR 仪为 ProFlexTM购自美国Life Technologies (ABI)公司，琼脂糖凝胶电泳仪为北京六一仪器厂 DYY- 10C 型 。高通量组织研磨机Geno2010，高速离心机 Sigma1- 14，核酸蛋白检测仪Q6 000，凝胶成像系统 Bio Gel Doc XR+。3.2 番茄叶片 DNA 的提取与检测参照张晓祥等 (2012,中国农学通报 ,28(36):46-49)小麦叶片 DNA 的方法，并略作修改，将 600L 提前预冷的 2CTAB 提取液加入 2 mL 的离心管中 (10 gCTAB 溶于去离子水中 , 加入 50 mL 1 mol/L 的 Tris-HCl, 280 mL 2.5 mol/L 的 NaCl, 1 mL - 巯基乙醇和40 mL0.25 mol/L 的 EDTA-Na, 定容至 500 mL)；取番茄幼苗叶片 (1 cm2, 约 0.05 g)放入缓冲液中，加 2 枚直径为 0.45mm 的小钢珠，研磨机以 1400strokes/min 速度研磨 2 min；在 65水浴保温 2030 min，自然条件下冷却后加入 600 L 氯仿 :异戊醇 (24:1)，充分摇匀后冰上放置 10 min，以 12 000 r/min 的速度离心10 min，将上清液转入另一离心管；加入与上清液等量的预冷的异丙醇摇匀，在 - 20下保存 30 min，以12 000 r/min 的速度快速离心 10 min；小心缓慢的倒掉上清液，用 300L 70%乙醇连续洗涤沉淀 3 次，每次高速离心 1 min 后，倒掉上清液乙醇，放于超净工作台吹干，加 200 L 1TE 或灭菌的 ddH2O 溶解，- 20保存备用 。利用核酸蛋白检测仪直接检测 DNA 的浓度和A260/A280、A260/A230的值 。取 5 L 的 DNA 母液加 1 L上样缓冲液 Loading Buffer， Gelred 进行染色，上样于22342%的琼脂糖，以 DL2000 marker 为标准，在 1TAE的电泳缓冲液中进行水平板电泳， 100 V恒电压，电泳约 40 min，凝胶成像系统进行拍照检测 。3.3 SSR-PCR 扩增及体系优化Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 、引物浓度及模板DNA 量会对 PCR 的最终扩增结果产生影响，为了得到准确 、客观的 PCR 结果，首先应该摸索出适宜的PCR 反应条件再进行大量样本扩增 (周海兰 ,2016)。采用 L16(45)正交试验设计，对影响番茄 SSR-PCR 反应体系的 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶 、引物浓度及模板 DNA 量等 5 个因素设置 4 个不同水平 (表 4;表 5)，总计 16个处理，每个处理 3次重复，扩增体系为 20L，每个处理加不含 Mg2+的 10PCR Buffer 2.0 L，用ddH2O 将 20 L 体系补充完整 。体系优化，引物采用 ND547 (CCTTTTTAGGCGTTCCAGA; GTGAATTTAGCTGTGGGGGA)为固定引物， PCR 扩增程序为： 95预变性 5 min 1 个循环； 95变性 30 s， 55退火 30 s， 72延伸 45 s，进行 35 个循环；接着 72延伸 10 min， 4保存；用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测最终的 PCR 产物， 100 V 恒电压，电泳 50 min， Bio Gel Doc XR+凝胶成像系统观察并拍照 。3.4 数据统计与处理根据电泳条带的亮度 、清晰度 、数量以及背景颜色，参照湛欣等 (2016)的方法对电泳结果进行综合打分：电泳条带最优的记满分 16 分，最差的仅记 1 分 。计算 3 次重复结果的平均值和每个因素各水平的得分均值与极差 。对电泳结果进行直观分析和方差分析；方差分析运用 SPSS 20.0 来计算 。根据 F 值的大小判断各因素对反应效果的影响，根据直观分析和方差分析确定最适反应体系 。表 5 SSR-PCR 正交设计实验 L16(45)Table 5 L16(45) orthogonal design for SSR-PCR处理Treat-ment12345678910111213141516Mg2+(mmol/L)1.51.51.51.52.02.02.02.02.52.52.52.53.03.03.03.0dNTPs(mmol/L)0.10.20.30.40.10.20.30.40.10.20.30.40.10.20.30.4Taq 酶 (U)Taq DNApolymerase (U)0.250.500.751.000.500.251.000.750.751.000.250.501.000.750.501.00引物 (mol/L)Primer(mol/L)0.20.30.40.50.40.50.20.30.50.40.30.20.30.20.50.4DNA(ng)20304050504030203020504040502030因素Factors表 4 SSR-PCR 反应的因素水平Table 4 Factors and levels of SSR-PCR reaction systems水平Level1234Mg2+(mmol/L)1.52.02.53.0dNTPs(mmol/L)0.10.20.30.4Taq 酶 (U)Taq DNApolymerase (U)0.250.500.751.00引物 (mol/L)Primer(mol/L)0.20.30.40.5DNA(ng)20304050因素Factors3.5 反应体系的稳定性验证及 SSR-PCR 引物筛选对优化好的体系，随机选取 1 份番茄 DNA 样品，运用已筛选出的 4 对多态性引物，在已优化的 PCR反应体系中进行 PCR 扩增，检测其多态性，进而验证番茄 SSR-PCR 的体系优化结果 。选取四个不同类群的番茄，利用所得最佳的番茄SSR-PCR 反应体系，对从 NCBI 数据库中收集到的540 对番茄 SSR 引物进行多态性引物筛选，选取稳定性高 、重复性好 、多态性高的引物合成荧光引物，为下一步 SSR 自动毛细管电泳检测奠定基础 。作者贡献芮文婧为本试验研究的执行人，完成数据分析和初稿的撰写；王晓敏和李建设是项目的构思者及负责人，并进行论文的修改；胡学义，高艳明指导试验设计 、数据分析；张倩男，张学琴，吕原参与了本试验的研究执行工作和论文校正 。全体作者都阅读并同意最终的文本 。致谢本研究由宁夏回族自治区农业育种专项 (NXNY-YZ20150303)、宁夏大学研究生创新试验 (GI2017039)番茄叶片 DNA 提取 、SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选DNA Extraction, Optimization of SSR-PCR Reaction System and Primer Screening of Tomato Leaf2235分 子植物育种Molecular Plant Breeding和宁夏自治区农业育种专项 (NXNYYZ20150301)共同资助 。参考文献Han H.Q., 2009, Analysisofgenetic diversityofeggplant (Solanummelongena L.) by morphological markers and SSR markers,Thesis for M.S., Shanghai Jiaotong University, Supervisor:Cheng H.Y., pp.1-36 (韩洪强 , 2009, 利用形态学标记和SSR 分子标记分析茄子种质资源遗传多样性 , 硕士学位论文 , 上海交通大学 , 导师 : 陈火英 , pp.1-36)He R.F., Feng S.G., Chen Z., Shen X.X., Shen Y.F., Wang Z.,and Wang H.Z., 2015, Optimization and Ppimer screening ofSSR-PCR reaction system in medicinal chrysanthemummorifolium based on orthogonal design, Fenzi ZhiwuYuzhong (Molecular Plant Breeding), 13(2): 367-378 (何仁锋 , 冯尚国 , 陈喆 , 沈晓霞 , 沈宇峰 , 王志安 , 王慧中 , 2015,药用菊花 SSR-PCR 反应体系优化及引物筛选 , 分子植物育种 , 13(2): 367-378)Li J.L., Wang S., Yu J., Wang L., and Zhou S.L., 2013, Amodified CTAB protocol for plant DNA extraction, ZhiwuXuebao (Chinese Bulletin of Botany), 48(1): 72-78 (李金璐 ,王硕 , 于婧 , 王玲 , 周世良 , 2013, 一种改良的植物 DNA 提取方法 , 植物学报 , 48(1): 72-78)Litt M., and Luty J.A., 1989, A hypervariable microsatelliterevealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeatwithin the cardiac muscle actin gene, Am. 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