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湖 北 农 业 科 学 2 0 2 0 年 第 5 9 卷 第 1 3 期 2 0 2 0 年 7 月 湖 北 农 业 科 学 H u b e i A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s V o l 5 9 N o 1 3 J u l 2 0 2 0 杨 林 毅 陈 潞 陈 泽 历 等 滇 重 楼 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 分 离 物 的 鉴 定 及 全 基 因 组 序 列 分 析 J 湖 北 农 业 科 学 2 0 2 0 5 9 1 3 1 5 4 1 5 7 1 6 2 收 稿 日 期 2 0 1 9 1 0 2 9 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 8 1 8 6 0 7 7 4 作 者 简 介 杨 林 毅 1 9 9 2 男 河 南 安 阳 人 硕 士 研 究 方 向 为 植 物 病 理 学 电 话 1 3 5 0 3 8 0 4 9 0 2 电 子 信 箱 1 3 5 0 3 8 0 4 9 0 2 1 6 3 c o m 并 列 第 一 作 者 陈 潞 1 9 9 7 女 云 南 昭 通 人 在 读 硕 士 研 究 生 研 究 方 向 为 植 物 病 理 学 电 话 1 8 3 1 3 9 2 7 9 6 2 电 子 信 箱 9 5 8 6 1 4 5 7 3 q q c o m 通 信 作 者 赵 明 富 1 9 7 5 男 云 南 宣 威 人 副 教 授 博 士 主 要 从 事 植 物 病 理 学 研 究 电 话 1 3 9 8 7 1 3 4 7 6 5 电 子 信 箱 z h a o m i n g f u 1 6 3 c o m 文 国 松 1 9 6 8 男 云 南 曲 靖 人 研 究 员 博 士 主 要 从 事 中 药 学 研 究 电 话 1 3 9 8 7 1 9 2 0 6 7 电 子 信 箱 w e n g s 1 6 3 c o m 滇 重 楼 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 分 离 物 的 鉴 定 及 全 基 因 组 序 列 分 析 杨 林 毅 a 陈 潞 a 陈 泽 历 b 飞 进 强 b 王 喆 a 徐 绍 忠 b 赵 明 富 a 文 国 松 b 云 南 农 业 大 学 a 农 业 生 物 多 样 性 与 病 害 控 制 教 育 部 重 点 实 验 室 b 农 业 与 生 物 技 术 学 院 昆 明 6 5 0 2 0 1 摘 要 滇 重 楼 P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s 是 多 年 生 草 本 植 物 其 药 用 部 位 为 地 下 根 茎 是 一 种 重 要 的 中 药 材 为 明 确 侵 染 滇 重 楼 的 病 毒 病 原 对 采 自 云 南 省 曲 靖 市 的 滇 重 楼 进 行 透 射 电 镜 观 察 D A S E L I S A 和 R T P C R 技 术 检 测 在 透 射 电 镜 下 观 察 到 杆 状 病 毒 粒 子 大 小 为 2 0 0 3 0 0 n m 2 0 3 6 n m 对 采 集 到 的 7 份 病 样 进 行 D A S E L I S A 检 测 结 果 表 明 其 中 5 份 病 样 呈 阳 性 通 过 R T P C R 技 术 扩 增 克 隆 获 得 1 个 全 长 为 6 3 5 7 b p 的 曲 靖 分 离 物 P M M o V Q J 的 全 基 因 组 序 列 将 P M M o V Q J 的 全 基 因 组 序 列 与 国 内 外 已 经 报 道 的 1 0 个 P M M o V 分 离 物 进 行 同 源 性 分 析 比 对 其 同 源 性 为 9 9 4 2 9 9 8 1 基 于 全 基 因 序 列 的 系 统 发 育 分 析 表 明 P M M o V Q J 与 韩 国 分 离 物 亲 缘 关 系 密 切 本 研 究 明 确 了 该 分 离 物 的 亲 缘 关 系 从 分 子 水 平 鉴 定 该 分 离 物 为 后 续 滇 重 楼 病 毒 病 的 预 防 提 供 理 论 依 据 关 键 词 滇 重 楼 P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 P M M o V 鉴 定 序 列 分 析 中 图 分 类 号 S 4 3 2 4 1 文 献 标 识 码 A 文 章 编 号 0 4 3 9 8 1 1 4 2 0 2 0 1 3 0 1 5 4 0 5 D O I 1 0 1 4 0 8 8 j c n k i i s s n 0 4 3 9 8 1 1 4 2 0 2 0 1 3 0 3 5 开 放 科 学 资 源 服 务 标 识 码 O S I D I d e n t i f i c a t i