花椰菜BraERF023a的克隆及在响应盐和干旱胁迫中的功能.pdf

中国农业科学 2021 54 1 152 163 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2021 01 011 收稿日期 2020 04 12 接受日期 2020 06 29 基金项目 国家自然科学基金 31872115 天津市科技计划种业科技重大专项 18ZXZYNC00160 国家科技重大专项 2018ZX08020003 001 003 联系方式 通信作者李慧 E mail lihui 通信作者贺丽霞 E mail helx 开放科学 资源服务 标识码 OSID 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在响应盐和干旱胁迫 中的功能 李慧 1 韩占品 1 贺丽霞 2 杨亚苓 1 尤书燕 2 邓琳 2 王春国 2 1 天津农学院园艺园林学院 天津 300384 2 南开大学生命科学学院 天津 300071 摘要 目的 在前期从花椰菜中筛选 鉴定出多个逆境胁迫应答相关ERF Ethylene responsive factors 转录因子的基 础上 对其中一个未知功能的转录因子 BraERF023a进行克隆 并阐释其在盐及干旱胁迫条件下的表达特征及功能 方法 对花椰菜中的 BraERF023a进行克隆 采用MEGA 6等生物学软件对其序列特征进行分析 采用qRT PCR方法分析 BraERF023a 在盐及干旱胁迫条件下的表达特征 进而构建过表达载体并转化拟南芥 对 BraERF023a 过表达转基因拟南芥株系在盐及干 旱胁迫下的表型 生存率进行观察 分析 结果 序列分析证实 花椰菜 BraERF023a 编码区长度为 597 bp 编码含 198 个氨基酸的蛋白质 其内含有一个 AP2 保守结构域 BraERF023a 在十字花科芸薹属植物中具有很高保守性 转录表达模式 分析显示 盐及干旱胁迫条件均可显著诱导花椰菜 BraERF023a 的表达 进一步的功能分析显示 在盐及干旱胁迫处理条件 下 过表达 BraERF023a的转基因拟南芥株系比野生型对照生长势更好 植株生存率更高 盐及干旱耐受能力明显增强 结 论 BraERF023a在花椰菜响应盐及干旱胁迫中发挥重要的正向调控作用 过表达 BraERF023a可显著提高转化株对盐及干旱 的胁迫耐受 关键词 花椰菜 ERF转录因子 BraERF023a 盐胁迫 干旱胁迫 Cloning and Functional Analysis of BraERF023a Under Salt and Drought Stresses in Cauliflower Brassica oleracea L var botrytis LI Hui 1 HAN ZhanPin 1 HE LiXia 2 YANG YaLing 1 YOU ShuYan 2 DENG Lin 2 WANG ChunGuo 2 1 College of Horticulture and Landscape Tianjin Agricultural University Tianjin 300384 2 College of Life Sciences Nankai University Tianjin 300071 Abstract Objective In our previous study Ethylene responsive factors ERF s involved in abiotic stress responses in cauliflower were identified In the present study one of these ERF transcription factors with unknown function named BraERF023a was cloned The expression profiles and function of BraERF023a under salt and drought stresses were further explored Method BraERF023a was cloned by RT PCR in cauliflower The sequence characteristics of BraERF023a were analyzed by biosoftwares such as MEGA 6 The expression profiles of BraERF023a under salt and drought stresses were explored by qRT PCR BraERF023a overexpression vector was then constructed and genetically transformed into Arabidopsis The phenotypes and survival rate