辣椒枯萎病主要致病菌的分离鉴定及农用拮抗菌筛选.pdf

辣 椒 枯 萎 病 主 要 致 病 菌 的 分 离 鉴 定 及 农 用 拮 抗 菌 筛 选 张 俊 庆 1 郑 安 科 1 高 立 红 1 孙 亚 敏 1 姜 志 阳 2 1 山 东 土 木 启 研 发 中 心 山 东 济 宁272507 2 中 科 院 沈 阳 生 态 应 用 研 究 所 辽 宁 沈 阳11 001 6 摘要 目的 分 离 鉴定辣椒枯萎病主要致病 菌 探寻能 够有 效 抑 制 该 致 病 菌 的 生 防 菌 株 方 法 采 用 植 物 病 害 组 织 致 病 菌 划 线 分 离 方法分离 致病菌 经 形 态 学 以及ITS 区域PCR 检测 确定菌 株 属性 通过平 板拮 抗筛 选 确 定对该 致病 菌具 有拮 抗作 用的 农用 生防 菌 株 结果 初步鉴定该 致病菌为尖孢镰刀 Fusariumoxysporum 将该致 病 菌与1 1 株 农用 微生物 芽 孢 杆 菌 和3 株 农 用 微 生 物 木 霉 菌 进 行 拮 抗试验 发现枯草 芽 孢 杆 菌 Bacillussubtilis 苏云金 芽 孢 杆 菌 Bacillusthuringiensis 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 Bacillusamyloliquefaciens 海 洋 芽 孢杆菌 Bacillusmarinus 坚强芽孢杆菌 Bacillusfirmus 甲基营 养 型芽孢 杆菌 Bacillusmethylotrophicus 6 株 芽 孢 杆 菌 对 该 致 病 菌 拮 抗效果明 显 长枝 木 霉 Trichodermalongibrachiatum 与 哈 茨 木 霉 Trichodermaharzianum 2 株 木 霉 菌 对 该 致 病 菌 具 有 明 显 的 拮 抗 效 果 结论 筛选到了8 株 能 够 有 效 抑制该病原菌的生防菌 株 为 以后 研究生 防 肥料奠 定了 基础 关键词 枯萎病 分 离 鉴定 拮抗菌 筛选 中图分类 号 S436 41 8 1 文献标识码 A 文章编号 051 7 661 1 2021 08 01 34 04 doi 1 0 3969 j issn 051 7 661 1 2021 08 035 开 放科学 资源 服务 标识 码 OSID IsolationandIdentificationoftheMainPathogensCausingCapsicumWiltandScreeningofAgriculturalAntagonisms ZHANGJun qing ZHENGAn ke GAOLi hongetal ShandongElephantResearchandDevelopmentCenter Jining Shandong272507 Abstract Objective Toisolateandidentifythemainpathogenicbacteriaofpepperfusariumwilt andtosearchforbiocontrolstrainsthat caneffectivelyinhibitthepathogenicbacteria Thepathogenicbacteriawereseparatedbystreakingandisolationofpathogenicbac teriafromplantdiseasetissues andthemorphologyandPCRdetectionofITSareawereusedtodeterminetheattributesofthestrains Through plateantagonisticscreening theagriculturalbiocontrolstrainswithantagonisticeffectsonthepathogenswasdetermined Result Thepatho genicbacteriawaspreliminarilyidentifiedasFusariumoxysporum Thepathogenicbacteriawasscreenedwith1 1strainsofagriculturalmicroor