o n a n d g e n o m e s e q u e n c e a n a l y s i s o f p e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s i s o l a t e f r o m P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s Y A N G L i n y i a C H E N L u a C H E N Z e l i b F E I J i n q i a n g b W A N G Z h e a X U S h a o z h o n g b Z H A O M i n g f u a W E N G u o s o n g b a K e y L a b o r a t o r y o f A g r o b i o d i v e r s i t y a n d P e s t M a n a g e m e n t M i n i s t r y o f E d u c a t i o n b C o l l e g e o f A g r o n o m y a n d B i o t e c h n o l o g y Y u n n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y K u n m i n g 6 5 0 2 0 1 C h i n a A b s t r a c t P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s i s a p e r e n n i a l h e r b a n d i t s m e d i c i n a l p a r t i s u n d e r g r o u n d r h i z o m e s I t i s a n i m p o r t a n t c h i n e s e m e d i c i n a l m a t e r i a l I n o r d e r t o c l a r i f y t h e v i r a l p a t h o g e n s i n f e c t i n g t h e P a r i s p o l y p h y l l a t h e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y D A S E L I S A a n d R T P C R t e c h n i q u e s w e r e p e r f o r m e d o n t h e P a r i s p o l y p h y l l a c o l l e c t e d f r o m Q u j i n g Y u n n a n p r o v i n c e B a c u l o v i r u s p a r t i c l e s w e r e o b s e r v e d u n d e r t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d w e r e 2 0 0 3 0 0 n m 2 0 3 6 n m i n s i z e T h e r e s u l t s o f D A S E L I S A o n 7 s a m p l e s c o l l e c t e d s h o w e d t h a t 5 o f t h e m w e r e p o s i t i v e A w h o l e g e n o m e s e q u e n c e o f a 6 3 5 7 b p Q u j i n g i s o l a t e P M M o V Q J a c c e s s i o n n u m b e r M K 7 8 4 5 6 8 w a s c l o n e d b y R T P C R a m p l i f i c a t i o n T h e h o m o l o g o u s s e q u e n c e o f P M M o V Q J w e r e a n a l y z e d b y h o m o l o g y w i t h 1 0 P M M o V i s o l a t e s r e p o r t e d a t h o m e a n d a b r o a d a n d t h e h o m o l o g y w a s b e t w e e n 9 9 4 2 a n d 9 9 8 1 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s b a s e d o n t h e w h o l e g e n e s e q u e n c e s h o w e d t h a t P M M o V Q J w a s c l o s e l y r e