水杨酸诱导草莓叶片灰霉病抗性机理的研究_贾思振.pdf

第 37 卷 第 10 期 2021 年 10 月 科 技 通 报 BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Vol 37 No 10 Oct 2021 水杨酸诱导草莓叶片灰霉病抗性机理的研究 贾 思 振 谢浩举 江苏农林职业技术学 院 农学园艺学院 江苏 句容 212400 摘 要 为探索水杨酸 SA 对草莓灰霉病防治的作用 利用 0 1 2 4 mmol L 1 SA 溶 液 喷洒处理 红颜 草莓叶片 3 d 后取下叶片 接种灰葡萄孢菌 检测草莓叶片发病指数 抗性相关酶活性和基因相对表达量 结果表明 SA 处 理能够提高草莓叶片灰霉病的抗病能力 SA 浓度越高效果越明显 4 mmol L 1 SA 处理时病斑直径为最小 为 6 2 mm SA 处理也能够提高抗性相关酶的活性和基因的相对表达量 4 mmol L 1 SA 处理 第 3 天时几丁质酶活性达到 了 2 5 U mg 1 min 1 是 对 照的 1 56 倍 null 1 3 葡聚糖酶的活性在 5 d 时达到了最高值 达到了 74 U mg 1 protein 比 第 1 天 增加了 3 08 倍 是对照的 1 45 倍 水杨酸处理后 抗病先关基因的相对表达量也有相似的变化 提高了 草莓叶片 nullnullnullnullnull nullnullnullnullnull nullnullnullnull1 基因的相对表达量 关键词 水杨酸 草莓 灰霉病 抗病性 中图分类号 S432 文献标识码 A 文章编号 1001 7119 2021 10 0019 05 DOI 10 13774 j cnki kjtb 2021 10 004 收 稿 日期 2021 02 24 基金项目 2018 年高校 青蓝工程 优秀青年骨干教师培养对象 江苏省青蓝工程基金 江苏现代农业 草莓 产业技术 体系 JATS 2020 339 作者简介 贾思振 1982 男 山东济南人 硕士研究生 副教授 主要从事草莓抗病机制研究 E mail 93327862 qq com nullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnull nullnullnullnull null nullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnull nullnullnullnull null null nullnullnullnullnullnullnull nullnull nullnullnullnullnullnull nullnullnull null null null nullnullnull nullnullnullnull School of Agronomy and Horticulture Jiangsu Vocational College Agriculture and Forestry Jurong Jiangsu 212400 China nullnullnullnullnullnull In order to investigate the effect of salicylic acid SA on the control of strawberry grey mold the leaves of Hongyan strawberry were sprayed with 0 1 2 and 4 mmol L 1 SA solution After 3 days the leaves were taken off and inoculated with Botrytis cinerea The incidence index reactant related enzyme activities and relative gene expression levels of strawberry leaves were detected The results showed that SA treatment could improve the resistance of strawberry leaf grey mould and the higher the SA concentration the more obvious the effect was The spot diameter of 4mmol L 1 SA treatment was the smallest which was 6 2mm SA