茄子青枯病抗性相关的E3泛素连接酶基因的筛选及鉴定.pdf

园艺学报 2023 50 10 2271 2287 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2022 0835 http www ahs ac cn 2271 收稿日期 2023 04 28 修回日期 2023 05 09 基金项目 广东省种业振兴项目 2022 NPY 00 026 广东省重点研发项目 2022B020208003 广州市重点研发项目 202103000085 广东省现代农业产业技术果菜产业体系创新团队项目 2022KJ110 通信作者 Author for correspondence E mail caobh01 茄子青枯病抗性相关的 E3 泛素连接酶基因的筛 选及鉴定 王亦栖 颜爽爽 余炳伟 甘雨薇 邱正坤 朱张生 陈长明 曹必好 华南农业大学园艺学院 农业农村部华南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室 广东省蔬菜工程技术研究 中心 广州 510642 摘 要 茄子在生产中易受青枯病侵袭 为挖掘茄子青枯病抗性基因 前期以茄子高抗青枯病自交 系和感病自交系为试材进行转录组分析 获得 4 个与调控青枯病抗性相关的 E3 泛素连接酶基因 分别命 名为 SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 序列分析发现 4 个 E3 连接酶的结构域在 7 个物种中 较为保守 SmSP1 及 SmSPL2 属 RING 型 E3 连接酶 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 属 CRL DDB 型 E3 的底物 受体 亚细胞定位表明 除 SmDDA1a2 定位于细胞核 SmSP1 SmSPL2 和 SmDDA1a1 定位于细胞核及 其他细胞部位 4 个基因在茄子抗感材料的根 茎及叶中均有表达 叶中最高 青枯菌及外源激素可诱导 4 个基因的表达 且在抗性材料中的表达量高于感病材料 水杨酸可诱导 SmSP1 的表达 茉莉酸甲酯可 诱导 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 的表达 乙烯利可诱导 4 个基因的表达 VIGS 基因沉默结果显 示 在抗性材料中沉默 SmSP1 和 SmDDA1a2 后 导致植株青枯病抗性下降 沉默 SmSPL2 和 SmDDA1a1 后 对植株青枯菌抗性没有影响 以上结果表明 SmSP1 和 SmDDA1a2 可能参与茄子青枯病抗性的调控 关键词 茄子 青枯病 E3 泛素连接酶 表达分析 功能鉴定 中图分类号 S 641 1 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2023 10 2271 17 Screening and Identification of E3 Ubiquitin Ligase Genes Relate to Bacterial Wilt Resistance in Eggplant WANG Yixi YAN Shuangshuang YU Bingwei GAN Yuwei QIU Zhengkun ZHU Zhangsheng CHEN Changming and CAO Bihao Key Laboratory of Biology Genetic Improvement of Horticultural Crops Ministry of Agriculture and Rural Affairs Guangdong Vegetable Engineering Technology Research Center College of Horticulture South China Agricultural University Guangzhou 510642 China Abstract Eggplant is vulnerable to bacterial wilt in production In order to investigate eggplant bacterial wilt resistance genes previously the transcriptome of highly resistant inbred line and susceptible inbred line were performed and analyzed Four E3 ubiquitin ligase genes related to bacterial wilt resistance including SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 and SmDDA1a2 were obtained Sequence analysis showed that the domains of four E3 ligase proteins were conservative among