黄瓜白粉病菌拮抗真菌鉴定及生防效果评价

33(3)427-432               中国生物防治学报  Chinese Journal of Biological Control                    2017 年 6 月  收稿日期： 2016-11-30 基金项目：甘肃省国际科技合作专项（ 1604WKCA010） ；甘肃省农牧厅生物技术专项（ GNSW-2013-19） ；国家重点研发计划（ 2016YFD0201112）  作者简介：卢幸蓉，硕士研究生， E-mail： Luxingrong589126.com； *通信作者，教授， E-mail： xublgsau.edu.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2017.03.019 黄瓜白粉病菌拮抗真菌鉴定及生防效果评价 卢幸蓉，陈大为，张树武，刘  佳，徐秉良*（甘肃农业大学植物保护学院 /甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州  730070）  摘要： 本文对黄瓜白粉病菌 Sphaerotheca fuliginea 拮抗真菌进行了筛选和鉴定及防治效果的评价。结果表明，从侵染黄瓜叶片的白粉病菌菌落边缘组织中共分离获得 21 个菌株，其中菌株 JK13 对白粉病菌具有较高的拮抗活性。菌株 JK13 发酵液处理白粉菌孢子 48 h 后，其对孢子萌发抑制率为 89.93%；发酵液处理发病的离体叶片和盆栽幼苗 7 d 后，其防治效果分别为 88.02%和 76.34%。利用形态学和分子生物学技术鉴定该菌为腐皮镰刀菌 Fusarium solani。  关   键   词： 黄瓜白粉病；拮抗真菌；鉴定；生物防治 中图分类号： S476   文献标识码： A    文章编号： 1005-9261(2017)03-0427-06 Identification of Antagonistic Fungus against Sphaerotheca fuliginea and Evaluation of Its Biocontrol Efficacy  LU Xingrong, CHEN Dawei, ZHANG Shuwu, LIU Jia, XU Bingliang*(College of Plant Protection, Gansu Agricultural University/Bio-control Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province, Lanzhou 730070, China) Abstracts: The antagonistic fungus against the pathogen Sphaerotheca fuliginea were isolated and assessed in this paper. The resulted showed that 21 strains of antagonistic fungus were isolated from the edge of cucumber tissue infected by S. fuliginea. Among all the isolated strains, the strain JK-13 presented the highest control efficacy in vitro and greenhouse experiments. The inhibitory rate on S. fuliginea spores germination was 83.93% after treated by strain JK-13 fermentation broth for 48 h. The control efficacy of strain JK-13 fermentation broth on S. fuliginea were 88.02% and 76.34% after treated for 7 d by leaf disc and pot experiments, respectively. Based on the morphological characteristic and molecular identification, the strain JK-13 was identified as Fusarium solani. Key words: cucumber powdery mildew; antagonistic fungus; identification; biological control  白粉病是黄瓜栽培过程中常见病害之一，在全国各地均有发生，尤其北方温室和大棚内最易发生。