treatment also increased the activities of resistance related enzymes and the relative expression of genes The chitinase activity reached 2 5 U mg 1 min 1 at the 3rd day after 4mmol L 1 SA treatment which was 1 56 times that of the control The activity of null 1 3 glucanase reached the peak value on day 5 reaching 74 U mg 1 protein which was 3 08 times higher than that on day 1 and 1 45 times higher than that of control After treatment with salicylic acid the relative expression levels of resistance pregenes also changed similarly and the relative expression levels of nullnull null nullnullnull nullnull 1 were increased nullnullnullnullnullnull salicylic acid strawberry grey mould disease resistance 20 科 技 通 报 第 37 卷 草莓 nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnull 是一种兼具营养 和观赏价值的水果 具有结果早 周期短 见效快的优 点 目前草莓的栽培多采用设施栽培 但设施空间封 闭 通风透气性差 病害发生严重 其中灰霉病是影响 草莓产量和品质的主要病害之一 灰霉病由灰葡萄 孢菌 nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull 引起 在草莓采收前和采收后 都容易发病 病株率达 20 30 严重时可达 90 以上 给草莓生产种植业造成很大的经济损失 1 3 目 前 灰霉病的防治主要方法 有农业防治 化学防治 生物学防治等 而无论以那种方法进行灰霉病防治 都需要耗费大量的人力和物力 4 而 且 灰霉病菌能 够在植物残体中潜伏很长时间 导致人工防治效果不 佳 杀菌剂的长期使用也会引起耐药性 另外 农药 残留对环境的污染也日益加重 直接威胁着人类的健 康 因此 深入解析草莓对灰霉病的抗病以及调控机 制 对防治草莓灰霉病有重要的意义 水杨酸 salicylic acid SA 是植物体内含量较低 的一种内源酚类物质 与植物局部抗性和系统获得 性抗性的形成密切相关 植物受病原菌侵染后都会 大量积累 SA 外源 SA 处理可增强植物对病原物的 广谱抗病性 SA 可诱导 ROS 爆发 调节抗氧化酶 的活性 提高植物抗性反应 SA 可通过抑制过氧化 氢酶 CAT 抗坏血酸氧化酶 APX 等活性氧降解 酶类的活性 使细胞内积累适量 H 2 O 2 以提 高植物 抗性 Chen 等证明当 SA 存在时 CAT 活性被抑制 了近 80 H 2 O 2 含 量 显著增加 激活依赖于氧化还 原的一类转录因子以及植物防卫反应基因的表达 SA 在诱导水稻 黄瓜 番茄 棉花等提高抗病性的同 时 还会诱导苯丙氨酸解氨酶 几丁质酶和 null 1 3 葡聚糖酶等抗病性酶活性的提高 5 6 SA 在 植 物 体内的信号转导途径已经清晰 植物体内 SA 首先 与 SA 结合蛋白结合形成 SA 2 SABP 复 合 体 复合 体将信息传递给胞内第二信使如 H 2 O 2 等 信 号 通 过自我反馈机制放大后在胞内转导引发过敏反应 同时引起胞内氧化还原态改变 激活抗病相关转录 因子 最终诱导抗病相关基因表达使植株产生抗 性 7 目前 SA 诱导的植株抗病信号转导分子机 制 的研究主要集中在拟南芥 水稻等模式植物 在草莓 中的研究较少 null 材料 和方法 null null 实 验 材料 本实验于 2016 年 9 月 2017 年 5 月在江苏农 林职业技术学院实训基地进行 试验所用草莓品种 为 红颜 供试灰葡萄孢菌 nullnull null null nullnullnull nullnull 由镇 江市农科院惠赠 病菌培养基为马铃薯葡萄糖琼脂 培 养基 PDA null null nullnull 在草莓抗灰霉病中的作用机制 