seven species SmSP1 and Wang Yixi Yan Shuangshuang Yu Bingwei Gan Yuwei Qiu Zhengkun Zhu Zhangsheng Chen Changming Cao Bihao Screening and identification of E3 ubiquitin ligase genes relate to bacterial wilt resistance in eggplant 2272 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2271 2287 SmSPL2 belonged to RING type E3 ligase SmDDA1a1 and SmDDA1a2 belonged to CRL DDB type E3 substrate receptor The subcellular localization results indicated that SmDDA1a2 was localized in the nucleus and SmSP1 SmSPL2 and SmDDA1a1 were localized in the nucleus and other cell sites The four genes were expressed in the roots stems and leaves of eggplant and the highest expression was found in the leaves The expression of four genes were induced by Ralstonia solanacearum and exogenous hormones and higher in resistant materials than in susceptible materials SmSP1 was induced by salicylic acid SmSPL2 SmDDA1a1 and SmDDA1a2 were induced by methyl jasmonate and all four genes were induced by ethephon Function identification by VIGS demonstrated that silencing of SmSP1 and SmDDA1a2 in resistant materials led to the decline of plant resistance to bacterial wilt and silencing of SmSPL2 and SmDDA1a1 in resistant materials did not affect the plant resistance to bacterial wilt These results suggested that SmSP1 and SmDDA1a2 may be involved in the regulation of eggplant bacterial wilt resistance Keywords eggplant bacterial wilt E3 ubiquitin ligase expression analysis functional identification 茄子 Solanum melongena 在生产中易受病害侵袭 尤其是青枯病 印度尼西亚最早报道了茄 科青枯病 卢同 1998 茄科青枯病是一种危害巨大的全球土传性细菌病害 由茄科劳尔氏菌 Ralstonia solanacearum 引起 菌系复杂 寄主多达几百种 对茄科植物危害尤其巨大 乔俊卿 等 2013 青枯菌通过植物根进入导管组织 从中繁殖并分泌胞外多糖以堵塞导管 最终导致植物缺水 而死 Peng et al 2021 目前缺乏对青枯病具免疫抗性的茄子主栽培品种 且尚未有防治青枯病 的特效药 因而筛选茄子抗青枯病基因 改善茄子青枯病抗性迫在眉睫 泛素化是生物最常见的蛋白修饰方式之一 主要由泛素 26S 蛋白酶体系统 26S ubiquitin proteasome system UPS 对靶蛋白进行降解 UPS 主要包括泛素 Ub 泛素激活酶 E1 泛素结 合酶 E2 泛素连接酶 E3 和 26S 蛋白酶体 Vierstra 2009 在 ATP 的作用下 泛素通过 E1 E2 及 E3 将其转移至靶蛋白 该过程重复多次 当泛素累积 4 个以上时形成泛素链 由 26S 蛋白酶体 将靶蛋白降解 而泛素单体则重新进入系统被循环使用 Scheffner et al 1995 Berndsen Wolberger 2014 E3 泛素连接酶可特异性识别靶蛋白 在泛素化过程中起决定性作用 E3 种类多 数量大 包含单体 RING 型 E3 连接酶及多亚基的 CRL 型 Cyr et al 2002 Bae Kim 2014 E3 连接酶 CRL 型 E3 连接酶主要由作为支架的 cullin 蛋白结合 E2 的 RING 型 really