因白粉病影响叶片的光合作用，对黄瓜生长后期造成很大的产量损失，发病严重时可引起 50%的产量损失，甚至造成绝产1。随着温室黄瓜栽培面积的逐年增加，黄瓜白粉病的危害也更加广泛。目前，黄瓜白粉病的防治主要依靠杀菌剂和抗病品种并结合一些简单的农业措施，但是随着杀菌剂长时间的大量使用，白粉病菌对很多药剂都产生了不同程度的抗性，防治效果开始大幅降低，同时，化学杀菌剂的长期大量使用对环境造成严重的污染，危害人畜健康。鉴于化学防治的不足，迫使人们寻求黄瓜白粉病新的防治措施。因此，具有环境友好、安全等特性的生物防治药剂已成为国内外黄瓜白粉病防治研究的新趋势2。  杨春林等3研究表明，哈茨木霉 Trichoderma harzianum TH30 对黄瓜白粉病具有良好的生物防治效果，可有效控制黄瓜白粉病在田间扩展，相对防效达 69.9% 78.8%，且对供试植株安全；孙睿揆等4从土壤中分离筛选出短小芽胞杆菌 Bacillus pumilus 对辣椒白粉病菌 Oidiopsis sicula 的防治效果达 60.8%；伊艳428             中  国  生  物  防  治  学  报    第 33 卷  杰等5从小麦茎叶组织中分离到拮抗真菌镰孢霉属 Fusarium sp.和曲霉属 Aspergillus sp.对小麦白粉病菌Blumeria graminis 防治效果分别为 82.14%和 88.49%。然而，目前有关黄瓜白粉病菌拮抗真菌鉴定及生防效果评价等方面的研究报道较少。因此，本研究从侵染黄瓜叶片的白粉病菌菌落边缘组织进行拮抗真菌的分离、筛选和鉴定，并通过室内和盆栽测定了拮抗菌株对黄瓜白粉病的防治效果，旨在为今后黄瓜白粉病的生物防治奠定基础。  1  材料与方法  1.1  供试材料  黄瓜白粉病菌 Sphaerotheca fuliginea 由甘肃农业大学植物保护学院病理学实验室提供。供试黄瓜品种新春四号（感病品种），由山东省宁阳县新华研种子公司提供。  1.2  黄瓜白粉病菌拮抗菌株分离、纯化及单孢分离  将室内已发白粉病的黄瓜叶片经无菌水冲洗干净后晾干，并在无菌条件下将黄瓜叶片白粉病菌菌落边缘组织处切成 0.5 cm2的小块用 75%酒精进行消毒处理，然后，将切取的组织接种于马铃薯培养基（ PDA）进行拮抗真菌的分离，并置于 28 的恒温培养箱中培养， 7 10 d 后，待平板培养基上组织边缘有菌丝长出后，在无菌条件下，进行单孢分离6，将菌种产生的孢子用无菌水洗脱并稀释至每 10 L 悬浮液中有 1个孢子。滴在灭菌的载玻片上，在显微镜下检查。将只有 1 个孢子的悬浮液，移植到 PDA 培养基上， 7 d后获得纯化菌株，编号，并保存备用。  1.3  白粉病菌分生孢子悬浮液及其拮抗真菌发酵液制备  在超净工作台上用毛笔轻轻将黄瓜植株叶片上新鲜的分生孢子刷于盛有 0.5% SDS 水溶液的烧杯中，混匀后在 10 10 显微镜下镜检，配成孢子浓度为 1 107孢子 /mL 的分生孢子悬浮液。  分离获得的黄瓜白粉病菌拮抗菌株经 PDA 培养基活化后，打取菌饼（ d 0.5 cm）接种于装有 60 mL PDB 培养基三角瓶（ 150 mL）中，于 28 、 180 r/min 摇瓶培养 3 d 后，取上清液经 0.22 m 微孔过滤器过滤，收集发酵滤液（原液）， 4 保存备用。  1.4  初筛试验  采用孢子萌发抑制法7。将直径为 0.5 cm 灭菌的琼脂培养基放入预先制备好的各菌株发酵原液中浸泡24 h 后置于载玻片之上，以无菌水浸泡的培养基作为对照，然后将待测的黄瓜白粉病菌孢子悬浮液（ 1107孢子 /mL） 20 L 加入到该琼脂培养基，放入培养皿中保湿，置于 25 和 16 h 光照、相对湿度为 80%的人工气候箱中培养 48 h，镜检并计算孢子萌发抑制率，并将筛选出抑制效果较好的菌株作为复筛试验的供试菌株。试验每个处理和对照均重复 5 次。  1.5  复筛试验  采用叶圆盘法8和室内盆栽的方法。（ 1）采集长势相同的健康黄瓜叶片，在超净工作台上，将叶片用无菌水冲洗干净后， 在 0.1%升汞溶液中浸泡 60 s， 再放入 75%的酒精中消毒 30 s， 取出后用无菌水冲洗 34 次，待叶片晾干后，用打孔器将健叶打成直径为 1.5 cm 的叶圆盘，在各供试菌株发酵原液中浸湿，后在无菌条件下晾干，置于铺满脱脂棉（在 50 mg/L 的苯并咪唑溶液浸湿）的无菌培养皿中。用移液枪接种分生孢子悬浮液（ 1 107孢子 /mL） 10 L 于叶圆盘，置于 25 和 16 h 光照、相对湿度为 85%的人工气候箱中培养。每个处理 5 个重复，以无菌水为空白对照，并每天滴加营养液保持叶圆盘的湿润， 7 d 后统计病情指数。（ 2）各供试菌株的发酵原液喷施在 4 叶期健康的黄瓜幼苗上，每盆 3 株，共喷 50 mL。 