ganismsBacillusand3strainsofagriculturalmicroorganismsTrichodermainantagonisticexperiments ItwasfoundthatthesixstrainsofBacil lusincludingBacillussubtilis Bacillusthuringiensis Bacillusamyloliquefaciens Bacillusmarinus Bacillusfirmus Bacillusmethylotrophicus hadobviousantagonisticeffectonthepathogenicbacteria andtwostrainsofTrichodermaincludingTrichodermalongibrachiatumandTri chodermaharzianumhadobviousantagonisticeffectsonthepathogenicbacteria Conclusion Throughthisresearch 8biocontrolstrainsthat caneffectivelyinhibitthepathogenwerescreened whichpavesthewayforstudyingbiocontrolfertilizers Keywords Fusariumwilt Isolation Identification Antagonisticantibacterial Screening 作 者 简 介 张 俊 庆 1 991 男 甘 肃 武 威 人 硕 士 从 事 植 物 生 防 菌 的 应 用 研 究 收 稿 日 期 2020 08 1 3 枯萎病 作为一 种 常 见 的 植 物 病 害 已 成 为 制 约 经 济 作 物 发 展 的一大 主要病 害 特别是 对黄瓜 1 番 茄 2 茄 子 3 4 香 蕉 5 以及款 冬花 6 等造 成 了 巨 大 经济 损失 这 些 年 随 产 业 化 集 中 辣 椒 等 蔬 菜 复 种 指 数 的 提 高 枯 萎 病 的 发 生 呈 逐 年 增 长 趋 势 严 重 影 响 了 我 国 辣 椒 质 量 以 及 农 户 的 收 入 辣 椒 枯 萎 病 的发生 率一般 为1 5 30 严 重 时 达70 80 成 为 辣 椒 的一个 重要病 害 7 研 究 表 明 辣 椒 枯 萎 病 主 要 为 镰 刀 菌 所 致 黄 立 志 等 8 黄 素 芳 等 9 梁 建 根 等 1 0 研 究 表 明 广 西 玉 林 福 建 漳 州 山 西 等 辣 椒 枯 萎 病 均 由 尖 孢 镰 刀 菌 所 致 目 前 防治主 要以化 学手段 为 主 高残 留 耐 药 性 等 严 重 影 响 蔬 菜 品 质 1 1 引起 环 境 污 染 和 农 药 残 留 1 2 笔 者 从 病 原 菌 出 发 分 离 病 原 菌 探 索 对 该 病 原 菌 具 有 拮 抗 作 用 的 有 益 微 生 物 寻 找 对 应 的 生 物 防 治 手 段 从 生 物 学 角 度 提 高 辣 椒 品 质 减 少 损失 1 材料 与方 法 1 1 材 料 供 试材 料 取 自 安 徽 省 蚌 埠市 五 河县蔬 菜基地 该 基 地 蔬 菜 种 类 丰 富 种 植 密 度 大 复 耕 率 高 辣 椒 枯 萎 问 题 较 为 严 重 在 辣 椒 成 株 期 间 选 取 发 病 比 较 严 重 的 地 块 摘 取 样 本 基因组 提取试 剂盒购 自 上 海 生 物工 程 有 限 公 司 孟 加 拉 红 培 养 基 购 自 北 京 奥 博 星 生 物 科 技 有 限 责 任 公 司 其 成 分 蛋 白 胨5 0g L 硫 酸 镁0 5g L 磷 酸 二 氢 钾1 0g L 葡 萄 糖 1 0g L 氯 霉素0 1g L 孟 加 拉 红0 033g L 琼 脂20g L 马 铃 薯 琼 脂 糖 培 养 基 PDA 马 铃 薯 去 皮 200 0g 葡 萄 糖 20 0g 蒸 馏 水1000mL 煮 沸 后 保 持20min 并 用4 层 纱 布 过 滤 残 渣 加 入 琼 脂 粉1 5g L pH 自 然 DNA 扩 增 试 剂 盒 购 自 上 海生 物 工程 