宁夏西瓜、甜瓜白粉病病原菌鉴定及抗性种质资源筛选_王晓敏.pdf

年 月 甘 肃 农 业 大 学 学 报 第 卷 第 期 双 月 刊 宁夏西瓜 甜瓜白粉病病原菌鉴定及抗性 种质资源筛选 王晓敏 王禄星 宋建宇 刘艳 高艳明 李建设 张海英 许勇 宁夏大学农学院 宁夏 银川 宁夏现代设施园艺工程技术研究中心 宁夏 银川 宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室 宁夏 银川 宁夏设施园艺 宁夏大学 技术创新中心 宁夏 银川 北京市农林科学院蔬菜研究中心 北京 摘要 目的 针对宁夏特色优势作物西瓜 甜瓜白粉病发生日趋严重的问题 方法 采用镜检法 序列分 子鉴定和国际通用的甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主与标准鉴定体系 对宁夏地区不同地点 不同栽培方式的西瓜 甜瓜上采集的 份病菌样本进行白粉病病原菌及生理小种鉴定 并采用离体叶片鉴定方法对 份甜瓜种质资源 进行抗病性鉴定 结果 份病菌样本的分生孢子形态符合单囊壳白粉菌的形态特征 有纤维状体 病菌样本的 序列与单囊壳白粉菌 的 序列聚为一类 病菌样本对鉴别寄主的抗感反应与瓜 单囊壳白粉菌生理小种 表现一致 结论 引起宁夏地区西瓜 甜瓜白粉病的病原菌为单囊壳白粉菌 且其生理小种为小种 未发现其他生理小种 筛选出对白粉病免疫的材料有 发病率和病情指 数均为 高抗材料有 和抗病 共 份 发病率低且病情指数均在 以下 关键词 西瓜 甜瓜 白粉病 生理小种 抗性鉴定 中图分类号 文献标志码 开放科学 资源服务 标识码 文章编号 第一作者 王晓敏 副教授 博士研究生 主要从事蔬菜生物技术与遗传育种研究 基金项目 宁夏回族自治区农业特色优势产业育种专项 宁夏自然科学基金项目 宁夏回族自治区重点研发计 划 重大 重点项目 收稿日期 修回日期 甘 肃 农 业 大 学 学 报 年 近年来 宁夏西瓜 甜瓜产业栽培总面积超过 万 但随着种植面积的扩大 露地及设施甜 瓜白粉病危害日益严重 瓜类白粉病是一种在甜 瓜 黄瓜 南瓜 西瓜 西葫芦等瓜类作物上广泛发生 的世界性病害 已成为瓜类作物绿色生产的主要障 碍之一 该病从苗期到成株均可发病 主要危害 叶片 叶柄和茎蔓 在发病期白粉病菌呈指数增长 且迅速传播 使植株叶片大面积枯死 导致西瓜 甜 瓜产量和品质急剧下降 造成重大的经济损失 危 害瓜类白粉病的病原菌主要为苍耳单囊壳白粉菌 原 称 也称单囊壳白粉菌 和菊科高氏白粉菌 原称 也称二孢属白粉菌 杨静玲等 通过 序列分析将中卫压砂甜瓜的白粉病鉴定到单 囊壳属 李磊福等 通过基于 序列分析进行分 子鉴定 最终确定宁夏温室内甜瓜白粉病病原菌为 单囊壳白粉菌 但未对宁夏其他地区的瓜类白粉病 病原菌进行鉴定 引起不同国家和地区甜瓜白粉病 的致病菌其主要生理小种有所不同 至今已发现单 囊壳白粉菌存在 个生理小种 分别为小种 和 二孢属白 粉菌有 个生理小种 分别为 和 自 年以来 我国西瓜 甜瓜病理及育种工 作 者 先 后 在 浙 江 北 京 黑 龙 江 海 南 甘肃 陕西 上海 吉林 河 南 新疆 等地开展了西瓜 甜瓜主产区的白 