interesting new gene 蛋 白及底物受体和衔接子组成 Cullin 的 4 种类型之一的 CUL4 主要作为支架起作用 而 DDD DDB1 DET1 DDA1 复合物的亚基则是其核心亚基 是 CRL4 进化上保守的基础成分 Yanagawa et al 2004 Olma et al 2009 Dielen et al 2010 E3 泛素连接酶在植物抗病中发挥重要作用 Karki 等 2021 发现小麦酵母菌中一种富含半胱 氨酸的小分泌蛋白 ZtSSP2 可以与小麦 E3 连接酶 TaE3UBQ 互作 而 TaE3UBO 可正调控小麦叶枯 病抗性 此外 烟草 E3 连接酶基因 NtRNF217 和马铃薯 E3 连接酶 ATL 家族基因 StACRE 都可正调 控青枯病抗性 Park et al 2012 Liu et al 2021 除正调控外 Qin 等 2019 研究表明 U box 型 E3 连接酶 GhPUB17 能负调控棉花黄萎病菌抗性 E3 连接酶也可调控激素途径 水稻 OsWRKY45 及 TGA3 也受 UPS 降解以调控水杨酸 SA 信号 Pontier et al 2002 Matsushita et al 2013 UPS 也可调控茉莉酸 JA 及乙烯 Eth 信 号基因的表达 Pauwels 等 2015 研究表明 RING 型 E3 连接酶 KEG keep on going 正调控 JA 王亦栖 颜爽爽 余炳伟 甘雨薇 邱正坤 朱张生 陈长明 曹必好 茄子青枯病抗性相关的 E3 泛素连接酶基因的筛选及鉴定 园艺学报 2023 50 10 2271 2287 2273 途径信号基因 JAZ12 的表达 E3 连接酶 EBF1 及 EBF2 可靶向乙烯信号途径基因 EIN3 EIL 并将 EIN3 EIL 进行降解 Binder et al 2007 此外 有报道表明 E3 连接酶可通过激素途径调控植物 抗性 在苹果中 U box 型 E3 泛素连接酶 MdPUB29 可通过调节 SA 途径来提高苹果对轮纹病菌的 防御 Han et al 2019 CRL3 BTB Cullin3 BC3B 降解 SA 信号途径基因 NPR1 防止植株在未 受胁迫时产生 SA 的自身免疫 Petroski Deshaies 2005 Furniss Spoel 2015 茄子抗青枯病的分子机制复杂 而目前有关 E3 泛素连接酶调控其抗青枯病的研究较少 本团 队前期以茄子高抗及高感青枯病茄子自交系为材料 开展转录组分析 获得 4 个调控茄子抗青枯病 相关的 E3 泛素连接酶基因 本研究中继续对其进行表达特性分析及功能鉴定 以探讨茄子对青枯 病抗性的调控机理 1 材料与方法 1 1 试验材料 试验于 2020 年至 2021 年在华南农业大学园艺学院完成 茄子高抗青枯病自交系 E 31 和茄子高 感青枯病自交系 E 32 由华南农业大学园艺学院曹必好教授提供 Cao et al 2009 肖熙鸥 等 2012 2016 正常培养条件为 26 光照 14 h 22 黑暗 10 h 本氏烟草 Nicotiana benthamiana 正常 培养条件为 22 光照 14 h 20 黑暗 10 h 1 2 生物信息分析 茄子基因组 v4 Barchi et al 2019 由 SGN https 组中 RING 型 E3 连接酶基因的鉴定参考 Stone 等 2005 Gingerich 等 2005 Xu 等 2009 和 Lee 等 2008 的方法 茄子 E 31 和 E 32 经青枯菌处理 7 d 后的转录组数据来自本团队前期的研究 Chen et al 2018 SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 的转录本编号分别为 Unigene0012274 Unigene0058253 Unigene0022527 和 Unigene0022528 RING 型 SCF 型 BTB 型 DWD 型 E3 和 DDA1 蛋白 CRL DDB 型 E3 底物受体 的表达水平数据及热图从 figshare 网站 https DOI 10 6084 m9 figshare 21155974 使用 TBtools v1 098745 软件 Chen et al 2020 和 pheatmap 构建热图 基因结构域分析结果和同源蛋白序列来自 NCBI https www ncbi nlm nih gov 同源蛋白序列比对使用 DNAMAN 8 软件 进化树构建使用 Mega X 软件 1 3 RNA 提取 cDNA 合成 qRT PCR 及数据统计分析 茄子叶片 RNA 的提取使用上海 Promage RNA 提取试剂盒 cDNA 合成使用 EZB 反转录试剂盒 qRT PCR mix 使用 YEASEN Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 扩增体系 Mix 5 L 上 下游 引物各 0 3 L cDNA 模板 300 ng L 1 0 5 L ddH 2 O 3 9 L 基因相对表达量数据统计使用 2 ct 及 2 ct Livak