有 限 公 司 涉 及 到 的 芽 孢 杆 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 Bacillussubtilis 海 洋 芽 孢 杆 菌 Bacillusmarinus 甲 基 营 养 型芽 孢 杆菌 Bacillusmethylotrophicus 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 Bacillusthuringiensis 坚强 芽 孢 杆 菌 Bacillusfirmus 解 淀 粉 芽 孢杆 菌 Bacillusamyloliquefaciens 地 衣 芽 孢 杆 菌 Ba cilluslicheniis 巨 大 芽 孢 杆 菌 Bacillusmegaterium 胶 冻 样 芽孢 杆 菌 Bacillusmucilaginosus 高 地 芽 孢 杆 菌 Bacil lusaltitudinis 多黏芽 孢杆菌 Bacilluspolymyxa 由 山 东 土 木 启 生 物 科 技 有 限 公 司 研 发 中 心 保 存 生 防 真 菌 绿 色 木 霉 Trichodermaviride 哈 茨 木霉 Trichodermaharzianum 长 枝 木 霉 Trichodermalongibrachiatum 由 沈 阳 应 用 生 态 研 究 所 提 供 1 2 病 原菌 的 分离 纯 化 选取发 病植株 的病根 茎 部作为 分 离 标 本 分别 用 无菌 水 冲洗 干 净 并 将 组 织 切 小 块 在70 乙 醇 中浸 泡30s 然后放 入0 1 的 升汞 中 浸泡5min 捞出后 用 无 菌 水冲 洗1 0 次 以 上 在 无 菌 条 件 下 接 种 于PDA 平 板 上 接 种 时使 得 维管 束 一 面 与 培 养 基 正 面 接 触 在28 培 养 箱 安 徽 农 业 科 学 J AnhuiAgric Sci 2021 49 8 1 34 1 37 中 培 养3 5d 将长 出菌 落 切 取 边 缘 部 分 重 新 接 种 到 新 的 孟 加 拉 红 平 板 上 培 养 直 到 分 离 出 单 一 形 态 的 菌 种 并 将 不 同 组 织 的分离 菌落分 别保存 于4 冰箱 待用 6 将分离 到的病 原菌接 种 到PDA 液体培养 基中 在28 1 80r min 的 条件 下 培 养 分 别 以 灌 根 和 伤 口 接 种 形 式 接 种 到 健 康植株 上以确 认主要 致 病菌 并在 孟 加拉 红 PDA 培 养 基 上 分别观 察菌落 形 态 及 菌 丝 孢 囊 形 态 根 据Booth 1 3 的 方 法 进 行初步 鉴定 1 3 分 子 生 物 学 鉴 定 真 菌 基 因 组 提 取 采 用CTAB 法 1 4 通 过PCR 扩 增菌 株 的ITS 区 域 测 序 后 进 行 基 因 对 比 鉴 定 引 物F TCCGTAGGTGAACCTGCGG 引 物R TCCTCCGCT TATTGATAT 扩增程 序 94 预 变性1min 55 退 火1min 72 延 伸2min 共30 循环 最后72 延伸1 0min 扩 增完成 以 后通 过1 核酸 凝 胶电 泳 检 测 并 送 北 京 擎 科 生 物 测 序 将 测 序 序 列 在NCBI 中通 过BLAST 对 比 确 定致 病 菌种 类 1 4 农 用 拮抗 菌筛 选 将 主 要 致 病 菌在PDA 液 体培 养 基 中 28 1 80r min 条件下 培 养3 5d 形成 均 匀的悬 浮菌液 吸 取1 00 L 菌 悬液 均 匀 涂 布 到PDA 平 板上 封口在30 培养 箱 培养5 7d 选 取 长势 良 好的 部 位 铲取0 5m 2 大 小 的3 块 致 病 菌 均匀 接 种于 马 铃薯 培 养基 上 培养2 3d 取 出后在 培 养 基 中心 接 种芽 孢 杆菌 或 者生 防 真菌 30 培 养3 5d 观 察 拮 抗 情况 并 记录 抑 菌效 果 2 结 果与分 析 2 1 病原 菌 分离 与 纯化 通 过 对 根 部 和 茎 基 部 病 害 区 域 的 分 离 共 获得3 株纯 化 菌株 在PDA 斜 面 培 养 基 上 保 存 将 分 离 