粉病菌及其生理小种的鉴别工作 基本明确了我国 西瓜 甜瓜白粉病均由 引起 主要生理小 种至少有 个 分别为生理小种 和 由于 我国气候类型复杂 栽培模式多样 种植品种繁多 造成了不同地区的优势生理小种不同 因此 全 面了解我国瓜类白粉病菌的生理小种分布还需要一 定的时间和过程 尤其对宁夏地区西瓜 甜瓜白粉病 生理小种鉴定尚没有全面详细的报道 所以明确宁 夏地区西瓜 甜瓜白粉病菌的生理小种对于引进抗 源材料 开展抗病育种及白粉病防治方面均具有重 要意义 本研究拟通过病原菌形态学和 序列 国际通用瓜类白粉病鉴别寄主对西瓜 甜瓜白 粉病病原菌进行鉴定及生理小种鉴定 以期明确引 起宁夏地区西瓜 甜瓜白粉病的病原菌种属 生理小 种的分化 优势生理小种 并对宁夏地区 份甜瓜 种质资源进行离体叶片法抗病性鉴定 为有效开展 西瓜 甜瓜白粉病防治与抗白粉病育种提供依据 材料与方法 试验材料 西瓜 甜瓜白粉病病原样本 年 月 第 期 王晓敏等 宁夏西瓜 甜瓜白粉病病原菌鉴定及抗性种质资源筛选 月分别从宁夏银川 中卫 中宁 彭阳 隆德 泾源 青铜峡 平罗 盐池 吴忠 海原等 个地区西瓜 甜 瓜自然发病的病株上采集白粉病病叶 并于尽快接 种在感病甜瓜上进行分离纯化后的白粉病菌作为病 原样本 详细信息见表 表 宁夏地区西瓜 甜瓜白粉病病原样本采集信息 序号 地区 作物类型 栽培类型 银川 甜瓜 玻璃温室 中卫 甜瓜 露地 中宁 西瓜 露地 彭阳 甜瓜 露地 隆德 甜瓜 露地 泾源 甜瓜 露地 青铜峡 西瓜 露地 平罗 甜瓜 露地 盐池 西瓜 露地 吴忠 甜瓜 日光温室 海原 西瓜 露地 感病甜瓜品种 用于白粉病病原菌分离 纯 化与扩繁的感病甜瓜品种为 中原新羊角蜜 鉴别寄主 国际通用的瓜类白粉病生理小 种鉴定的一整套 个甜瓜鉴别寄主 和 均由北京市农林科学院蔬菜 研究中心提供 所有寄主材料在银川严格套袋自交 扩繁 试验方法 白粉病病原菌的分离纯化与扩繁 将采集 的不同地区的病叶样本先用无菌水洗掉表面灰尘 制成约 个 孢子悬浮液 用摩擦法接种到 宁夏大学农科实训基地温室内盆栽种植的中原新羊 角蜜甜瓜叶片上 将其放置在温室内搭建的小棚中 进行扩繁保存 每个小棚中只培养一个地区的白粉 病菌 严格分离 避免交叉污染 详见王禄星等 的 方法 白粉病病原菌的鉴定 孢子形态观察 分生孢子观察 用挑 针挑取纯化后发病叶片上白粉病病原菌的分生孢 子 采用无菌水悬浮 制作临时玻片 每个地区的白 粉病菌制作 个玻片 每个玻片在光学显微镜下选 取 个视野 每个视野观察 个孢子 用显微测微 尺测量分生孢子长度和宽度 并记录分生孢子着生 状态及形状 参照李金鸿等 的方法 萌发管观 察 首先将 琼脂水溶液滴至载玻片上 放在下面 垫有双层湿润滤纸的培养皿内 然后用挑针挑取少 量白粉菌分生孢子于琼脂液面 置于 的恒温箱 中培养 后取出 显微镜下观察芽管萌发 每个 地区的白粉病菌分别观察 个玻片 每个玻片各选 取 个视野 每个视野观察 个萌发孢子 显微测微 尺测量萌发管长度和宽度 并记录萌发管着生位置 纤维状体观察 用挑针挑取少许病原菌 分生孢子于载玻片上的 液滴中 盖上盖 玻片 显微镜下观察分生孢子是否有纤维状体 每个 地区的白粉病菌分别观察 