of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis under salt and drought stresses were observed and analyzed Result Sequence analysis confirmed that BraERF023a coding region was 597 bp in length and encoded a protein containing 198 amino acids with an AP2 conserved domain BraERF023a was highly conserved in Brassica The expression level of BraERF023a significantly increased 1 期 李慧等 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在响应盐和干旱胁迫 中的功能 153 under both salt and drought stresses in cauliflower Functional analysis indicated that comparative with the wild type controls overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis lines exhibited better growth vigor and higher plant survival rate under salt or drought stress Conclusion BraERF023a played important roles in positive response to salt and drought stresses in cauliflower Overexpression of BraERF023a in Arabidopsis could significantly improve the tolerance of transgenic lines to salt and drought stresses Key words cauliflower ERF transcription factor BraERF023a salt stress drought stress 0 引言 研究意义 ERF 转录因子隶属于 AP2 ERF 转录 因子超家族 在植物响应逆境胁迫中发挥重要作用 花椰菜是重要的蔬菜作物 土壤盐渍及干旱是造成花 椰菜种植减产的主要环境灾害 但对花椰菜响应盐及 干旱胁迫的分子基础认识十分有限 这已成为采用分 子育种等手段创制花椰菜抗逆新种质及培育新品种的 重要瓶颈 因此 克隆 ERF 等逆境应答相关转录因子 或基因并阐释其功能 对开展抗逆花椰菜分子育种及 基因靶向育种具有重要意义 前人研究进展 植物 在生长发育过程中需要不断应对持续变化的不利环 境 如动物啃食 病原体侵染等生物胁迫和干旱 高 温 土壤盐渍等非生物胁迫 这其中干旱 盐害及温 度胁迫是影响植物地理分布 造成农作物减产甚至绝 收的主要环境灾害 1 因此 阐释植物响应逆境胁迫 的分子基础及调控机制 进而在作物中开展抗逆分子 育种一直是植物学研究的前沿及热点领域 已有研究 表明 WRKY MYB bZIP NAC 和 AP2 ERF 等转 录因子家族成员在植物生长发育及响应各类逆境胁迫 中发挥重要作用 2 3 其中 AP2 ERF 转录因子家族 为植物所特有 该家族成员具有参与 DNA 结合的 AP2 保守结构域 该结构域约由 60 个氨基酸残基按 照 3 个 折叠和 1 个 螺旋的方式构成一个典型三 维结构 4 6 根据 AP2 结构域的数量和识别序列的不 同 AP2 ERF 转录因子家族可以分为 AP2 ERF DREB RAV 和 Soloist 5 个亚家族 7 8 其中 ERF 亚 家族只含有 1 个 AP2 结构域 被证实主要通过识别并 特异性结合各类胁迫响应相关基因顺式作用元件 而在植物抵抗各种逆境胁迫过程中发挥重要的调控 作用 6 9 水稻中 ERF 亚家族成员 SNORKEL1 SK1 和 SNORKEL2 SK2 可以促进水稻节间伸长 从而 使植株可以在深水环境中存活 10 在拟南芥中过表达 菊花 CmERF053 的研究表明 CmERF053 可能参与细 胞分裂相关的侧枝形成调控途径 同时在植物抵御干 旱胁迫中发挥作用 11 大豆中 GmERF6 能够被干旱诱 导表达 将 GmERF6 在拟南芥中过表达可显著提高转 化株的抗旱性 12 在拟南芥中过表达甜薯 IbRAP2 12 和芜菁 BrERF4 同样也可提高转化株对盐和干旱胁迫 的耐受性 13 14 PARK 等 15 研究发现拟南芥 AtERF71 HRE2 功能缺失可使突变株表现为盐敏感 而将 AtERF71 HRE2 转入突变体中 植株表现出耐盐 性 可成功抵抗渗透胁迫 且提高转化株对低氧胁迫 的耐受能力 此外 研究证实 辣椒的 CaERFLP1 16 和 