得到 的 纯化 菌 落 同 时 以6 1 0 6 个 孢 子 数 浇 灌 和 茎 基 部 切 伤 处涂 抹 的方 式 接种 到 室内 盆 栽 培 养 的 辣 椒 无 菌 苗 上 发 现 只 有1 号 致 病 呈 萎 蔫 症 状 较 明 显 在 幼 苗 根 部 出 现 病 斑 初 为 浅 黄 褐 色 后 呈 褐 色 最 后 变 成 黑 色 病 株 地 上 部 出 现 萎 蔫 最 后 叶片 发 黄 枯 死 与 田 间 辣 椒 枯 萎 病 表 现 症 状 相 同 初 步 确定1 号为 主 要致 病 菌 2 2 病 原菌 形 态 将1 号 菌 株 接 种 于PDA 培 养 基 上 菌 丝 为 白 色 菌 落 边 缘 呈 红 色 羊 毛 状 至 毡 状 菌 落 背 面 为 紫 红 色 大 型 分生 孢 子 形 态 为 镰 刀 形 稍 微 弯 曲 两 端 尖 无 色 大 部 分 单 生无 分 割 个 别 有1 3 个 分 隔 孢 子 大 小 为 67 5 1 64 7 m 364 7 81 1 7 m 图1 初 步 确 定 为 尖 孢 镰 刀 菌 图1 致病镰刀 菌 镜检结果 Fig 1 Microscopicexaminationofpathogenic F u s a r i u m 2 3 分 子 生 物 学 鉴 定 结 果 通 过 引 物 对ITS 区 域 进 行PCR 扩 增 发 现 在530bp 处 存 在1 条 清 晰的条 带 图2 经测 序后 通 过 基 因 数 据 库 对 比 发 现 其 与 尖 孢 镰 孢 Fusariumoxysporum 的 相 似 度 为99 进 一 步 佐 证 了 形 态 学 鉴 定 结 果 是 正 确 的 2 4 农 用 拮 抗 微 生 物 的 筛 选 共 验 证 了1 4 种 常 用 生 防 菌 与 该 病 原 菌 的 拮 抗 性 其 中 芽 孢 杆 菌1 1 株 有 拮 抗 效 果 的8 株 其 中 效 果 明 显 的 有6 株 分 别 为 枯 草 芽 孢 杆 菌 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 海 洋 芽 孢 杆 菌 坚 强 芽 孢 杆 菌 抑 制 效 果 一 般 的 有2 株 分 别 为 胶 冻 样 芽 孢 杆 菌 多 黏 芽 孢 杆 菌 无 抑 菌 效 果 的 有3 株 分 别 为 地 衣 芽 孢 杆 菌 巨 大 芽 孢 杆 菌 高 地 芽 孢 杆 菌 图3 表1 木 霉 菌3 株 3 株 都 存 在 抑 菌 效 果 其 中 哈 茨 木 霉 抑 菌 效 果 最 好 长 枝 木 霉 次 之 绿 色 木 霉 只 有 竞 争 性 抑 制 效 果 不 明 显 图4 表1 3 结论 与讨 论 通过分 离鉴定 发 现 引 起 辣 椒 枯 萎 病 的 病 原 菌 主 要 为 尖 图2 PCR 扩增ITS 区域核 酸凝胶电泳图 谱 Fig 2 PCRamplifiedITSregionnucleicacidgelelectrophoresis 孢 镰 刀 菌 并 对 该 致 病 菌 进 行 了 初 步 拮 抗 试 验 筛 选 发 现 哈 茨 木 霉 菌 和 枯 草 芽 孢 杆 菌 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 海 洋 芽 孢 杆 菌 坚 强 芽 孢 杆 菌 都 对 该 株 尖 孢 镰 刀 菌 具 有 5 3 1 49 卷8 期 张 俊 庆 等 辣 椒 枯 萎 病 主 要 致 病 菌 的 分 离 鉴 定 及 农 用 拮 抗 菌 筛 选 图3 芽孢杆菌拮 抗 致病镰刀 菌 Fig 3 B a c i l l u santagonizes F u s a r i u m 较 好 的抑制 作用 其中哈 茨 木 霉 效 果 最 佳 与 此 前 研 究 发 现 哈 茨 木 霉 能 够 有 效 抑 制 番 茄 黄 瓜 西 瓜 枯 萎 病 的 结 果 相 似 1 5 1 6 曹 君等 1 7 研 究 发 现 枯 草 芽 孢 杆 菌 和 哈 茨 木 霉 搭 配 后 共 同作用 对棉花 枯萎病 有 较 强 的 抑 制 作 用 充 分 证 实 芽 孢 杆 菌 木 霉 菌 能 够 有 效 抑 制 植 物 病 害 的 发 生 在 现 有 的 发 酵 基 