个玻片 每个玻片观察 个视野 每个视野至少取 个分生孢子 瓠瓜接种试验 将上述 份甜瓜白粉 病菌的分生孢子配制成浓度为 个 的孢 子悬浮液 通过刷叶法接种于二叶期瓠瓜上 每个 地区材料接种 株 接种后置于盛有蒸馏水的塑 料桶保湿暗培养 取出放在温度为 温室内 后调查侵染情况 详见张艳菊等 的方法 白粉病菌的 序列比对和系统发育分析 用干净的软毛刷从新鲜繁殖的甜瓜叶片表面刷下 白粉病菌分生孢子 将其收集于 离心管中 按照 真菌提取方法进行 的提取 对获 得的白粉病菌基因组 进行检测 检测合格的 样品于 储存 采用真菌核糖体通用引 物 和 进行 扩增 反应体系见表 反应程序见 表 扩增产物或酶切反应产物均于 的 琼脂糖凝胶中电泳检测 将检测之后的基因组 样品送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测 序 登录 对 序列进行比对分析 并选择部分比对结果通过 软件对其进行 聚类分析 甘 肃 农 业 大 学 学 报 年 表 反应体系信息表 组分 体积 总体系 表 反应程序表 白粉病病原菌的生理小种鉴定 鉴别寄主准备 将 个鉴别寄主种子催 芽后播种于口径 的育苗钵内 每个苗钵内播 种 粒同一个品种 每个品种种植 个苗钵 出苗 后 选取 份长势较好的苗钵分组 每组包括 个 鉴别寄主 一组苗置于一个小棚内 并用塑料薄膜与 其他组隔离 避免交叉污染 详见张波等 的方法 鉴别寄主接种鉴定 于鉴别寄主子叶展 平期采用孢子悬浮液摩擦法接种 详见 接种 开始发病 充分发病后开始调查鉴别寄 主的 抗 感 反 应 病 情 分 级 标 准 参 照 王 娟 等 的 方法 将病情分为 级 级 整个植株没有病斑 级 仅子叶有很少量病斑 级 仅子叶有较多病斑 或子叶有病斑 茎上有很少量病斑 级 子叶有很 多病斑 茎上有少量病斑 级 子叶和茎上布满病 斑或真叶有病斑 级 植株因感病而死 计算病情指数 病级级数 发病株数 总株数 抗病 中间型 感病 根据甜瓜白粉病生理小种鉴别寄主对 份白粉病菌菌株的抗感反应 表 来确定其生理 小种 份甜瓜种质资源的离体叶片抗病性鉴定 采用灭菌后的打孔器将 份甜瓜种质资源 表 的第 片叶打成 叶碟 每个平板培养 基 上培养 片叶碟 用移液枪将浓度约为 表 甜瓜白粉病菌生理小种鉴别寄主及其抗感反应 鉴别寄主 单囊壳白粉菌 二孢白粉菌 表示感病 表示抗病 表示杂合 表示目前无数据 表示未知 第 期 王晓敏等 宁夏西瓜 甜瓜白粉病病原菌鉴定及抗性种质资源筛选 个 的白粉菌分生孢子悬浮液接种在叶片正面 中心 每份种质资源接种 个培养基 放入培养箱 白天 晚上 湿度 光暗交替的 条件下培养 接种 后开始观察记录 在 充分发病后调查发病率和病情指数 离体叶片法病 情分级标准参考邓丽君 的方法 详见表 计算病 情指数 病级级数 发病叶数 总叶数 根据病情指数 对 份甜瓜种质资源 进行抗感分级 详见表 表 离体叶片抗病性鉴定方法病情分级标准 级别 症状 级 无病斑 级 病斑上有淡薄菌丝层 不产生孢子 级 叶片上出现白色斑点 直径小于 产生一定量的饱子 级 叶片上白色斑点成粉状 直径 产饱量较多 级 叶片上的病斑全部成粉状 直径 