l a t e d t o K o r e a n i s o l a t e s T h i s s t u d y c l a r i f i e s t h e g e n e t i c r e l a t i o n s h i p o f t h e i s o l a t e a n d i d e n t i f i e s t h e i s o l a t e f r o m t h e m o l e c u l a r l e v e l w h i c h p r o v i d e s a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e p r e v e n t i o n o f t h e s u b s e q u e n t v i r a l d i s e a s e K e y w o r d s P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s p e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s P M M o V i d e n t i f i c a t i o n s e q u e n c e a n a l y s i s第 1 3 期 滇 重 楼 P a r i s p o l y p h y l l a v a r y u n n a n e n s i s 又 称 独 角 莲 属 延 龄 草 科 重 楼 属 P a r i s 多 年 生 草 本 植 物 其 药 用 部 位 为 地 下 根 状 茎 分 布 于 亚 欧 大 陆 温 带 和 热 带 地 区 在 中 国 主 要 集 中 在 西 南 地 区 其 中 以 云 南 省 滇 中 滇 东 和 滇 东 北 滇 西 和 滇 西 北 为 主 1 滇 重 楼 宜 阴 畏 晒 喜 湿 忌 燥 通 常 生 长 在 气 候 湿 润 雨 量 适 当 海 拔 1 3 0 0 3 0 0 0 m 的 蔽 阴 处 作 为 一 种 珍 稀 中 草 药 滇 重 楼 以 根 茎 入 药 其 主 要 化 学 成 分 为 甾 体 皂 苷 并 含 多 糖 黄 酮 苷 脱 皮 激 素 及 氨 基 酸 具 有 较 强 生 物 活 性 有 抗 微 生 物 镇 痛 镇 静 消 肿 止 血 清 热 解 毒 凉 肝 定 惊 等 功 效 是 云 南 白 药 楼 莲 胶 囊 宫 血 宁 胶 囊 等 云 南 品 牌 中 成 药 的 主 要 原 料 植 物 之 一 2 由 于 长 期 对 野 生 滇 重 楼 掠 夺 式 的 采 挖 加 之 滇 重 楼 自 然 繁 殖 率 低 生 长 缓 慢 且 周 期 长 野 生 滇 重 楼 出 现 严 重 紧 缺 现 象 现 在 已 成 为 云 南 省 3 0 种 稀 缺 濒 危 天 然 药 物 之 一 野 生 滇 重 楼 很 少 发 生 病 虫 害 然 而 随 着 滇 重 楼 规 模 化 人 工 种 植 的 发 展 及 栽 培 年 限 的 增 加 新 的 病 害 不 断 出 现 加 之 滇 重 楼 种 植 于 灌 溉 方 便 地 势 平 坦 且 排 水 良 好 的 酸 性 土 壤 中 土 壤 肥 沃 疏 松 有 机 质 和 腐 殖 质 含 量 较 高 为 种 植 滇 重 楼 提 供 了 良 好 条 件 但 同 时 也 加 剧 了 病 害 的 发 生 这 些 病 害 的 发 生 对 滇 重 楼 的 产 量 和 品 质 造 成 不 同 程 度 的 影 响 轻 者 减 产 重 者 绝 收 使 农 户 遭 受 损 失 目 前 报 道 的 滇 重 楼 病 害 多 为 真 菌 性 病 害 包 括 根 腐 病 茎 腐 病 叶 斑 病 叶 枯 病 猝 倒 病 等 和 细 菌 性 病 害 细 菌 性 病 害 主 要 是 细 菌 性 穿 孔 病 3 关 于 病 毒 病 害 报 道 较 少 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s P M M o V 属 于 烟 草 花 叶 病 毒 属 T o b a m o v i r u s 的 正 义 链 R N A 病 毒 基 因 组 R N A 由 6 3 5 6 或 6 3 5 7 个 碱 基 组 成 编 码 病 毒 复 制 酶 蛋 白 P 1 2 6 和 P 1 8 3 运 动 蛋 白 M P 和 外 壳 蛋 白 1 7 k D a 等 至 少 4 种 蛋 白 是 世 界 范 围 内 造 成 辣 椒 经 济 损 失 的 重 要 病 原 之 一 4 5 P M M o V 可 以 通 过 种 子 和 汁 液 摩 擦 传 播 带 毒 种 子 发 病 植 株 和 病 土 是 重 要 的 侵 染 来 源 在 自 然 条 件 下 病 毒 可 感 染 所 有 辣 椒 品 种 包 括 甜 椒 品 种 和 辣 椒 还 可 以 通 过 机 械 接 种 感 染 茄 科 藜 科 和 苋 科 的 部 分 宿 主 P M M o V 最 早 报 道 于 美 国 辣 椒 6 1 9 9 4 年 在 中 国 新 疆 辣 