1 2 1 灰霉病病原菌的培养 将供试菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PDA 上 20 黑暗条件下培养 14 d 后备用 1 2 2 灰霉病接种草莓处理 2016 年 2 月 挑选生长健壮 无病虫害 长势 一致植株的第 3 片完整叶片 喷洒 0 1 2 4 mmol L 1 SA 溶 液 直 到滴水为宜 每 24 h 处理 1 次 每 个叶片共处理 2 次 每个处理 10 个重复 3 d 后 将叶片取下 带回实验室接种灰霉病菌 处理前将 试验用具在酒精灯灼烧灭菌后 用接种针在叶片 主脉附近扎 2 个小孔 并用打孔器在灰霉病菌培 养基上打孔 后用挑针挑取覆盖在叶片小孔上 每个处理以空白培养基做对照 将处理过的叶片 放入培养皿中 下铺无菌湿润滤纸保湿 放入 25 培养 光照时间 12 h 每天观察草莓叶片的变化 并拍照 处理 5 d 后 取样置于液氮中保存 进行抗 性相关指标测定 1 2 3 抗性相关酶活性测定 多酚氧化酶 PPO 活性检测参见参照余朝阁 2007 的试验方法进行 null 1 3 葡聚糖酶 null 1 3 glucanase 和几丁质 酶 chitinase 活性测定 取 0 5 g 叶片加 5 mL 0 1 mol L 1 的 乙 酸 乙酸钠缓冲液研磨 4 条件下 10000 r min 离心 10 min 提取粗酶液 在波长 585 nm 处比色测定 N 乙酰葡萄糖胺量 以每秒分解胶 状几丁质产生 1 10 9 mol N 乙酰葡萄糖胺量为一 个 酶 活力单位 U 单位为 U mg 1 protein null 1 3 葡 聚 糖酶活性利用 DNS 试剂测定以生成还原糖的 量来表示 单位为 U mg 1 protein 1 2 4 抗性相关基因表达测定 灰 霉 病处理后 记录草莓果实病情指数变化 根据 SGN 和 NCBI 上已公布的草莓病程相关蛋白 1 nullnull 1 null 1 3 葡聚糖酶基因 nullnullnull 几丁质 酶基因 nullnull null 基因片段的序列设计引物 采用 Real time PCR 仪进行抗病基因和水杨酸应答基因 表达量及草莓果实处理前后的基因表达差异 Real time 反应体系 3 nullg 总 RNA 反转录成 100 nullL cDNA 草莓 Actin 基因用做内参 反应程序如下 总 体系为 20 nullL 包括 10 nullL SYBR Premix Ex Taq 第 10 期 贾 思振等 水杨酸诱导草莓叶片灰霉病抗性机理的研究 21 TaKaRa 0 4 nullL 上游 引物 10 nullm 0 4 nullL 下游 引物 10 nullm 和 2 nullL cDNA 混合物放置于 Bio Rad iQ 荧光定量 PCR 仪中反应 95 循环 2 min 94 变性 20 s 56 复性 20 s 72 延伸 30 s 共 40 个循环 从 60 到 95 每隔 0 5 溶解 30 s 共 71 个循环 表 null 相关基因引物设计 Table 1 Primer design of related genes 基因 名称 引物序列 nullnullnull F 5 ACT CCG AAG AGA CCA AAT GGA G 3 R5 GGCTGT TTG GGG GAG AAG A 3 nullnull null F 5 TCG ATC TTT CAA TGG GTT TGG 3 R 5 CAG TGG TTT CGT GAG AGG TTTG 3 nullnull 1 F 5 TCACATTATGGCGACTGCAAC 3 R 5 TCTCTCCCACCCACAGGTTC 3 图 null 不同浓度水杨酸处理对草莓叶片灰霉病的影响 Fig 1 Effects of different concentrations of salicylic acid on grey mould in strawberry leaves null 结 果 与分析 null null 不同浓度水杨酸对草莓叶片灰霉病的影响 由 图 1 可 以看出 接种灰霉病菌后 草莓叶片随 着处理时间的延长发病情况逐渐加重 第 5 d 时达 到最大值 病斑直径达到了 18 3 mm 水杨酸处理 后叶片的发病状况得到明显抑制 1 mmol L 1 SA 处 理 时 病斑直径与对照相比没有明显减弱 随着 SA 浓度的增加 病斑直径逐渐变小 其中 4 mmol L 1 SA 处 理 时最明显 病斑直径为 6 2 mm 表 null 不同浓度水杨酸处理草莓叶片病斑直径 Table 2 