CaPF1 17 番茄的 TERF1 18 和 JERF1 19 以及小麦 中 TaERF1 20 的过表达均可显著提高转化株对盐及 低温等逆境的适应能力 综上所述 ERF 转录因子 已被证实在植物响应逆境胁迫 特别是非生物逆境 胁迫中发挥重要作用 本研究切入点 虽然在不 同植物中已有多个 ERF 转录因子被克隆并证实其在 逆境应答中发挥重要作用 但对 ERF 转录因子在花 椰菜逆境应答中的功能及调控机制仍知之甚少 笔 者实验室前期对花椰菜中的 AP2 ERF 家族成员采用 高通量转录组测序方法进行了分析 从中筛选 鉴 定到 146 个 ERF 转录因子 并证实包括 BraERF025a 等在内的多个 ERF 亚家族成员在盐及干旱胁迫前后 呈现显著差异表达特征 21 进一步的分子进化树分析 结果表明 BraERF023a 是与 BraERF025a 同属于一个 进化分支的 ERF 亚家族成员 二者具有较近的亲缘关 系 21 但 BraERF023a 是否也响应盐及干旱胁迫 且 其是否在花椰菜抵抗盐及干旱胁迫中发挥作用仍未 知 拟解决的关键问题 对花椰菜中的 BraERF023a 进行克隆 揭示其序列特征 以及在盐及干旱胁迫条 件下的表达特征 并通过过表达分析阐释 BraERF023a 在盐及干旱胁迫应答中的功能 1 材料与方法 试验于 2017 2019 年在南开大学生命科学学院 植物细胞及分子遗传学实验室进行 1 1 试验材料 供试花椰菜 津品 70 种子由天津市科润蔬菜 研究所孙德岭研究员惠赠 拟南芥为哥伦比亚生态型 154 中 国 农 业 科 学 54卷 克隆载体 pEASY T1 购自北京全式金生物技术有限公 司 植物表达载体 pCAMBIA3301 大肠杆菌 DH5 农杆菌菌株 LBA4404 由笔者实验室保存 1 2 DNA 提取 野生型和过表达 BraERF023a 转基因拟南芥 花 椰菜幼苗新鲜组织 于研钵中加入液氮快速研磨成粉 末状 采用经典 CTAB 法提取 DNA ddH 2 O 于 4 过 夜溶解 DNA 沉淀 在溶解液中 RNase A 于 37 金属 浴中反应 2 h 除去 RNA NanoDrop ND 1000 检测 DNA 浓度和质量 高质量的 DNA 于 20 保存备用 1 3 RNA 提取及反转录 参照植物总 RNA 提取试剂盒的操作说明提取花 椰菜及拟南芥叶片总 RNA NanoDrop ND 1000 检测 提取 RNA 的浓度 2 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完 整性 采用 M MLV 反转录酶合成 cDNA 第一链 具 体操作参照 Promega 公司的 M MLV 反转录说明书进 行 1 4 花椰菜不同逆境胁迫处理 待花椰菜幼苗长至四片真叶时 将幼苗从营养 土中取出 自来水缓缓冲洗根部 注意不要伤害到 根系 随后将幼苗分为两组 每组至少 16 个单株 将其中一组幼苗根部直接浸入含有 200 mmol L 1 NaCl 的水溶液进行盐胁迫处理 另外一组幼苗根部 浸入含 20 PEG6000 的水溶液中进行模拟干旱处 理 分别在 0 4 8 12 和 24 h 时摘取叶片并进行 总 RNA 提取 提取的 RNA 反转录合成 cDNA 第一 链 80 保存备用 1 5 不同胁迫处理条件下 BraERF023a 表达特征的定 量表达分析 采用 qRT PCR 方法对花椰菜不同胁迫处理下 BraERF023a的表达特征进行分析 反应体系为 20 L 其中含有 10 L 2 SYBR Green反应 mix 罗氏公司 1 L BraERF023a 定量引物 表 1 以花椰菜 BraActin 为内参 采用 2 CT 法进行定量数据分析 1 6 BraERF023a 植物过表达载体构建 以花椰菜 cDNA 为模板扩增具有 Nco I和 BstE II 酶切位点的 BraERF023a 编码区 cDNA 将 BraERF023a 的 PCR 扩增产物与 pEASY T1 克隆载体连接 参照说 明书 采用热激法将重组载体转化大肠杆菌 DH5 利用 Nco I BraERF023a F BstE II BraERF023a R 引物 组合对阳性克隆进行鉴定 表 1 并进一步对阳性 克隆进行测序分析 对含有 BraERF023a 正确序列的 阳性克隆及 pCAMBIA3301 表达载体分别进行 Nco I 表1 BraERF023a 克隆 载体构建和定量 RT PCR 分析引物 序列 Table 1 Primers used for BraERF023a cloning vector construction and qRT PCR assay 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence 5 3 BraERF023a F ATGCTGAGTACAGTGAGTGAAACC BraERF023a R TCACAGACACGCCATGAACTG Nco I BraERF023a F CCATGGATGCTGAGTACAGTGAGTG BstE