础 上有效 地将芽 孢杆菌 和 木 霉 菌 进 行 复 配 使 其 在 作 物 根 系 周 边 建 立 有 效 的 防 御 群 体 阻 断 尖 孢 镰 刀 菌 的 侵 染 同 时 还 能够 对 作物 生 长起 到 一定 的 促进 作 用 1 8 20 该结 果 将 减 少 化 学 农 药 的 使 用 实 现 一 个 点 对 点 的 生 物 防 治 为 以 后 生 物 肥 料 生 物 农 药 的 开 发 提 供 科 学 依 据 同 时 利 用 微 生 物 菌 来 防 治 植物 病 虫 害 具 有 高 效 经 济 无 副 作 用 等 优 点 另 一 方 面 该 研究 中 筛选 出 的 致 病 菌 又 可 以 作 为 靶 向 病 原 菌 用 于 筛 选 土 壤有 益 微生 物 进 一步 完 善农 用 微生 物 体系 6 3 1 安徽农业 科学 2021 年 图4 木霉 菌拮抗致病 镰刀菌 Fig 4 T r i c h o d e r m aantagonizes F u s a r i u m 表1 农用 生防拮抗菌 筛 选 Table1 Screeningofagriculturalbiocontrolantagonists 类型 Type 拮抗菌 Antagonistic bacteria 抑 菌情 况 Antibacterial situation 细菌 枯草芽孢杆 菌Bacillussubtilis Bacteria 海洋芽孢杆 菌Bacillusmarinus 甲基营养型 芽孢杆菌Bacillusmethylotrophicus 苏云金芽孢 杆菌Bacillusthuringiensis 坚强芽孢杆 菌Bacillusfirmus 解淀粉芽孢 杆菌Bacillusamyloliquefaciens 地衣芽孢杆 菌Bacilluslicheniis 巨大芽孢杆 菌Bacillusmegaterium 胶冻样芽孢 杆菌Bacillusmucilaginosus 高地芽孢杆 菌Bacillusaltitudinis 多黏芽孢杆 菌Bacilluspolymyxa 真菌 绿色木霉Trichodermaviride Fungi 哈茨木霉Trichodermaharzianum 长枝木霉Trichodermalongibrachiatum 注 抑菌 性强 抑菌性一般 竞争性抑 制 不抑菌 Note Strongantibacterial effect General antibacterial effect Competitiveinhibition Noantibacterialeffect 参 考 文 献 1 吴 凤 芝 孟 立 君 文 景 芝 黄 瓜 根 系 分 泌 物 对 枯 萎 病 菌 菌 丝 生 长 的 影 响 J 中 国 蔬 菜 2002 5 26 27 2 莫 贱 友 番 茄 枯 萎 病 和 青 枯 病 的 诊 断 与 防 治 技 术 J 长 江 蔬 菜 2004 5 28 29 3 张 燕 燕 柏 广 利 孙 雪 花 茄 子 枯 萎 病 的 发 生 与 综 合 防 治 J 现 代 农 业 科 技 201 1 1 0 1 74 1 79 4 吴 健 刘 才 宇 汪 德 尚 等 K3 K5 抑 菌 剂 对 紫 长 茄 细 菌 性 枯 萎 病 的 防 治 效 果 J 安 徽 农 业 科 学 201 4 42 1 71 72 84 5 彭 埃 天 宋 晓 兵 凌 金 锋 等 4 香 蕉 枯 萎 病 菌4 号 生 理 小 种 分 子 检 测与 枯 萎 病 生 物 防 治 研 究 进 展 J 果 树 学 报 2009 26 1 77 81 6 刘 会 清 张 爱 香 马 海莲 等 款冬 花枯萎病的 病原分离 鉴 定 J 河 南 农 业 科 学 201 0 39 1 1 73 75 7 郝 晓 娟 贺 运 春 辣 椒 枯 萎 病 的 防 治 J 北 方 园 艺 2003 5 61 8 黄 立 志 戚 佩 坤 玉 林地 区辣椒枯萎 病的病原菌鉴 定 J 广西农业 大 学 学 报 1 994 1 3 4 348 352 9 黄 素 芳 朱 育 菁 肖 荣 凤 等 辣 椒枯萎病原 菌分离鉴定 及其在植 株 体 内 的 分 布 J 厦 门 大 学 学 报 自 然 科 学 版 2004 43 S1 71 73 1 0 