Diameter of strawberry leaf spots treated with different concentrations of salicylic acid SA 浓 度 CK 1 mmol L 1 2 mmol L 1 4 mmol L 1 病斑 直径 mm 18 3 20 5 12 7 6 2 null null nullnull 对草莓叶片抗病相关酶活性的影响 如 图 2 所 示 SA 处理提高了草莓叶片几丁质 酶 null 1 3 葡聚糖酶和多酚氧化酶活性 SA 处理 后 几丁质酶的活性逐渐提高 在第 3 天达到最大 随着处理时间的延长 几丁质酶的活性逐渐减弱 但 是高浓度的 SA 处理下 几丁质酶的活性也高于对 照 其中 4 mmol L 1 SA 处 理 活性最高 在第 3 天时 达到了 2 5 U mg 1 min 1 比 第 1 天 增加了 2 33 倍 是对照的 1 56 倍 SA 处理后 null 1 3 葡聚糖 酶的活性逐渐提高 在第 5 天时达到了最高值 4 mmol L 1 SA 处理的叶片仍然处于最高值 达 到 了 74 U mg 1 protein 比第 1 天 增加了 3 08 倍 是对照 的 1 45 倍 多酚氧化酶的活性变化趋势与几丁质 酶相似 在处理的第 3 天时达到了最大值 后逐渐降 低 其中在第 5 天时降低 但是 SA 处理的叶片多酚 氧化酶的活性仍然高于对照 null null nullnull 对草莓叶片抗病相关基因表达的调控 作用 由图 3 所示 SA 处理的草莓叶片均提高了草莓 叶片病程相关蛋白 nullnull 1 几丁质酶 nullnull null 和 22 科 技 通 报 第 37 卷 图 null 不同浓度水杨酸处理对草莓叶片 抗病相关酶活性的影响 Fig 2 Effects of different concentrations of salicylic acid treatment on activities of disease resistance related enzymes in strawberry leaves null 1 3 葡 聚 糖酶 nullnullnull 基因的相对表达量 变化 趋势相似 接种灰霉病后 在第 2 天时各处理 nullnull1 基因相对表达量都增加了 2 倍以上 SA 处理显著提 高了 nullnull 1 基因的相对表达量 其中 4 mmol L 1 SA 处理的表达量是对照的 7 54 倍 随着 处理时间的延 长 nullnull 1 基因的相对表达量逐渐降低 第 5 天时达 到了最低值 几丁质酶基因的相对表达量变化也有 相似趋势 但是基因相对表达量变化较小 2 mmol L 1 SA 和 4 mmol L 1 SA 处理具有相似效果 两 者 之 间差异不显著 在处理第 2 天时 4 mmol L 1 SA 处 理 的 nullnull null 基因的相对表达量是对照的 1 78 倍 nullnullnull 的变化趋势与 nullnull 1 的变化相似 SA 处理 后 nullnullnull 的变化较大 处理第 3 天 4 mmol L 1 SA 处理的相对表达量是对照的 5 85 倍 后 对 照处理时 间的延长 nullnullnull 相对表达量逐渐降低 但仍然维 持着较高的水平 null 讨 论 研 究 表明 水杨酸与抗病性具有一定关系 植物 图 null 不同浓度水杨酸处理对草莓叶片抗 病相关基因相对表达量的影响 Fig 3 Effects of different concentrations of salicylic acid treatment on relative expression levels of disease resistance related genes in strawberry leaves 受到病原菌侵染后都会大 量 积累 SA SA 诱导许多 病程相关蛋白的表达 对病原菌侵染的抗性也相应 增加 8 外 源 SA 可 增强番茄处理叶及其上位非处 理叶抗灰霉病能力 提高苯丙氨酸解氨酶 PAL 过 氧化物酶 POD 和 PPO 等防御酶活性 PPO 在植 物抗病过程中起重要作用 Jia 等通过过表达草莓的 nullnull null 1 基因 推迟了真菌的侵染过程 并且导致病 原菌相关 PAL 过氧化物歧化酶 SOD POD 几丁 质酶基因的上调表达 9 PPO 抗病机制主要是参 与植物的次生代谢 产生一些毒性物质 直 接 毒杀病 原菌 如 O 醌等 10 真菌病害的大多数丝状真 菌在生长过程中 菌丝顶端同时合成几丁质和 null 1 3 葡 聚 糖 