II BraERF023a R GGTCACCTCACAGACACGCCAT qBraERF023a F CCACCACTTACCAACGAAC qBraERF023a R AAGATCCGAGCCAAATCCG 35S F AACAGAACTCGCCGTAAAG BraActin F GCTCCTCTTAACCCAAAGGC BraActin R CACACCATCACCAGAATCCAGC AtActin F GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG AtActin R AACGACCTTAATCTTCATGCTGC 下划线指限制性酶切位点 The underlines indicated the restriction endonuclease cleavage sites 和 BstE II 双酶切 回收酶切片段 利用 T4 DNA 连接 酶将 BraERF023a 连接至 pCAMBIA3301 载体的 CaMV 35S 启动子下游 筛选获得 35S BraERF023a 重组表达载体 采用热激法转化农杆菌 LBA4404 利 用 BraERF023a 特异引物和组合引物 35S F BraERF023a R 对农杆菌阳性转化菌株进行分子鉴定 表 1 将含有 35S BraERF023a 重组质粒的农杆 菌采用浸花法遗传转化拟南芥 1 7 农杆菌介导 BraERF023a 过表达载体遗传转化拟 南芥 于 250 mL 液体 YEB 培养基中 扩大培养含有 35S BraERF023a 重组质粒的阳性农杆菌 使其 OD 600 值约为 1 2 1 6 5 500 r min 离心 10 min 收集菌体 用 500 mL 5 的蔗糖溶液 含终浓度为 0 05 的 silwet L 77 重悬菌体 配成转化液 于盛花期将拟南芥花 序浸入转化液中浸染 30 s 用保鲜膜包好植株 平置 于托盘中避光培养 24 h 7 d 后再次转化 两次转化完 成后将拟南芥置于培养室中继续培养至种子成熟 收 集种子 记为 T 0 代 1 8 BraERF023a 过表达拟南芥的抗性筛选及鉴定 将春化后的 BraERF023a 转基因 T 0 代拟南芥种子 种于营养土中 待其长出两片真叶后 喷洒稀释 10 000 倍的 Basta 溶液 对转化株进行抗性筛选 对筛选 获得的 T 0 T 1 T 2 和 T 3 代抗性转化株进一步提取其 1 期 李慧等 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在响应盐和干旱胁迫 中的功能 155 DNA 利用特异引物 BraERF023a F BraERF023a R 和组合引物 35S F BraERF023a R 进行 PCR 扩增 表 1 检测 BraERF023a 是否已整合到拟南 芥基因组中 进一步提取 T 3 代纯合抗性转化株 RNA 以 qBraERF023a F qBraERF023a R 为引物 采用 qRT PCR方法检测 BraERF023a在拟南芥转化株 中的表达特征 收获纯合的 T 3 代转化株种子用于后续 分析 1 9 BraERF023a 过表达拟南芥的表型及抗性分析 将 T 3 代过表达 BraERF023a 拟南芥转化株系和 野生型对照种子同时播种 在相同的环境条件下进行 培养 并对其株高 茎粗 抽薹时间 分枝数目 果 荚长短等表型进行观察 此外 待过表达 BraERF023a 拟南芥转化株系和野生型对照长至 3 周时 在一次性 浇足水后 7 d 改为浇灌 200 mmol L 1 NaCl 溶液进行 为期 3 周的盐胁迫处理 3 周后观察二者在盐胁迫下 的表型变化 对长至 3 周的过表达 BraERF023a 拟南 芥转化株系和野生型对照在一次性浇足水后 停止浇 水并进行为期 20 d 的干旱胁迫处理 之后复水 观察 复水 10 d 后二者的干旱胁迫表型并统计其存活率 2 结果 2 1 BraERF023a 的克隆及序列分析 分别以花椰菜 DNA cDNA 为模板 利用特异性引 物组合 BraERF023a F BraERF023a R 扩增 BraERF023a 的全长编码区 表 1 扩增产物的电泳检测结果表 明 无论是以 DNA 还是 cDNA 为模板均能扩增出一 条约 600 bp 的特异条带 其长度与前期转录组测序获 得的 BraERF023a 序列长度一致 证实花椰菜 BraERF023a 序列中无内含子 进一步对扩增产物进 行 TA 克隆及测序 测序结果显示 BraERF023a 编码 区全长 597 bp 预期编码一个含有 198 个氨基酸的蛋 白质 图 1 序列分析发现 BraERF023a 包含一个 AP2 保守结构域 该结构域包含 3 个 折叠和 1 个 螺旋 且保守结构域中第 14 和 19 位氨基酸分别为丙 氨酸和天冬氨酸 均符合 ERF 转录因子的典型结构特 征 图 1 进一步利用 ProtFun 2 2 Server http www cbs dtu dk services ProtFun 对 