椒 上 被 首 次 发 现 7 感 病 辣 椒 叶 片 呈 现 斑 驳 花 叶 扭 曲 或 皱 缩 症 状 茎 秆 上 出 现 褐 色 坏 死 斑 果 实 变 小 畸 形 果 面 斑 驳 或 出 现 凹 陷 坏 死 等 明 显 病 毒 病 症 状 后 期 辣 椒 果 实 外 观 和 内 在 品 质 均 显 著 变 差 到 目 前 为 止 还 没 有 关 于 该 病 毒 感 染 滇 重 楼 的 报 道 近 年 来 发 现 云 南 曲 靖 地 区 出 现 了 病 毒 性 病 害 本 研 究 采 用 反 转 录 R T P C R 和 双 抗 体 夹 心 酶 联 免 疫 吸 附 法 D A S E L I S A 等 技 术 对 云 南 省 曲 靖 地 区 滇 重 楼 的 病 毒 病 进 行 克 隆 和 序 列 分 析 明 确 该 分 离 物 的 亲 缘 关 系 从 分 子 水 平 鉴 定 该 分 离 物 为 后 续 滇 重 楼 病 毒 病 的 预 防 提 供 理 论 依 据 1 材 料 与 方 法 1 1 试 验 材 料 与 主 要 试 剂 本 研 究 在 云 南 省 曲 靖 市 进 行 采 样 调 查 采 集 病 样 具 有 花 叶 斑 驳 和 退 绿 症 状 病 样 于 8 0 保 存 供 试 P M M o V 的 D A S E L I S A 的 检 测 试 剂 盒 购 自 C r e a t i v e D i a g n o s t i c s 公 司 植 物 总 R N A 提 取 试 剂 盒 O M E G A P l a n t R N A K i t 购 自 昆 明 硕 阳 科 技 公 司 P r i m e S c r i p t T M I s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i s K i t 合 成 试 剂 盒 购 自 T a K a R a 生 物 工 程 大 连 有 限 公 司 P o w e r T a q P C R M a s t e r M i x 试 剂 盒 购 自 北 京 百 泰 克 生 物 技 术 有 限 公 司 引 物 由 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 1 2 电 镜 观 察 取 退 绿 症 状 明 显 的 滇 重 楼 病 叶 进 行 病 毒 粒 子 提 纯 病 毒 粒 子 提 纯 参 照 Z h a o 等 8 描 述 的 方 法 提 纯 的 病 毒 粒 子 用 浸 出 法 在 电 子 显 微 镜 下 观 察 用 铺 有 F o r m v e r 膜 的 电 镜 铜 网 沾 取 病 毒 粗 提 纯 液 用 吸 水 纸 吸 干 加 1 滴 2 磷 钨 酸 p H 7 0 负 染 1 m i n 然 后 吸 干 待 干 燥 后 用 J E M 1 2 0 0 E X I I 透 射 电 镜 观 察 并 用 G A T A N C C D 相 机 拍 照 1 3 血 清 学 检 测 取 田 间 采 集 到 的 滇 重 楼 疑 似 感 染 病 毒 病 叶 加 入 P B S 缓 冲 液 进 行 研 磨 裂 解 后 采 用 D A S E L I S A 法 进 行 检 测 检 测 方 法 按 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s P M M o V E L I S A K i t D E I A P V 2 2 0 试 剂 盒 说 明 书 进 行 C r e a t i v e D i a g n o s t i c s 以 健 康 滇 重 楼 叶 片 为 阴 性 对 照 以 缓 冲 液 为 空 白 对 照 1 4 滇 重 楼 叶 片 总 R N A 提 取 及 反 转 录 取 2 份 症 状 较 明 显 的 滇 重 楼 病 叶 以 1 份 健 康 的 滇 重 楼 叶 片 为 对 照 提 取 总 R N A 具 体 方 法 按 照 O M E G A P l a n t R N A k i t 试 剂 盒 说 明 书 进 行 将 提 取 得 到 的 总 R N A 于 8 0 保 存 备 用 提 取 得 到 的 总 R N A 作 为 模 板 用 于 c D N A 第 一 链 合 成 总 反 应 体 系 2 0 m L T o t a l R N A 4 m L 下 游 引 物 2 5 m L d N T P M i x t u r e 1 0 m m o l L e a c h 1 m L d d H 2 O 2 5 m L 混 匀 6 5 温 度 育 5 m i n 置 于 冰 上 急 冷 加 入 5 P r m i n e S c r i p t B u f f e r 4 m L P r i m e S c r i p t T a s e 1 m L R N a s e I n h i b i t o r 4 0 U m L 0 5 m L R N a s e F r e e d H 2 O 4 5 m L 4 2 退 火 9 0 m i n 7 2 终 止 反 应 1 5 m i n 在 