产饱量多 表 甜瓜白粉病抗感分级标准 病情指数 抗病级别 免疫 高抗 中抗 抗病 感病 中感 高感 结果与分析 宁夏不同地区瓜类白粉病病原菌鉴定 瓜类白粉病病原菌孢子形态观察 通过对 宁夏 个地区的瓜类白粉病病原菌分生孢子形态 观察发现 图 表 分生孢子椭圆形 无色 串生 图 分生孢子长宽范围在 长宽比为 分生 孢子内有明显的纤维状体 纤维状体盘状 新月形 图 分生孢子萌发时 芽管从分生孢子侧面长 出 图 芽管的长度变化范围较大 图 分生孢子形态特征观察 表 宁夏不同地区白粉病病原菌分生孢子形态特征比较 地区 孢子长 宽 孢子长宽比 孢子有无纤维状体 芽管长 宽 芽管着生位置 银川 有 侧生 中卫 有 侧生 中宁 有 侧生 彭阳 有 侧生 甘 肃 农 业 大 学 学 报 年 续表 地区 孢子长 宽 孢子长宽比 孢子有无纤维状体 芽管长 宽 芽管着生位置 隆德 有 侧生 泾源 有 侧生 青铜峡 有 侧生 平罗 有 侧生 盐池 有 侧生 吴忠 有 侧生 海原 有 侧生 宽度变化范围相对较小 并没有观察到白粉病病原菌分生孢子有 性状态 通过分生孢子形状 大小 萌发管长宽 萌发 管侧生以及孢子内部含有发达的纤维状体等特征 初 步鉴定引起宁夏 个地区的西 甜瓜白粉病的病原 菌是苍耳单囊壳白粉菌 瓠瓜接种试验 个地区甜瓜白粉病菌接 种瓠瓜后 后开始出现白粉病 后表现明显 症状 图 说明 个地区的甜瓜白粉病菌均能侵 染 瓠瓜 因此可以确定引起宁夏 个地区的甜瓜 图 瓠瓜接种白粉病菌 的叶部症状 白粉病病原菌为苍耳单囊壳白粉菌 宁夏不同地区瓜类白粉病病原菌 序列分析 扩增得到宁夏地区瓜类白粉病菌 序列片 段长度约 图 将宁夏地区瓜类白粉病病 原菌 序列命名为 选择部分 比对结果 构建系统发育树 图 与苍耳单囊壳 白 粉 菌 的 序 列 聚 为 一 图 宁夏地区西瓜 甜瓜白粉病菌 序列扩增电泳图 图 基于 序列分析的系统发育树 第 期 王晓敏等 宁夏西瓜 甜瓜白粉病病原菌鉴定及抗性种质资源筛选 类 同源性为 判定宁夏地区甜瓜上的白粉病 菌为苍耳单囊壳白粉菌 宁夏不同地区瓜类白粉病病原菌生理小种 鉴定 如表 所示 宁夏 个地区白粉病病原菌对 等 个鉴别寄主均表现为感病 而对鉴别寄主 虽产生了不同程度的病 斑 但病斑未见扩展 且均表现为抗病 与表 中瓜 苍耳单囊壳白粉菌生理小种 的抗感反应表现一 致 因此 可以确定此次调查的宁夏 个西瓜 甜瓜 主要栽培区的白粉病病原菌生理小种均是苍耳单囊 壳白粉菌的生理小种 未发现其他生理小种 表 宁夏地区西瓜 甜瓜白粉病生理小种鉴定结果 鉴别寄主 银川 中卫 中宁 彭阳 隆德 泾源 青铜峡 平罗 盐池 吴忠 海原 鉴定结果 份甜瓜种质资源离体叶盘白粉病抗病性 鉴定 利用离体叶片抗病性鉴定方法对甜瓜 份种 质资源的白粉病抗病性进行鉴定 如表 所示 发病率与病情指数均为零 表现为免疫 抗病 表现为高抗 发病率低于 病情指数低于 玉露 美玉 号 绿洲红表 现为中抗 天蜜 新密 号表现为抗病 表现为感病 日本兰网 表现为中感 中 原新羊角蜜 表现为高感 接种 后 高感品种的发病率均高于 从发病程度上 看 中原新羊角蜜 抗病类型一致的种质资源材料之间的病情指数 无显著性差异 