BraERF023a 的蛋白功 能进行预测分析 结果显示 BraERF023a 可能主要在 植物生长发育及转录调控两个过程中发挥作用 此外 序列比对及聚类分析结果显示 BraERF023a 与 B napus B oleracea B rapa 等十字花科芸薹属其他植 物中的 ERF023 序列具有较高相似性 大于 90 而与水稻 玉米 高粱等禾本科植物中的 ERF023 相 似性较低 表明 ERF023 在十字花科芸薹属作物中具 有较高保守性 其可能具有相似的功能 2 2 BraERF023a 在盐胁迫和模拟干旱处理条件下的 表达特征 200 mmol L 1 NaCl 盐处理条件下 BraERF023a 的表达量随着处理时间的延长显著升高 表明盐胁迫 处理可以显著诱导 BraERF023a 的表达 图 2 a 与 其相似 在 20 的 PEG6000 模拟干旱胁迫处理条件 下 花椰菜中的 BraERF023a 在胁迫处理后不同时间 段的表达量均显著高于处理前 图 2 b 表明 BraERF023a 不但正向响应盐胁迫 也受干旱胁迫的 诱导表达 2 3 BraERF023a 表达载体构建及鉴定 分别采用基因特异引物 BraERF023a F BraERF023a R 和组合引物 35S F BraERF023a R 进行菌液 PCR 鉴定重组载体是否已成功转入农杆菌中 随 机挑取 6 个阳性克隆进行检测 PCR 产物的电泳结 果显示在 6 个阳性克隆中均可检测到长度约为 600 bp 和 1 100 bp 的特异性条带 图 3 a 条带大小均 符合预期 表明 35S BraERF023a 过表达载体已成 功转入农杆菌中 2 4 BraERF023a 过表达拟南芥转化株系筛选及分子 鉴定 野生型拟南芥于盛花期经农杆菌浸花法侵染后培 养至种子成熟 记为 T 0 代 T 0 代种子萌发后进行 Basta 抗性筛选 筛选结果显示 绝大部分幼苗叶片逐渐黄 化 26 个植株生长发育状况正常 初步鉴定为抗性转 化株系 随机选取其中 10 个抗性转化株系分别进行 DNA 水平及转录水平的分子鉴定 以 DNA 为模板 采用 BraERF023a 特异引物及 BraERF023a 与载体序 列组合引物分别进行 PCR 检测 在其中 5 个株系中可 以分别扩增出与预期大小一致的约 600 bp 和 1 100 bp 的特异性条带 表明 BraERF023a 已成功整合到这些 株系的基因组中 图 3 b 进一步采用 qRT PCR 方 法对 BraERF023a 在这 5 个阳性株系中的表达特征进 行分析 结果显示 BraERF023a 在这 5 个株系中的 表达水平显著高于野生型对照 图 3 c 证实 BraERF023a 不但成功整合到转化株基因组内 并且 实现在转化株的高表达 将这 5 个 T 0 代植株进行多代 自交纯合 T 3 代株系用于后续分析 2 5 BraERF023a 过表达转基因拟南芥表型分析 为揭示 BraERF023a 在拟南芥中过表达是否影 156 中 国 农 业 科 学 54卷 横线显示 AP2 保守结构域 方框显示 ERF 转录因子 AP2 结构域内保守的第 14 位和 19 位氨基酸 Sequences marked by the black lines indicated the AP2 domain and the boxes indicated the conserved fourteenth and nineteenth amino acids in the AP2 domain of ERFs respectively 图 1 花椰菜 BraERF023a 序列分析 Fig 1 Sequence analysis of BraERF023a in cauliflower 相对表达水平 Relati ve express ion level 相对表达水平 Relati ve express ion level 表示差异极显著 P 0 01 下同 indicated the difference is significant at the 0 01 level The same as below 图 2 花椰菜盐 a 和干旱 b 胁迫条件下 BraERF023a 表达特征的 qRT PCR 分析结果 Fig 2 Expression profiles of BraERF023a under salt a and drought b stresses detected by qRT PCR 1 期 李慧等 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在响应盐和干旱胁迫 中的功能 157 M1 2 3 4 5 678910 a b c M1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M123 45 6 M1 2 3 4 5 6 0 2 4 6 8 10 12 CK L3 L4 L6 L8 L9 BraERF023a过表达拟南芥转化株系 Overexpression