4 保 存 条 件 下 进 行 逆 转 录 反 应 所 得 c D N A 产 物 用 于 P C R 扩 增 采 用 2 P o w e r T a q P C R M a s t e r M i x 试 剂 盒 反 应 体 系 参 照 厂 家 说 明 书 扩 增 体 系 5 0 m L 扩 杨 林 毅 等 滇 重 楼 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 分 离 物 的 鉴 定 及 全 基 因 组 序 列 分 析 1 5 5湖 北 农 业 科 学 2 0 2 0 年 增 反 应 体 系 为 2 P o w e r T a q P C R M a s t e r M i x 2 5 m L 上 游 引 物 T o b U n i 1 5 m L 下 游 引 物 T o b U n i 2 5 m L c D N A 模 板 2 m L 反 应 条 件 为 9 4 预 变 性 1 m i n 9 4 变 性 3 0 s 5 4 退 火 3 0 s 7 2 延 伸 3 m i n 3 5 个 循 环 扩 增 7 2 终 止 延 伸 8 m i n 最 后 凝 胶 电 泳 检 测 1 5 基 因 组 克 隆 及 分 析 根 据 G e n B a n k 中 P M M o V 中 国 分 离 物 P M M o V C N 登 录 号 A Y 8 5 9 4 9 7 的 基 因 序 列 设 计 3 对 特 异 性 引 物 9 表 1 由 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 将 P C R 产 物 分 别 进 行 电 泳 并 切 胶 回 收 后 直 接 克 隆 于 载 体 p G E M T E a s y v e c t o r P r o m e g a 总 反 应 体 系 2 R a p i d L i g a t i o n B u f f e r 5 L P G E M T E a s y V e c t o r 1 L 切 胶 回 收 产 物 3 L T 4 D N A L i g a s e 1 L 将 配 制 好 的 连 接 体 系 轻 轻 混 匀 在 室 温 静 置 1 h 或 者 4 条 件 下 静 置 过 夜 用 于 转 化 D H 5 转 化 大 肠 杆 菌 感 受 态 细 胞 D H 5 在 含 5 0 n g L 氨 苄 青 霉 素 的 平 板 上 培 养 过 夜 经 蓝 白 斑 筛 选 挑 取 蓝 斑 对 照 白 斑 进 行 培 养 提 取 质 粒 将 筛 选 出 的 含 重 组 质 粒 的 阳 性 克 隆 送 至 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 进 行 测 序 采 用 D N A M A N 软 件 及 B L A S T h t t p w w w N C B I n l m n i h g o v 进 行 序 列 分 析 采 用 M E G A 7 0 软 件 构 建 系 统 发 育 树 表 1 P M M o V 特 异 性 扩 增 引 物 引 物 名 称 P M M o V 1 F P M M o V 1 R P M M o V 2 F P M M o V 2 R P M M o V 3 F P M M o V 3 R 序 列 5 3 G T A A A T T T T T C A C A A T T T A A C A A C A A C A A C A C A C C A A A G A T T C G G A G C T C G T A G A G T C G C A G T G A G C T C C T A G C A T A G A G G A C A G A C A T G C G A G G A A A A G C G G T G A T G T C A C T G G G C C G C A C C C G C G G T T C 起 始 位 点 1 2 4 8 2 2 4 5 0 4 4 6 5 4 3 9 5 6 3 5 6 2 结 果 与 分 析 2 1 滇 重 楼 病 毒 样 品 田 间 症 状 调 查 发 现 发 病 滇 重 楼 叶 片 呈 现 退 绿 花 叶 黄 化 或 皱 缩 等 明 显 的 病 毒 病 症 状 图 1 2 2 电 镜 观 察 病 毒 粒 子 形 态 取 呈 现 退 绿 症 状 明 显 的 滇 重 楼 病 叶 进 行 病 毒 粒 子 提 纯 提 纯 的 病 毒 粒 子 在 透 射 电 镜 下 观 察 到 杆 状 病 毒 粒 子 大 小 为 2 0 0 3 0 0 n m 2 0 3 6 n m 图 2 2 3 D A S E L I S A 血 清 学 检 测 对 采 集 到 的 7 份 病 样 进 行 D A S E L I S A 检 测 结 果 表 明 其 中 5 份 病 样 呈 阳 性 表 2 图 1 田 间 滇 重 楼 病 叶 症 状 图 2 滇 重 楼 病 叶 中 提 纯 得 到 的 杆 状 病 毒 粒 子 表 2 滇 重 楼 病 叶 D A S E L