讨论 明确瓜类白粉病菌种属对抗病育种至关重要 表 离体叶片抗病性鉴定方法对甜瓜种质资源的 白粉病抗病性鉴定 品种 发病率 病情指数 抗病类型 中原新羊角蜜 日本兰网 新密 号 天蜜 甘 肃 农 业 大 学 学 报 年 续表 品种 发病率 病情指数 抗病类型 绿洲红 美玉 号 玉露 抗病 表示高感 表示中感 表示感病 表示抗病 表示 中抗 表示高抗 表示免疫 目前 国内有关甜瓜白粉病病原菌鉴定结果均表明 我国甜瓜白粉病是 所致 不存在其他种 本研究对宁夏 个地区的白粉病样品分类鉴定 符 合屈淑平等 对苍耳单囊壳白粉菌的形态描述 分 生孢子呈广椭圆形 内含纤维状体 初步确定宁夏地 区瓜类白粉病的病原菌为苍耳单囊壳白粉菌 但是 白粉菌的种类繁多 个体多态性明显 且其生长 生 理生化特征可能随着环境的变化而不稳定 因此 再 进一步采用瓠瓜接种试验 张艳菊等 认为只有单 囊壳白粉菌能侵染在瓠瓜上 由此进一步明确宁夏 地区瓜类白粉病为苍耳单囊壳白粉菌 再利用真核 生物内核糖体 的 序列对甜瓜白粉病菌 进行分子鉴定 最终明确了宁夏地区西瓜 甜瓜白粉 病均为苍耳单囊壳白粉菌 这与先前杨 静玲等 和李磊福等 对于宁夏中部干旱带压砂甜 瓜和宁夏温室甜瓜白粉病病原菌的鉴定结果一致 本研究首次通过国际通用的标准鉴定体系对宁 夏地区西瓜 甜瓜白粉菌生理小种进行了研究 结果 表明宁夏地区白粉菌生理小种均为苍耳单囊壳白粉 菌的生理小种 西瓜 甜瓜白粉病生理小种分化复 杂 我国已有不少学者对不同地区的甜瓜白粉病生 理小 种 进 行 了 研 究 在 北 京 黑 龙 江 海 南 甘肃 上海 吉林 和新疆 地区 均存在单囊壳白粉菌小种 但其中北京 海南和吉 林地区以 为优势生理小种 浙江地区主要 病原菌由生理小种 引起的 黑龙江还存在生理 小种 和新生理小种 甘肃也发现存在生理小 种 生理小种的快速分化导致新的生理小种很 快演替变成优势生理小种 导致抗性材料难以维持 对白粉病持久抗性 同时也导致不同地区优势生理 小种的不同 因此 今后还需要对宁夏地区西瓜 甜 瓜白粉病菌生理小种进行长期监测 明确整个宁夏 地区瓜类白粉病的种类及生理小种 为整个宁夏地 区的瓜类作物生产 种子繁育及白粉病抗病育种奠 定基础 预防甜瓜白粉病最有效的方法是选育抗病品 种 本研究采用离体叶片鉴定方法对宁夏地区 份 种质资源进行抗病性鉴定 结果表明 玉 露 天 蜜 日 本 兰 网 中原新羊角蜜 与室内苗期抗 病性鉴定方法的鉴定结果一致 抗病 美 玉 号 绿洲红 新密 号比室内苗期抗病性鉴定 方法的鉴定结果抗病性高了一个档 室 内苗期抗病性鉴定结果是感病 而离体叶片鉴 定结 果 是 高 感 高 了 个 档 离体叶片鉴定方法的鉴定结果比室内苗 期抗病性鉴定结果低了一个档 两种抗病性鉴定方 法的病情指数一致的有 份 占 份种质 资源抗感类型不一致 可能是由于两种鉴定方法之 间的误差导致 离体叶片抗病性鉴定方法发病速率 快 菌种用量少 环境因素可控 但叶片易被污染 控 制好 无 菌 条 件 的 前 提 下 适用于大量材料的鉴 定 因此用离体叶片接种鉴定甜瓜品种的抗病性 是可靠的 筛选出免疫材料 份 高抗材料 份 抗病 此研究结果为有效防 