BraERF023a Arabidopsis lines 相对表达水平 Relati ve exp r es sio n l e v e l a 分别采用 BraERF023a 特异扩增引物及 BraERF023a 与载体序列组合引物对农杆菌阳性克隆进行菌液 PCR 的检测结果 M DNA marker 1 6 6 个阳性克隆特异引物 PCR 检测结果 1 6 6 个阳性克隆组合引物 PCR 检测结果 b 分别采用 BraERF023a 特异扩增引物及 BraERF023a 与载 体序列组合引物对拟南芥转化株的单株 PCR 检测结果 M DNA marker 1 10 10 个单株特异引物 PCR 检测结果 1 10 10 个单株组合引物 PCR 检测结果 c 不同 BraERF023a 过表达拟南芥转化株系中 BraERF023a 表达水平的 qRT PCR 检测结果 CK 对照组 L3 L4 L6 L8 L9 BraERF023a 过表达拟南芥株系 a Identification of Agrobacterium tumefaciens with BraERF023a by PCR used the specific primers and combined primers respectively M DNA marker 1 6 indicated PCR identification used the specific primers 1 6 indicated PCR identification used the combined primers b Identification of individual Arabidopsis plant with BraERF023a by PCR used the specific primers and combined primers respectively M DNA marker 1 10 indicated PCR identification of individual plants used the specific primers 1 10 indicated PCR identification of individual plant used the combined primers c Expression levels of BraERF023a in differential overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis lines detected by qRT PCR CK Wild type control L3 L4 L6 L8 L9 indicated the five independent transgenic lines 图 3 农杆菌及拟南芥转化株中 BraERF023a 的分子鉴定 Fig 3 Identification of BraERF023a in Agrobacterium tumefaciens and transgenic lines in Arabidopsis 响转化株的生长发育 对过表达 BraERF023a 转基因 拟南芥在正常生长条件下不同生长阶段的表型特征进 行观察 分析 结果显示 幼苗生长初期 3 周以前 过表达 BraERF023a 转基因拟南芥株系与对照相比无 明显差异 但在幼苗生长 3 周后 过表达 BraERF023a 转化株系的长势明显优于对照 图 4 待植株进入成 熟期 对其株高 分枝数目等表型特征进行统计分析 结果显示 过表达 BraERF023a 转化株系相对于对照植 株表现为植株更高 分枝数目更多 花茎更粗 整体生 物量增加 但二者花序大小及果荚长度无明显差异 在 抽薹时间方面 过表达 BraERF023a 转化株系比对照滞 后约一周 表 2 上述结果表明 在拟南芥中过表达 BraERF023a 对转化株的生长发育有一定影响 其可以 促进转化株的生长发育 延长其抽薹期 但对转化株育 性 结种量无显著影响 2 6 BraERF023a 过表达转基因拟南芥盐胁迫分析 BraERF023a 过表达转基因拟南芥和野生型对 照经盐胁迫后生长均受到一定抑制 但对照组拟南 芥叶片萎蔫黄化严重甚至全部枯萎 植株存活率低 而过表达 BraERF023a转化株系叶片虽也发生黄化 但程度显著低于对照 图 5 且尽管受到盐胁迫 BraERF023a 过表达转化株植株最终的存活率 86 显著高于对照组 41 表明在拟南芥中 过表达 BraERF023a 可以提高转化株抵御盐胁迫的 能力 2 7 BraERF023a 过表达转基因拟南芥干旱胁迫分析 干旱胁迫处理 20 d 后 BraERF023a 过表达转化 株系和野生型植株均萎蔫严重 但野生型植株基本已 158 中 国 农 业 科 学 54卷 a b 和 c 分别显示生长 3 周 4 周及 8 周的 BraERF023a 过表达转化 株系及对照的表型 CK 对照组 L4 L8 L9 过表达 BraERF023a 转 化株系 a b and c indicated