交联形成几丁质 葡聚糖或其他多糖 菌 丝顶端暴露的几丁质链会被几丁质酶和 null 1 3 葡 聚糖酶所水解 11 因 此 几 丁质酶和 null 1 3 葡聚 糖酶被认为是植物真菌病害防御的关键酶 它们在 抗菌 抑菌中起着重要作用 甚至能够直接杀死真 菌 李琳琳 12 等 研究番茄抗灰霉病时发现 SA 能 够 提高番茄幼苗抗灰霉病能力 SA 处理诱导了几丁 第 10 期 贾 思振等 水杨酸诱导草莓叶片灰霉病抗性机理的研究 23 质酶 及 null 1 3 葡聚糖酶等抗性相关酶活性的提 高 本研究结果表明 草莓叶片受到灰霉病的侵染 后 PPO CHI GLU 这 3 种酶的活性都急剧上升 这 说明体内抗病系统得到了诱导 抗病相关酶的被激 活 活性增强 我们通过检测处理后叶片的相关基 因表达量时发现 灰霉病处理后 nullnull 1 nullnull null 和 nullnullnull 3 个基因的表达量迅速升高 也说明了灰霉 病侵染后植物抗病系统得到了激活 酶活性显著提 高 水杨酸处理的草莓叶片 nullnull null nullnullnull 基因相 对表达量明显的高于对照 并且随着浓度的增加活 性增加比较明显 在处理第 3 d 4 mmol L 1 SA 处 理 的叶片相对表达 量达到最大值 随着受侵染时间的 延长 这些基因的表达量下降 这可能由于时间延 长 植物受伤害的程度变大 导致整个叶片受到了严 重的伤害 但是 SA 处理的叶片仍然高于对照 说明 SA 能够提高草莓叶片的抗灰霉病能力 这些表明 SA 诱导的抗病性促进抗病相关酶及基因表达 综上所述 外源施用 SA 影响草莓叶片抗氧化 酶系统 促进了抗病相关基因的表达 增加抗氧化酶 活性 激活了草莓抗灰霉病的防御途径 降低了草莓 叶片灰霉病的病情指数 提高了抗病相关酶活性及 其基因表达水平 参考文献 1 Williamson B Tudzynski B Tudzynski P nullnull nullnullnull nullnullnullnullnullnullnullnull nullnullnullnullnullnullnull the cause of grey mould disease Mol Plant Pathol 2007 8 561 580 2 Dean R Van Kan JA Pretorius ZA nullnull nullnullnull The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology Mol Plant Pothol 2012 13 414 443 3 Lewers KS Luo YG Vinyard BT Evaluating strawberry breeding selections for postharvest fruit decay Euphytica 2012 186 539 555 4 肖 长 坤 高苇 夏冰 等 设施栽培草莓灰霉病发生 规律及其综合防治 中国植保导刊 2012 32 24 26 5 张智慧 聂燕芳 何磊 等 外源水杨酸诱导水稻相关 防御酶活性及内源水杨酸含量的变化 J 华中农业 大学学报 2010 29 5 541 545 6 陈贵 华 张少英 外源 SA 对甜菜幼苗细胞壁 HRGP 和木质素含量的影响 J 作物杂志 2012 2 36 38 7 Yan S Dong X Perception of the plant immune signal salicylic acid Current Opinion in Plant Biology 2014 20 64 68 8 丁 丽 娜 杨国兴 植物抗病机制及信号转导的研究进 展 J 生物技术通报 2016 32 10 109 117 9 Jia H F Zhao P C Wang B J nullnull nullnull Overexpres sion of polyphenol oxidase gene in strawberry fruit delays the fungus infection process Plant Mol Biol Rep 2016 34 3 592 606 10 代 丽 宫 长荣 史霖 等 植物多酚氧化酶研究综述 J 植物生理科学 2017 23 6 312 317 11 许 梦 秋 钟增明 龚琰 等 几丁质酶在植物病害生物 防治中的应用 现代农业科技 2010 5 122 123 12 李琳琳 李天来 姜国斌 等 外源 Ca 2 对 水 杨酸诱导 番茄抗灰霉病的增效机制 J 应用生态学报 2015 26 11 3497 3502