Schmittgen 2001 t 检验 单因素方差分析及 least significant difference LSD 多重比较均用 SPSS 软件完成 1 4 基因的克隆 载体构建及大肠杆菌和农杆菌介导的转化 利用 Primer 5 0 及 CE Design https 软件设计引物 表 1 以茄子 cDNA 为模板进行 PCR 扩增 扩增体系同上 扩增程序为 95 预变性 3 min 95 高温变 Wang Yixi Yan Shuangshuang Yu Bingwei Gan Yuwei Qiu Zhengkun Zhu Zhangsheng Chen Changming Cao Bihao Screening and identification of E3 ubiquitin ligase genes relate to bacterial wilt resistance in eggplant 2274 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2271 2287 性 30 s 55 退火 30 s 34 个循环 72 延伸 75 s 将 pEAQ EGFP 质粒及 pTRV2 质粒进行 37 2 h 酶切反应 1 琼脂糖凝胶电泳 检测到酶切后进行限制性内切酶失活 85 5 min 利用 YEASEN 一步法快速克隆试剂盒 Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit 进行线性化质粒与目的基因 的连接 表 1 亚细胞定位及 VIGS 试验引物信息表 Table 1 List of the primers for subcellular localization and VIGS assays 名称 Name 序列 5 3 Sequence 质粒 Plasmid 酶切位点 Restriction site SmSP1 GFP F ctgcccaaattcgcgaccggt ATGGCTCCATGGGGCGGA pEAQ EGFP Age I R gcccttgctcaccataccggt ATGGCGAAAAGTTTTCACA pEAQ EGFP Age I SmSPL2 GFP F ctgcccaaattcgcgaccggt ATGTCAATACACGACCAAGCGG pEAQ EGFP Age I gcccttgctcaccataccggt AGAATCATATATCCTTACGGAACT pEAQ EGFP Age I SmDDA1a1 GFP F ctgcccaaattcgcgaccggtATGGGGTCAATTTTCGGTGAA pEAQ EGFP Age I R gcccttgctcaccataccggt GGTGGACACCTTAAGATGCT pEAQ EGFP Age I SmDDA1a2 GFP F ctgcccaaattcgcgaccggt ATGGGGTCAATTTTCGGTGAA pEAQ EGFP Age I gcccttgctcaccataccggt GGTGGACACCTTAAGATGCT pEAQ EGFP Age I pEAQ EGFP Universal F AGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACT R GGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTT pTRV2 SmSP1 F gtgagtaaggttaccgaattc ATGGCTCCATGGGGCGGA pTRV2 EcoR I cgtgagctcggtaccggatcc TCAATGGCGAAAAGTTTTCACA pTRV2 BamH I pTRV2 SmSPL2 F gtgagtaaggttaccgaattc ATGTCAATACACGACCAAGCGG pTRV2 EcoR I R cgtgagctcggtaccggatcc TCAAGAATCATATATCCTTACGGA pTRV2 BamH I pTRV2 SmDDA1a1 F gtgagtaaggttaccgaattc ATGGGGTCAATTTTCGGTGAA pTRV2 EcoR I cgtgagctcggtaccggatcc TCAGGTGGACACCTTAAGATGCT pTRV2 BamH I pTRV2 SmDDA1a2 F gtgagtaaggttaccgaattc ATGGGGTCAATTTTCGGTGAA pTRV2 EcoR I R cgtgagctcggtaccggatcc TCAGGTGGACACCTTAAGATGCT pTRV2 BamH I pTRV2 Universal F TGAGGGAAAAGTAGAGAACG CCTATGGTAAGACAATGAGT 注 序列中的小写字母表示目的基因片段与载体片段的同源臂 Note The lowercase letters in the sequence represent the homologous arms of the target gene