24 h 后接种白粉孢子悬浮液（ 1 107孢子 /mL），共 20 mL。每个处理 5 盆， 3 次重复，以无菌水作为对照， 7 d 后统计病情指数。叶圆盘法和室内盆栽法叶面病情分级标准一致。  黄瓜白粉病叶面病情分级标准9： 0 级，叶片无病斑； 1 级，叶片病斑面积占整个叶面积的 5%以下； 3级，病斑面积占整个叶面积的 5% 15%； 5 级，病斑面积占整个叶面积的 15% 25%； 7 级，病斑面积占整个叶面积的 26% 50%； 9 级，病斑面积占整个叶面积的 51% 75%； 11 级，病斑面积占整个叶面积的76%以上。  病情指数 （各级病叶数各级代表值） /（调查总叶数发病最高级代表值） 100；防治效果（ %）  第 3 期               卢幸蓉等：黄瓜白粉病菌拮抗真菌鉴定及生防效果评价  429 （对照病情指数处理病情指数） /对照病情指数 100。  1.6  菌株 JK13 室内防病效果测定  分别利用 JK13 发酵液原液和 10 倍、 100 倍和 1000 倍稀释液喷施于四叶期健康的幼苗上， 每盆 3 株，共喷 50 mL， 24 h 后接种白粉病菌孢子悬浮液（ 1 107孢子 /mL），共 20 mL。每个处理 5 盆， 3 次重复，以无菌水作为对照， 7 d 后统计病情指数。  1.7  菌株 JK13 对黄瓜白粉菌孢子拮抗机制  采用离体叶片法进行试验，方法同 15。经菌株 JK13 发酵原液处理过的离体叶片，接种白粉菌后 5 d取样，并用直径为 0.5 cm 打孔器切下叶盘，按水合氯醛组织透明染色法6制样后，处理 2 d 后在显微镜下观察拍照，以无菌水作为对照。  1.8  菌株 JK13 鉴定  菌株鉴定采用形态学和分子生物学鉴定相结合。形态学鉴定参考真菌鉴定手册10，根据菌落的生长特性、颜色、菌丝的形态特征、孢子的形态、大小等进行鉴定。  分子生物学鉴定：采用 CTAB 法11提取菌株基因组 DNA，采用真菌通用引物 ITSF（ 5TCCGTAG GTGAACCTGCGG3）和 ITSR（ 5TCCTCCGCTTATTGATATGC3）12进行 ITS 序列扩增， PCR 扩增产物由上海生工生物工程技术服务有限公司纯化并测序，利用 Blastn（ http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/）与GenBank 数据库中的序列进行比对，获得相近菌株 rDNAITS 序列，利用 Clustalx 1.8 按照最高同源性的原则进行排序，采用 MEGA 5.0 软件 Neighborjoining 法构建系统发育树，并采用自举法（ bootstrap）对系统发育树进行检验，重复 1000 次。  1.9  数据统计与分析  数据采用 Excel 2007 软件进行统计分析和作图， 并采用 SPSS 19.0 软件和 Duncan 氏新复极差法进行多重比较（ P 0.05）。  2  结果与分析  2.1  拮抗真菌分离及其对孢子萌发的影响  根据菌落形态和颜色等特性，从已发病叶片病健交界处共分离纯化到 21 株真菌，编号分别为 JK1JK21。孢子萌发抑制结果表明，抑制率在 50%以上有 4 个菌株，分别为 JK11、 JK13、 JK18 和 JK21，其抑制率分别为 85.80%、 89.93%、 65.63%和 58.83%，其中 JK13 抑制率最高（表 1）。  表 1  不同拮抗真菌对黄瓜白粉病菌分生孢子萌发的抑制作用  Table 1  The inhibitory effect of different strains on the spore germination of S. fuliginea 菌株  Strains 抑制率  Inhibitory efficiency (%) 菌株  Strains 抑制率  Inhibitory efficiency (%) JK13 89.93 0.83 a JK12 39.97 0.29 de JK11 85.80 0.49 a JK4 38.87 0.83 de JK18 65.63 0.41 b JK9 38.73 0.34 de JK21 58.83 0.94 bc JK15 36.57 0.52 de JK6 47.20 0.18 cd JK14 34.83 0.17 de JK8 44.63 0.34 cd JK2 34.00 0.44 de JK20 43.80 0.61 cde JK10 32.90 0.17 de JK16 41.77 0.47 de JK7 27.53 0.63 ef JK5 40.43 0.88 de JK3 27.17 0.82 ef JK19 40.10 0.15 de JK1 15.20 0.32 f   JK17 40.03 0.18 de CK 13.27 0.52 f 注：同列数据后不同字母表示在 0. 