I S A 检 测 结 果 O D 值 种 类 样 品 对 照 S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 阳 性 阴 性 空 白 O D 4 0 5 1 6 2 2 1 5 7 3 1 5 7 9 1 5 6 9 1 5 6 6 1 5 6 2 0 0 9 1 0 0 8 3 2 4 P M M o V Q J R T P C R 扩 增 结 果 采 用 P M M o V 特 异 性 引 物 分 别 为 P M M o V 1 F P M M o V 1 R P M M o V 2 F P M M o V 2 R P M M o V 3 F 和 P M M o V 3 R 以 反 转 录 的 c D N A 为 模 板 进 行 扩 增 得 到 3 段 单 一 的 P C R 产 物 2 5 P M M o V Q J 的 全 基 因 组 测 序 对 3 段 单 一 的 扩 增 产 物 进 行 测 序 通 过 D N A M A N 软 件 拼 接 获 得 P M M o V Q J 登 录 号 M K 7 8 4 5 6 8 的 基 因 组 序 列 全 长 为 6 3 5 7 b p P M M o V Q J 的 全 基 因 组 序 列 包 含 1 8 8 0 个 碱 基 A 1 5 2 6 个 碱 基 G 1 7 7 9 个 碱 基 T 和 1 1 7 2 个 碱 基 C 这 4 种 碱 基 在 P M M o V Q J 的 全 基 因 组 序 列 中 所 占 的 百 分 比 依 次 为 2 9 5 7 2 4 0 1 2 7 9 8 和 1 5 6第 1 3 期 下 转 第 1 6 2 页 1 8 4 4 5 非 编 码 区 5 U T R 和 3 非 编 码 区 3 U T R 分 别 含 有 6 9 和 1 9 9 个 碱 基 P M M o V Q J 有 4 个 开 放 阅 读 框 架 编 码 4 个 蛋 白 分 别 为 1 2 6 k D a 蛋 白 7 0 3 4 2 3 n t 1 8 3 k D a 蛋 白 7 0 4 9 0 8 n t 2 8 k D a 蛋 白 4 9 0 9 5 6 8 2 n t 和 1 7 k D a 蛋 白 5 6 8 5 6 1 5 8 n t 第 一 个 开 放 阅 读 框 编 码 的 蛋 白 与 病 毒 复 制 相 关 同 时 第 一 个 开 放 阅 读 框 与 第 二 个 开 放 阅 读 框 共 同 编 码 一 个 与 病 毒 复 制 相 关 的 蛋 白 第 三 个 开 放 阅 读 框 编 码 的 蛋 白 与 病 毒 移 动 有 关 第 四 个 开 放 阅 读 框 编 码 的 蛋 白 为 病 毒 衣 壳 蛋 白 2 6 P M M o V Q J 与 其 他 不 同 分 离 物 的 基 因 同 源 性 比 对 从 G e n B a n k 中 选 取 1 0 个 P M M o V 分 离 物 采 用 D N A M E N 软 件 对 P M M o V Q J 的 基 因 全 序 列 与 上 述 基 因 全 序 列 进 行 同 源 性 比 对 由 表 3 可 知 P M M o V Q J 与 选 取 的 1 0 个 P M M o V 分 离 物 核 苷 酸 的 序 列 同 源 性 为 9 9 4 2 9 9 8 1 同 源 性 较 高 P M M o V Q J 与 韩 国 分 离 物 P M M o V R P 的 同 源 性 为 9 9 8 1 与 韩 国 分 离 物 P M M o V L S 的 同 源 性 为 9 9 6 7 与 日 本 分 离 物 P M M o V J 的 同 源 性 为 9 9 6 4 与 日 本 分 离 物 P M M o V C 的 同 源 性 为 9 9 6 2 与 中 国 葫 芦 岛 分 离 物 P M M o V H u l u d a o 的 同 源 性 为 9 9 5 8 与 西 班 牙 分 离 物 P M M o V S 日 本 分 离 物 P M M o V 登 录 号 A B 1 1 3 1 1 6 日 本 分 离 物 P M M o V 登 录 号 A B 1 1 3 1 1 7 韩 国 分 离 物 P M M o V J 4 7 中 国 湖 南 分 离 物 P M M o V H N 1 的 同 源 性 分 别 为 9 9 5 4 9 9 5 1 9 9 4 8 9 9 4 5 和 9 9 4 2 表 3 P M M o V Q J 核 苷 酸 序 列 同 源 性 比 较 G e n B a n k 登 录 号 K R 1 0 8 2 0 6 K R 1 0 8 2 0 7 A B 0 0 0 7 0 9 A B 0 6 9 8 5 3 M G 5 1 5 7 2 5 M 8 1 4 1 3 A B 1 1 3 1 1 6 A B 1 1 3 1 1 7 K X 3 9 9 3 8 9 K P 3 4 5 8 9 9 病 毒 分 离 物 P M M o V R P P M M o V L S P M M o V J P M M o V C P M M o V H u