fragment and the vector fragment 连接产物进行大肠杆菌感受态介导的转化 将连接产物加入大肠杆菌 DH5 感受态中 利用移 液枪轻轻吸打混匀 冰浴 30 min 42 金属浴 90 s 冰浴 2 min 后加入 600 L LB 液体培养基 胰 蛋白胨 10 g L 1 酵母提取物 5 g L 1 NaCl 10 g L 1 中 放置于 37 摇床 200 r min 1 活化 1 h 后 5 000 r min 1 离心 3 min 去上清液 余约 100 L 培养基将菌体吸打重悬后涂布于添加 50 mg L 1 卡那霉素 Kan 的 LB 固体培养基 1 琼脂 上 倒置于 37 培养箱中培养 1 d 待携带重组质 粒的大肠杆菌生长后 以大肠杆菌菌落为模板进行 PCR 扩增 1 琼脂糖凝胶电泳检测 筛选出阳 性菌落并测序 对应引物见表 1 挑取阳性菌落于 5 mL LB 液体培养基 37 200 r min 1 培养 1 d 后 利用擎科质粒小提试 剂盒进行重组质粒提取 将 100 500 g 的重组质粒与 GV3101 农杆菌感受态混合 并用移液枪轻 轻吸打混匀 冰浴 30 min 液氮冷冻 5 min 37 金属浴 90 s 冰浴 2 min 后加入 600 L YEP 液体 培养基 胰蛋白胨 10 g L 1 酵母提取物 10 g L 1 NaCl 5 g L 1 28 200 r min 1 活化 1 h 后 5 000 r min 1 离心 3 min 去上清液 余约 100 L 培养基将菌体吸打重悬后涂布于添加 50 mg L 1 Kan 的 YEP 固体培养基 1 琼脂 上 倒置于 28 培养箱中培养 36 48 h 待农杆菌生长后 挑 取菌落进行 PCR 扩增 1 琼脂糖凝胶电泳检测 筛选出阳性菌落 并挑取阳性菌落于装有 1 mL 含 Kan 抗性 YEP 液体培养基的 2 mL 离心管中 28 200 r min 1 培养 36 h 后用 50 的甘油保存 于 80 冰箱 王亦栖 颜爽爽 余炳伟 甘雨薇 邱正坤 朱张生 陈长明 曹必好 茄子青枯病抗性相关的 E3 泛素连接酶基因的筛选及鉴定 园艺学报 2023 50 10 2271 2287 2275 1 5 亚细胞定位 将携带 pEAQ EGFP SmSP1 pEAQ EGFP SmSPL2 pEAQ EGFP SmDDA1a1 和 pEAQ EGFP SmDDA1a2 重组质粒的农杆菌菌液在 YEP 固体培养基上划线 28 培养 2 d 后挑取单菌落至 YEP 液体培养基进行培养 将农杆菌菌液 5 000 r min 1 离心 5 min 去上清液 加入侵染液 10 mmol L 1 MgCl 2 10 mmol L 1 MES 100 mol L 1 AS 并重悬菌体 28 黑暗静置活化 1 2 h 选取健康的生长至 6 7 片叶的本氏烟草进行亚细胞定位 将携带重组质粒与核定位信号质粒 nuclear localized signal NLS Sun et al 2020 的农杆菌侵染液 1 1 体积比 混合后 注射 至烟草叶片 使之呈水渍状 将烟草放置于 22 黑暗环境中 2 3 d 后 利用荧光显微镜可视化 GFP 荧光并拍照 重复 3 次 1 6 表达组织特异性分析 取 4 片真叶期高抗和高感青枯病茄子自交系健康植株的根 茎下部 茎上部 依据根到叶的距 离进行平均划分 和叶片 进行 RNA 提取及 qRT PCR 检测 3 个生物学重复 数据处理方法采用 2 ct 显著性差异采用 t 检验 相应引物见表 2 表 2 qRT PCR 引物信息 Table 2 List of the primers of qRT PCR 用途 Application 名称 Name 序列 5 3 Sequence 表达组织特异性分析 Expression tissue specificity analysis 青枯菌 激素处理 R solanacearum hormone treatment VIGS 实验 VIGS assay qPCR SmSP1 F CAAGTATGCTTCAATGGGTT R GAGGTCCTTTCTATTATCTGCT qPCR SmSPL2 CATCCCCTACCTCTTGTG AAATCCCATCCTTTGAGC qPCR SmDDA1a1 F ATCAAGGAAATGCAGGCA TGGACACCTTAAGATGCT qPCR SmDDA1a2 CGCCTGTGACTTATCGCCCTAC R CTCGCTTTGGTCTCAACTTCTC SA 途径信号基因表达 SA pathway signaling gene expression qPCR TAG F GCAAGTGACCCTGAACTACGAAG GGGTTTTCCACATCCCTGACAAG qPCR NPR1 CTTGGACTGGGTGTTGCTAATG TGCCCATCCAATGTAATGTCTG qPCR EDS1 F GTTTCGCAGACAAGTTGAGCC R CTCTGTGTGAACCGATAACGC qPCR PAD4 ACATCGGCTGAAACCTCCTTATT