the phenotypes of 3 week old 4 week old and 8 week old overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis and the control CK L4 L8 L9 indicated three independent overexpression BraERF023a transgenic lines 图 4 BraERF023a 过表达拟南芥不同生长发育时期的表型 Fig 4 Phenotypes of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis at different developmental stages 全部萎蔫黄化至死亡 而 BraERF023a 过表达转化株 系萎蔫黄化程度相对野生型较轻 部分转化株系叶片 仍保持绿色 图 6 对所有干旱处理植株进行复水 复水 10 d 后 其中 2 个过表达 BraERF023a 转化株 系中 L8 L9 的大部分植株恢复生长 而对照组 绝大部分已枯萎 图 6 且过表达 BraERF023a 转化株系的存活率显著高于对照组 图 7 表明 在拟南芥中过表达 BraERF023a 可以显著提高转化 株的耐旱性 3 讨论 3 1 BraERF023a 在植物中的分子进化特征分析 AP2 ERF 转录因子最初在植物中被发现 1994 年 JOFUKU 等 4 从模式植物拟南芥中分离到第一个 AP2 转录因子 APETALA2 该转录因子与花发育和 种子萌发有关 随后 AP2 ERF 转录因子家族成员陆 续从不同植物中被鉴定 克隆 并证实其为植物所 特有 基因结构分析表明 AP2 ERF 家族成员均含有 保守的 AP2 结构域 5 根据 AP2 结构域的数目及序 列特征 AP2 ERF 家族中的 ERF 亚族和 DREB 亚族 均含有单个的 AP2 结构域 6 但是 AP2 结构域第 14 位和第 19 位氨基酸残基在两者中不同 ERF 亚族成 员 AP2 结构域的第 14 位和 19 位分别为丙氨酸和天 冬氨酸 而 DREB 亚族成员该结构域第 14 位和 19 位分别为缬氨酸和谷氨酸 7 通过对 BraERF023a 的 序列分析发现 其具有 1 个 AP2 结构域 并且保守 结构域第 14 位和 19 位分别为丙氨酸和天冬氨酸 a 过表达 BraERF023a 拟南芥转化株系 L4 L8 L9 及对照组 CK 200 mmol L 1 NaCl 盐胁迫处理前表型 b 过表达 BraERF023a 拟南芥转化 株系 L4 L8 L9 及对照组 CK 200 mmol L 1 NaCl 盐胁迫处理 3 周后表型 a The phenotypes of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis L4 L8 L9 and control before salt stress 200 mmol L 1 NaCl b The phenotypes of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis L4 L8 L9 and control under salt stress 200 mmol L 1 NaCl for three weeks 图 5 过表达 BraERF023a 转基因拟南芥盐胁迫表型分析 Fig 5 Phenotypes of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis under salt stress 1 期 李慧等 花椰菜 BraERF023a 的克隆及在响应盐和干旱胁迫 中的功能 159 表 2 过表达 BraERF023a 转基因拟南芥表型分析 Table 2 Phenotypic analysis of overexpression BraERF023a transgenic Arabidopsis 表型 Phenotype 对照 CK L4 L8 L9 株高 Stem length cm 43 125 2 780c 56 750 3 862a 51 125 1 0307ab 49 625 3 0923b 抽薹时间 Bolting time d 26 00 2 4495b 32 00 2 4495a 29 1 9148a 31 00 1 2583a 茎粗 Stem diameter mm 1 2375 0 0727b 1 7800 0 2191a 1 6300 0 1551a 1 7125 0 1059a 主茎 Stem number 5 75 0 9574c 6 75 1 0708ab 6 25 0 5000b 7 775 0 5774a 一级分枝 Primary branch number 13 75 2 630b 15 00 2 449ab 16 00 3 742a 13 75 5 132b 二级分枝 Secondary branch number 5 00