治宁夏甜瓜白粉病和抗白粉病新品种的选育奠定基 础 结论 本文明确了引起宁夏地区西瓜 甜瓜白粉病的 病原菌为苍耳单囊壳白粉菌 且其优势生理小种为小种 结果具有一定的 代表性 为有效的抗病育种提供科学依据 参考文献 王禄星 王晓敏 宋建宇 等 宁夏甜瓜白粉病室内苗期 抗病性鉴定方法及抗性种质资源筛选 中国瓜菜 第 期 王晓敏等 宁夏西瓜 甜瓜白粉病病原菌鉴定及抗性种质资源筛选 苏瑞 王惠林 高强 等 新疆部分地区籽用西瓜 甜瓜白 粉病菌生理小种鉴定 中国蔬菜 张学军 季娟 翟文强 等 新疆地区厚皮甜瓜白粉病菌 生理小 种 的 鉴 定 新 疆 农 业 科 学 杨静玲 刘建利 压砂甜瓜白粉病病原菌 序 列分析 安徽农业科学 李磊福 孙秋玉 史娟 等 宁夏温室瓜菜白粉病菌鉴定 及病害流行预测模型构建 植物保护学报 徐志豪 寿伟林 黄凯美 等 白粉病菌的生理小种及其 对不同基因型甜瓜的致病性 浙江农业学报 程鸿 孔维萍 苏永全 等 我国甜瓜白粉病研究进展 及生理小种的初步鉴定 长江蔬菜 李苹芳 朱凌丽 羊杏平 等 江浙沪甜瓜白粉病菌及 其生理小种的鉴定 中国瓜菜 王娟 宫国义 郭绍贵 等 北京地区瓜类蔬菜白粉病 菌生理小种分化的初步鉴定 中国蔬菜 刘秀波 张俊华 崔崇士 南瓜白粉病病原菌鉴定及抗 性鉴定方法研究 中国瓜菜 王萍 王学征 马鸿艳 等 黑龙江省甜瓜白粉病病原 菌鉴定及 序列分析 中国园艺学会 魏尊苗 黑龙江省瓜类白粉病菌生理小种鉴定及其多 样性分析 哈尔滨 东北农业大学 包海清 许勇 杜永臣 等 海南三亚地区葫芦科作物 白粉病菌生理小种分化的鉴定 长江蔬菜 刘东顺 程鸿 孔维萍 等 甘肃甜瓜主产区白粉病菌 生理小种的鉴定 中国蔬菜 张莉 张慧君 张建农 许勇 甘肃甜瓜白粉病病原种 及生理小种的鉴定 甘肃农业大学学报 咸丰 张勇 马建祥 等 陕西关中地区瓜类白粉病菌 生理小种的鉴定 西北农林科技大学学报 自然科 学版 张勇 张显 马建祥 等 甜瓜白粉病病原鉴定及抗源 筛选 中国园艺学会西瓜甜瓜专业委员会 全国 西瓜甜瓜科研与生产协作组 中国农业科学院郑州果 树研究所 纪念全国西瓜甜瓜科研与生产协作 周 年暨第 次全国西瓜甜瓜学术研讨会论文摘要集 中国园艺学会西瓜甜瓜专业委员会 全国西瓜甜瓜科 研与生产协作组 中国农业科学院郑州果树研究所 中国园艺学会 顾海峰 张旭 张文芳 等 上海地区西甜瓜白粉病菌 生理小 种 的 鉴 定 上 海 农 业 学 报 张成花 林涛 李菊芬 等 甜瓜白粉病病原鉴定及苗 期抗性鉴定 中国瓜菜 张波 王利波 崔四川 等 吉林省薄皮甜瓜主产区白 粉病菌 生 理 小 种 的 初 步 鉴 定 吉 林 蔬 菜 赵光伟 徐志红 徐永阳 等 郑州地区甜瓜白粉病菌 生理小种鉴定 中国瓜菜 邓丽君 新疆吐鲁番地区甜瓜白粉病生理小种鉴定及 抗性遗传分析 乌鲁木齐 新疆农业大学 李金鸿 徐雪芬 李惠霞 等 陇西县黄芪白粉病病原 鉴定及其生物学特性测定 甘肃农业大学学报 林珊宇 米桂宁 颜新梅 等 广西瓜类白粉病对醚菌 脂的抗药性及其对 种药剂的敏感性检测 南方 农业学报 柳东阳 晁岳恩 姜军 等 减少底肥施用量和农药施 用次数对小麦条绣病 白粉病及产量的影响 河南 农业大学学报 责任编辑 李辛