TTTGATAAGTGGTGGGGAAATGA qPCR SGT1 F TTCTCGGTTTTGAGGAAGGG GCAGATACCAAGTGATGTCTACCA qPCR GluA GCCGACTGGGTGAGATGGTAA R ACATTGTTGTGCCCGTGGAC 内参基因 Internal reference gene qPCR SmActin F GTCGGAATGGGACAGAAGGATG GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT 1 7 青枯菌接种处理和激素处理 采集大田中感染青枯病的茄子植株样品 取根部以上 1 2 cm 的茎段 洗净后用 75 酒精表面 消毒 30 s 无菌水清洗 2 次 剪碎浸泡于无菌水中 10 min 观察到菌喷现象后用移液枪吸取 100 L 菌液涂布于 TTC 固体培养基上 蛋白胨 10 g L 1 酪 蛋 白 1 g L 1 葡 萄 糖 5 g L 1 琼 脂 17 g L 1 121 20 min 灭菌 pH 7 0 7 2 待冷却至 60 加入 0 005 TTC 溶液 30 倒置培养 2 3 d 将分离的青枯菌 1 号生理小种在 TTC 固体培养基上进行连续划线 30 培养 2 3 d 获得单菌落 Wang Yixi Yan Shuangshuang Yu Bingwei Gan Yuwei Qiu Zhengkun Zhu Zhangsheng Chen Changming Cao Bihao Screening and identification of E3 ubiquitin ligase genes relate to bacterial wilt resistance in eggplant 2276 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2271 2287 并将单菌落接种至 TTC 液体培养基 30 200 r min 1 培养过夜 采用伤根灌菌法 将茄子的根部用小刀划伤后每盆灌溉菌液 50 mL 保持植株水分充足 将青 枯菌接种于 4 5 片真叶期的高抗和高感茄子自交系幼苗 将幼苗放置于 28 30 14 h 光照 24 26 10 h 黑暗的环境中培养 后观察并记录植株发病情况 对 4 5 片真叶的高抗茄子自交系幼苗叶片喷施水杨酸 SA 7 2 mg L 1 茉莉酸甲酯 MeJA 1 mg L 1 及乙烯利 Eth 0 5 g L 1 Jia et al 2013 Jiang et al 2015 周大祥和熊书 2015 Hussain et al 2018 Mahesh Sharada 2018 Ahmad et al 2021 待所有叶片布满水珠为止 接种和激素处理后 0 24 h 内分 5 6 次取叶片样品进行 RNA 提取及 qRT PCR 检测 引物如表 2 3 个生物学重复 数据处理方法采用 2 ct 显著性差异处理方法采用 LSD 多重比较 1 8 病毒诱导的基因沉默 VIGS 及信号基因表达分析 将携带 pTRV2 SmSP1 pTRV2 SmSPL2 pTRV2 SmDDA1a1 pTRV2 SmDDA1a2 重组质粒的农 杆菌菌液在 YEP 固体培养基上划线 28 培养 2 d 后挑取单菌落至 YEP 液体培养基进行培养 将 农杆菌菌液 5 000 r min 1 离心 5 min 去上清 加入侵染液 10 mmol L 1 MgCL 2 10 mmol L 1 MES 100 mol L 1 AS 重悬菌体 28 黑暗静置活化 1 2 h 选取生长至 4 5 片真叶的茄子高抗自交 系植株 将上述携带重组质粒和 pTRV1 质粒的农杆菌侵染液 1 1 体积比 混合后 注射至该茄子 植株所有叶片 使之呈水渍状 将茄子放置于 16 黑暗环境中 1 d 后正常培养 每隔 1 周进行 RNA 检测至目的基因在植株中沉默 将对照及沉默植株接种青枯菌观察表型并统计病情发病率和病情指数 病情等级参考 Qiu 等 2019 的分级 茄子对青枯病抗性划分标准为 高抗 HR 病株率 20 抗病 R 20 病株率 40 耐病 MR 40 病株率 60 感病 S 60 病株率 佘小漫 等 2011 李涛 等 2017 对 SA 途径信号基因 EDS1 SMEL 006g263300 1 01 NPR1 SMEL 000g071090 1 01 TGA SMEL 010g361040 1 01 GluA SMEL 001g150160 1 01 PA D 4 SMEL 002g157190 1 01 及 SGT1 SMEL 006g251310 1 01 的相对表达量进行 qRT PCR 检测 引物如表 2 所示 2 结果与分析 2 1 E3 泛素连接酶基因的克隆及其生物信息 利用本课题组前期所测青枯菌处理 7 d 后的茄子高抗 E 31 及高感 E 32 的转录组数据 Chen et al 2018 获得有表达的单体 RING 型 E3 连接酶基因 406 个 CRL SCF 基因 260 个 CRL BTB 基 因 83 个 DWD 型 E3 基因 219 个 DDA1 CRL DDB 型 