梁 建 根 王 建 明 辣 椒 枯 萎 病 病 原 的 初 步 研 究 J 山 西 农 业 大 学 学 报 自 然 科 学 版 2002 22 1 29 31 45 1 1 PAULITZTC B LANGERRR Biologicalcontrolingreenhousesystems J Annualreviewofphytopathology 2001 39 1 1 03 1 33 1 2 COOKRJ BRUCKARTWL COULSONJR etal Safetyofmicroorgan ismsintendedforpestandplantdiseasecontrol Aframeworkforscientific uation J Biologicalcontrol 1 996 7 3 333 351 1 3 BOOTHC 镰 刀 菌 属 M 陈 其 焕 译 北 京 农 业 出 版 社 1 988 1 92 1 93 1 4 吴 发 红 黄 东 益 黄 小 龙 等 几 种 真 菌DNA 提 取 方 法 的 比 较 J 中 国 农 学 通 报 2009 25 8 62 64 1 5 姚 彬 王 傲 雪 李 景 富 哈 茨 木 霉 对4 种 番 茄 病 原 真 菌 抑 制 作 用 的 研 究 J 东 北 农 业 大 学 学 报 2009 40 5 26 31 1 6 蒲 金 基 曾 会 才 绿 色 木 霉LTR1 2 1 对 黄 瓜 枯 萎 病 菌 防 治 作 用 机 制 的 初 步 研 究 J 热 带 农 业 科 学 2002 22 4 22 25 1 7 曹 君 高 智 谋 潘 月 敏 等 枯草芽孢 杆菌BS 菌株和哈 茨木 霉TH 1 菌 株 对 棉 花 枯 黄 萎 病 菌 的 拮 抗 作 用 J 植物 病理 学报 2005 35 S1 1 70 1 72 1 8 曹 明 慧 冉 炜 杨 兴 明 等 烟 草 黑 胫 病 拮 抗 菌 的 筛 选 及 其 生 物 效应 J 土 壤 学 报 201 1 48 1 1 51 1 59 1 9 杨 合 同 唐 文 华 RYDERM 木 霉 菌 与植物病害的 生物防治 J 山 东科 学 1 999 1 2 4 7 1 5 20 20 张 霞 唐 文 华 张 力 群 枯 草 芽 孢 杆 菌B931 防 治 植 物 病 害 和 促 进 植 物 生 长 的 作 用 J 作 物 学 报 2007 33 2 236 241 上 接 第1 33 页 1 1 王 伟 李 术 娜 李 红 亚 等 大丽轮枝 菌 拮抗细菌菌 株1 2 51 的筛选鉴 定 与 抗 菌 物 性 质 分 析 J 中 国 农 学 通 报 2009 25 1 9 1 4 1 9 1 2 索 雅 丽 李 术 娜 李 红 亚 等 番茄灰 霉病菌颉颃 菌株的筛选 及功能基 因 的 分 析 J 中 国 植 保 导 刊 201 0 30 8 7 1 0 1 3 杜 淑 涛 李 术 娜 朱 宝成 白菜黑斑 病 拮抗细菌BacillusvelezensisDL 59 的 筛 选 鉴 定 及 田 间 防 效 实 验 J 河 北 农 业 大 学 学 报 201 0 33 6 51 56 1 4 吴 英 俊 林 宝 英 梅 双 双 等 香 蕉 枯 萎 病 拮 抗 菌 株BS1 1 抗 真 菌 活 性 物 质 的 研 究 J 安 徽 农 业 科 学 201 4 42 35 1 2505 1 2507 1 251 5 1 5 崔 文 会 炊 春 萌 孙 雪 等 贝 莱斯芽孢杆 菌对果蔬土传 病害 的 抑 菌 效 果 研 究 J 工 业 微 生 物 2020 50 5 1 5 20 1 6 MENGQX JIANGH HAOJ J Effects of Bacillus velezensis strain BAC03inpromortingplantgrowth J Biologicalcontrol 201 6 98 1 8 26 1 7 罗 楚 翔 彭 建 杨 欢 等 烟 草 赤星病拮抗 芽胞杆菌的筛 选及 培 养 基 优 化 J 中 国 烟 草 科 学 201 4 35 3 50 55 7 3 1 49 卷8 期 张 俊 庆 等 辣 椒 枯 萎 病 主 要 致 病 菌 的 分 离 鉴 定 及 农 用 拮 抗 菌 筛 选