l u d a o P M M o V S P M M o V P M M o V P M M o V J 4 7 P M M o V H N 1 来 源 韩 国 韩 国 日 本 日 本 中 国 葫 芦 岛 西 班 牙 日 本 日 本 韩 国 中 国 湖 南 核 苷 酸 序 列 同 源 性 9 9 8 1 9 9 6 7 9 9 6 4 9 9 6 2 9 9 5 8 9 9 5 4 9 9 5 1 9 9 4 8 9 9 4 5 9 9 4 2 2 7 系 统 进 化 树 分 析 将 P M M o V Q J 的 基 因 全 序 列 与 上 述 1 0 个 P M M o V 分 离 物 进 行 比 对 后 通 过 M E G A 7 0 软 件 采 用 N e i g h b o r J o i n i n g 聚 类 分 析 方 法 构 建 系 统 进 化 树 图 3 结 果 表 明 将 所 有 P M M o V 分 离 物 聚 集 在 一 起 形 成 两 大 支 系 群 体 P M M o V Q J 与 中 国 葫 芦 岛 分 离 物 P M M o V H u l u d a o 韩 国 分 离 物 P M M o V L S 和 韩 国 分 离 物 P M M o V R P 这 3 个 P M M o V 分 离 物 聚 为 1 个 支 系 与 其 他 7 个 不 同 地 区 的 P M M o V 分 离 物 分 属 不 同 支 系 但 亲 缘 关 系 相 对 较 近 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s A B 0 0 0 7 0 9 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s A B 0 6 9 8 5 3 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s A B 1 1 3 1 1 6 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s A B 1 1 3 1 1 7 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s M 8 1 4 1 3 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s K X 3 9 9 3 8 9 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s M N 2 6 7 8 9 9 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s M G 5 1 5 7 2 5 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s K R 1 0 8 2 0 7 P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s Q J P e p p e r m i l d m o t t l e v i r u s K R 1 0 8 2 0 6 9 2 9 5 9 8 9 5 1 0 0 7 2 5 5 6 1 2 图 3 不 同 来 源 的 P M M o V 分 离 物 的 全 基 因 组 序 列 系 统 进 化 树 3 小 结 与 讨 论 辣 椒 轻 斑 驳 病 毒 引 起 辣 椒 植 株 矮 化 叶 片 轻 微 退 绿 果 实 变 小 畸 形 斑 驳 有 时 果 实 上 出 现 凹 陷 坏 死 区 域 其 发 病 症 状 与 烟 草 花 叶 病 毒 T M V 和 辣 椒 脉 斑 驳 病 毒 C h i V M V 相 似 难 以 通 过 症 状 特 点 对 病 毒 进 行 鉴 定 P M M o V 侵 染 的 相 关 报 道 主 要 集 中 在 华 北 及 华 中 地 区 新 疆 贵 州 东 北 和 浙 江 等 地 也 相 继 检 测 出 P M M o V 1 0 1 5 并 提 出 了 一 些 分 子 检 测 方 法 然 而 P M M o V 对 云 南 滇 重 楼 的 侵 染 还 没 有 过 报 道 本 研 究 对 云 南 省 曲 靖 市 采 集 到 的 7 份 滇 重 楼 病 样 进 行 透 射 电 镜 观 察 D A S E L I S A 和 R T P C R 技 术 检 测 并 测 序 确 定 P M M o V 对 滇 重 楼 的 侵 染 用 浸 出 法 在 透 射 电 镜 下 观 察 到 杆 状 病 毒 粒 子 大 小 为 2 0 0 3 0 0 n m 2 0 3 6 n m 通 过 D A S E L I S A 检 测 结 果 表 明 其 中 5 份 病 样 呈 阳 性 经 过 R T P C R 技 术 检 测 并 克 隆 测 序 获 得 P M M o V 的 全 基 因 组 序 列 命 名
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