05 水平上差异显著。下同。 CK 为无菌水。  Note: Data in the same column followed by different letters were significantly different at 0.05 level. The same as below. CK was sterile water. 430             中  国  生  物  防  治  学  报    第 33 卷  2.2  离体试验防治效果  对孢子萌发抑制试验筛选的 4 株真菌 JK11、 JK13、 JK18 和 JK21 进行离体叶片防治效果测定表明， 4 个菌株对白粉病均有一定的防治效果，且差异显著，其中 JK13 防治效果最佳，防效为 88.02%（表2），另经 JK13 发酵液处理过的叶片病斑数量明显低于对照（图 1）。  JK13 CK图 1  叶圆盘法测定菌株 JK-13 对黄瓜白粉病防治效果  Fig. 1  The control effect of entophytic fungi JK-13 on cucumber powdery mildew by leaf disc 2.3  室内盆栽试验防治效果  对孢子萌发抑制试验筛选出的 4 株真菌 JK11、 JK13、 JK18 和 JK21 进行室内盆栽防治效果试验，结果表明 4 株真菌处理后黄瓜幼苗的病情指数分别为 40.55、 20.18、 51.90、 46.84， 与对照之间存在显著差异。其中菌株 JK13 对黄瓜白粉病室内盆栽防治最佳为 76.34%，菌株 JK18 防治效果最差为 39.16%（表 3）。  表 2  4 株真菌对黄瓜白粉病离体叶片防治效果  Table 2  The control effect of four entophytic fungi strains on cucumber powdery mildew  菌株  Strains 病情指数  Disease index 防治效果  Control efficacy (%) JK11 34.93 0.23 d 59.99 0.55 b JK13 10.47 0.55 e 88.02 0.61 a JK18 49.19 0.25 c 43.68 0.47 c JK21 57.56 0.48 b 34.08 0.97 d CK 87.35 0.38 a 表 3  4 株真菌对黄瓜白粉病室内盆栽防治效果  Table 3  The control effect of four entophytic fungi strains on cucumber powdery mildew in greenhouse 菌株  Strains 病情指数  Disease index 防治效果  Control efficacy (%) JK11 40.55 0.59 d 52.46 0.57 b JK13 20.18 0.40 e 76.34 0.40 a JK18 51.90 0.78 b 39.16 0.82 d JK21 46.84 0.77 c 45.09 0.76 c CK 85.31 0.23 a 2.4  菌株 JK13 的鉴定  菌株 JK13 在 PDA 培养基上 25 培养，气生菌丝薄绒状，白至浅灰色；背面无色，有时产生蓝或绿色的色素圈；在 PDA 培养基上小型分生孢子数量多，呈卵形或肾形，直径（ 5.5 14.5） m（ 2.04.0） m；大型分生孢子马特型； 1 6 层隔膜，（ 7.0 56.0）（ 2.5 5.0） m；厚垣孢子呈球形，单生、对生或串生，直径 5 12 m；产孢细胞长筒形，单瓶梗，大多数瓶梗长于 45 m。腐皮镰刀菌菌落较平坦，全缘呈圆形，灰白色、淡蓝色或蓝褐色，有时可见清晰的圈带。菌丝稀疏至厚密，呈稀绒状。大型分生孢子产于分生孢子座上或气生菌丝单生瓶梗上，直或弯曲，多为不等边纺锤形， l 5 隔， 3 隔居多，呈马特型。小型分生孢子，孢子卵形或肾形，前期数量较多，以假头状着生于产孢细胞上， 0 1隔膜。厚垣孢子产自气生菌丝短侧生分枝的顶端，或在大型分生孢子中形成，进而初步鉴定菌株 JK13为腐皮镰刀菌 Fusarium solani10。  菌株 JK-13 经 rDNA-ITS 序列通用真菌引物 PCR 扩增后，经测序并通过利用 Blastn 对该序列和GenBank 中已登录的 rDNA-ITS 序列进行同源性比较，该菌与腐皮镰刀同源性均在 99%以上，将比对结果中相似性较高菌株序列与供试拮抗菌的序列一起用 DNASTAR 软件建立系统发育树（图 2）。