E3 的底物受体 基因 4 个 从单体 RING 型 E3 和 DDA1 的转录组表达数据中各挑选 2 个基因进行克隆 分别命名为 SmSP1 SmSPL2 和 SmDDA1a1 SmDDA1a2 其中 SmSP1 在抗病材料接种青枯菌 7 d 后表达升高 在感病材料中降低 SmSPL2 在感病材料接种青枯菌 7 d 后表达升高 在抗病材料中下降 SmDDA1a1 在感病材料接种前 后的表达差异较大 SmDDA1a2 在抗病材料接种前后表达差异较大 图 1 A SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 最大开放阅读框 ORF 分 别 为 1 029 bp 1 185 bp 330 bp 及 282 bp 分别编码 343 395 110 及 94 个氨基酸 此外 SmSP1 和 SmSPL2 结构域均为 GIDE 和 RING SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 均只有 DDA1 结构域 且通过基因序列比对及茄子基因 王亦栖 颜爽爽 余炳伟 甘雨薇 邱正坤 朱张生 陈长明 曹必好 茄子青枯病抗性相关的 E3 泛素连接酶基因的筛选及鉴定 园艺学报 2023 50 10 2271 2287 2277 组 v4 Barchi et al 2019 分析发现 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 是同一个基因的不同可变剪切体 图 1 B 图 1 茄子高抗和高感自交系 E 31 和 E 32 接种青枯菌 0 d 和 7 d 后 4 个基因的转录组热图 A 及其结构域 B Fig 1 The transcriptome heat map A and domain B of four genes of eggplant inbred lines with high resistance and high susceptibility E 31 and E 32 inoculated with Ralstonia solanacearum 0 and 7 days SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 与拟南芥 Arabidopsis thaliana 水稻 Oryza sativa 番茄 Solanum lycopersicum 辣椒 Capsicum annuum 马铃薯 Solanum tuberosum 和 烟草 Nicotiana tabacum 的同源蛋白进行序列比对 结果显示 4 个 E3 泛素连接酶的结构域在上述 物种中都较为保守 系统发育分析结果表明 SmSP1 与辣椒 CaSP1 同源性最高 SmSPL2 与番茄 SlSPL2 及马铃薯 StSPL2 亲缘关系最近 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 与番茄 SlDDA1 和马铃薯 StDDA1 高度同源 2 2 E3 泛素连接酶的亚细胞定位 对 SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 进行亚细胞定位检测 从结果推断 SmDDA1a2 仅定位于细胞核 SmSP1 SmSPL2 和 SmDDA1a1 除定位于细胞核外 还在细胞的其他部位表达 图 2 2 3 E3 泛素连接酶基因表达的组织特异性 对 SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 在茄子高抗青枯病材料 E 31 和高感青枯病材料 E 32 中的表达组织特异性进行分析 结果 图 3 表明 4 个基因在两个材料的根 茎和叶中均有 表达 且高抗材料均高于高感材料 表达具有组织器官特异性 叶中表达量最高 茎部次之 根中 最低 2 4 青枯菌诱导 E3 连接酶基因表达 在茄子高抗和高感两个自交系接种青枯菌后 4 个基因均被青枯菌诱导表达 但表达模式不同 随接种时间的延长 SmSP1 SmSPL2 SmDDA1a1 和 SmDDA1a2 的表达量在高抗性自交系中均呈 上升趋势 在高感病自交系中呈下降趋势 图 4 Wang Yixi Yan Shuangshuang Yu Bingwei Gan Yuwei Qiu Zhengkun Zhu Zhangsheng Chen Changming Cao Bihao Screening and identification of E3 ubiquitin ligase genes relate to bacterial wilt resistance in eggplant 2278 Acta Horticulturae Sinica 2023 50 10 2271 2287 2 5 激素诱导 E3 泛素连接酶基因表达 利用水杨酸 SA 茉莉酸甲酯 MeJA 和乙烯利 Eth 对茄子青枯病高抗性自交系进行处 理 结果 图 5 表明 外施 SA 6 h 后可诱导 SmSP1 表达 外施 MeJA 12 h 后可诱导 SmSPL2 SmDDA1a1 和 S