通过分子生  第 3 期               卢幸蓉等：黄瓜白粉病菌拮抗真菌鉴定及生防效果评价  431 图 2  基于 18s rDNA 序列构建菌株 JK13 系统发育树  Fig. 2  Structuring phylogenetic tree of entophytic fungi strains based on 18s rDNA-ITS sequences homology 物学鉴定结果并结合其形态学特征，确定该菌为腐皮镰刀菌。  2.5  菌株 JK13 对室内盆栽黄瓜白粉病的防治效果评价  经上述孢子萌发抑制试验、叶圆盘法和室内盆栽防治试验后，获得对黄瓜白粉病有显著防治效果的菌株 JK13。不同稀释倍数的菌株 JK13 发酵液对黄瓜白粉病均有一定的防治效果，随着稀释倍数的增大，防治效果依次降低，菌株 JK13 发酵液原液对黄瓜白粉病防治效果最好，达 77.97%（表 4）。  2.6  菌株 JK13 对黄瓜白粉病菌的拮抗机制  通过水合氯醛组织透明染色处理以后，经显微镜观察发现，用菌株 JK13 发酵液原液处理后的白粉病菌分生孢子不萌发或停止萌发，分生孢子及分生孢子梗出现皱缩，而对照中白粉病菌分生孢子正常生长（图 3）。  表 4  菌株 JK13 对黄瓜白粉病的室内防治效果  Table 4  The control efficacy of entophytic fungi JK13 on cucumber powdery mildew in greenhouse 稀释倍数  Dilution 病情指数  Disease index 防治效果  Control efficacy (%) 原液  Stock solution 17.98 0.15 e 77.97 0.24 a 10 22.02 0.21 d 69.31 0.47 b 100 40.96 0.81 c 49.77 0.63 c 1000 77.63 0.59 b 4.77 0.13 d CK 81.53 0.59 a A： CK； B：菌株 Strain JK13 图 3  显微镜观察菌株 JK13 对黄瓜白粉病菌孢子形态的影响  Fig. 3  Microscope observation on the effects of strain JK-13 on the spore morphology of S. fuliginea  3  讨论  本研究通过利用叶盘法和室内盆栽试验进行初筛和复筛，获得一株对黄瓜白粉病具有较好防治效果的菌株 JK13，其平均防治效果为 82.18%，与前期研究结果基本一致。范瑛阁等13采用孢子萌发抑制试验测432             中  国  生  物  防  治  学  报    第 33 卷  定了 4 株生防细菌 H1、 H2、 H3和 H7对黄瓜白粉病防治效果，表明其防治效果分别为 91.25%、 87.77%、82.7%和 75.29%。 Gafni 等14研究发现，内生酵母菌 Pseudozyma aphidis 抑制病原菌生长主要通过产生菌丝体寄生于白粉病菌菌丝和孢子上，但本试验发现 JK13 发酵液能够导致白粉菌分生孢子停止萌发，分生孢子及分生孢子梗出现皱缩。  本研究结合形态学和分子生物学方法将菌株 JK13 鉴定为腐皮镰刀菌。 国内目前在镰刀菌生防应用方面也有相关报道，屈佳玉15分离得到茄腐镰刀菌的代谢物原液对大豆胞囊线虫 Heterodera glycines 2 龄幼虫的致死率为 96.8%；付洁等16研究表明禾谷镰刀菌 F. graminearum 毒素对油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum、 玉米大斑病菌 Exserohilum turcicum 和苹果褐腐病菌 Clerotinia fructigena 具有很强的抑制活性；段玉玺等17研究发现镰刀菌 Snef332 对南方根结线虫 Meloidogyne incognita 校正死亡率达 91.39%。除此之外，镰刀菌对杂草生防应用方面也有报道， Boari 和 Vurro18筛选出弯角镰孢菌 F. camptoceras 和厚垣镰孢菌 F. chlamydosporum 对分枝列当的防治效果可达 50%，筛选的尖孢镰刀菌 F. oxysporum 和腐皮镰刀菌对分枝列当的防治效果可达 60% 70%；李健等19研究表明厚垣孢镰刀菌对杂草马唐 Digitaria sanguinalis具有良好的防治效果，但是有关腐皮镰刀菌对黄瓜白粉病的防效目前尚未见报道。  因此，拮抗真菌腐皮镰刀菌发酵液在防治黄瓜白粉病上具有广阔的应用前景，但目前的研究仍处于初级阶段，还需进一步深入研究，如该菌发酵液在田间防治效果及防效稳定性、对植物的安全性、人畜毒性和生产加工工艺等问题。  参  考  文  献  1 Dik A J, VerhaarM A, Berlanger R R. 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