优选盆栽小菊高效再生及转化体系的建立.pdf

罗宇婷 黄艺清 黄 琪 等 优选盆栽小菊高效再生及转化体系的建立 J 江苏农业科学 2020 48 11 61 66 doi 10 15889 j issn 1002 1302 2020 11 012 优选盆栽小菊高效再生及转化体系的建立 罗宇婷 黄艺清 黄 琪 朱品清 钟声远 房伟民 管志勇 王海滨 陈发棣 蒋甲福 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 农业农村部景观设计重点实验室 南京农业大学园艺学院 江苏南京 210095 摘要 为筛选最适盆栽小菊品种 建立再生转化体系 以 11 个盆栽小菊品种无菌苗叶片为外植体 比较不同植物 生长调节剂配比和抗生素对叶片愈伤组织诱导 不定芽分化及生根等过程的影响 结果表明 11 个品种中再生率最 高的为微风深红 其最适分化培养基为 MS 1 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 再生率为 95 0 叶片分化对卡那霉 素和潮霉素的抗性选择压分别为 15 10 mg L 对植株生根的抗性选择压分别为 10 8 mg L 羧苄青霉素抑菌浓度最适 范围为 200 400 mg L 本研究建立了盆栽小菊叶片外植体的高效再生及转化体系 为今后菊花的转基因工作奠定 良好的基础 关键词 盆栽小菊 叶片 不定芽生根 农艺性状 再生 遗传转化 选择压力 中图分类号 S682 1 10 4 3 文献标志码 A 文章编号 1002 1302 2020 11 0061 06 收稿日期 2019 06 04 基金项目 江苏省农业科技自主创新资金 编号 CX 17 3036 江苏 现代农 业 花 卉 产业技术体系综合示范基地项目 编 号 JATS2018002 青海省科技项目 编号 2018HZ819 教育部高校 科研基地业务费项目 编号 KJFP201703 作者简介 罗宇婷 1995 女 四川乐山人 硕士研究生 主要从事 观赏植物育种与栽培技术研究 E mail 532969000 qq com 通信作者 蒋甲福 博士 教授 博士生导师 主要从事菊花遗传育种 与分子生物学研究 E mail jiangjiafu njau edu cn 菊花 Chrysanthemum morifolium amat 在我 国有着源远流长的栽培历史 至今已培育出各具特 色的品种群 发展成为世界四大切花之一 具有很 高的观赏和经济价值 1 因而筛选 培育具有优良 性状的新品种十分具有实用意义 随着植物基因 工程技术的发展 通过基因工程改良性状己经逐渐 成为植物定向遗传改良的重要手段 由于菊花的 品种繁多 遗传背景复杂 不同基因型菊花的再生 能力也各不相同 2 研究表明 基因型差异是影响 菊花再生的主要因素 3 Horsch 等在之前的农杆 菌介导法转化试验中利用叶盘转换法 对多个不同 品种的菊花进行再生试验 结果发现 不同品种的 菊花有着较大差异的遗传转化率 表明菊花的转化 效率依赖于品种 4 目前 已经利用叶片 叶柄 茎 段 花器官等外植体实现了不同品种菊花再生和转 化体系的建立 5 6 而应用于遗传转化最普遍的受 体材料是叶片 7 利用盆栽小菊进行再生及转化 体系建立至今未见报道 本研究以 11 个盆栽小菊 新品种叶片为外植体 从基因型 6 苄氨基嘌呤 6 BA 和萘乙酸 NAA 激素配比以及抗生素对 菊花再生的影响进行系统深入的研究 旨在建立高 效再生及转化体系 为盆栽小菊的分子遗传育种奠 定基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 供试材料为盆栽小菊品种微风深红 花洒绿色 心情 色彩火山 微风橙绿 微风玫瑰 微风索尔 青 柠水晶 梦幻粉水晶 红水晶 微风红霞和粉色 取 自南京农业大学中国菊花种质资源保存中心 1 2 性状选取与数量采集 从定植到开花期 对 11 个品种的株高 茎粗 花径 花型 花色 定植时间 现蕾时间 开花时间这 9 个性状 8 采用直尺 游标卡尺 目测的方法进行测 定 每个品种 10 次重复 1 3 培养基与培养条件 以 MS 培养基 9 作为基本培养基 在此基础上 添加 30 g L 蔗糖和 6 5 g L 琼脂 植物生长调节剂 选用不同浓度比的 6 BA 和 NAA 用 1 mol L NaOH 调节 pH 值至 5 8 116 高温高压灭菌 30 min 培养室温度为 25 光照度 20 25 lx 每 天光照 12 h 1 4 不同基因型叶片外植体再生差异 挑选 3 个具有代表性的 含不同浓度比 6 BA 和 NAA 的分化培养基 M2 M5 M7 表 1 对 11 个 16 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 11 期 品种进行初步筛选 10 从中挑选出再生率高的 6 个品种 使用 9 个不同浓度配比 6 BA 和 NAA 的 分化培养基 M1 M9 表 1 对其细筛选 各品种每 个培养基接种 30 个叶盘 3 次重复 30 d 后统计再 生率 不定芽再生率 再生不定芽外植体数 接种 外植体总数 100 表 1 直接诱导芽再生培养基 mg L 培养基 6 BA 浓度 NAA 浓度 M1 1 0 0 2 M2 1 0 0 5 M3 1 0 0 8 M4 2 0 0 2 M5 2 0 0 5 M6 2 0 0 8 M7 3 0 0 2 M8 3 0 0 5 M9 3 0 0 8 1 5 卡那霉素和潮霉素筛选浓度的确定 1 5 1 叶片外植体分化 以筛选出的品种为材料 将叶片接种于含不同浓度梯度的卡那霉素 Km 和 潮霉素 Hyg 的最适分化培养基上 Km 和 Hyg 设 置 0 5 10 15 20 25 mg L 6 个浓度处理 每个处理 接种 30 个外植体 3 次重复 30 d 后统计分化 情况 1 5 2 不定芽生根 以筛选出的品种为材料 将不 定芽接种于含不同浓度梯度的 Km 和 Hyg 的生根 培养基上 Km 和 Hyg 设置为 0 5 8 10 12 15 mg L 6 个浓度处理 每个处理接种 10 个外植体 3 次重 复 15 d 后统计生根情况 1 6 羧苄青霉素抑菌浓度的确定 将生长状况一致的叶片外植体用无菌手术刀 切成约 5 cm 5 cm 大小的叶盘 在最适分化培养 基上培养 3 d 用农杆菌侵染 7 min 后将多余菌液吹 干 置于最适分化培养基中黑暗共培养 3 d 将叶盘 转入含有不同浓度的羧苄青霉素 Cb 培养基中 Cb 设置为 0 200 300 400 500 mg L 共 5 个处理 同时 以未侵染农杆菌的叶盘作为空白对照 每个处理接 种 20 个外植体 每个处理 3 次重复 15 d 后统计 抑菌情况 2 结果与分析 2 1 11 个盆栽小菊农艺性状观察 对 2018 年定植的 11 个盆栽小菊品种基本性状 进行数据统计 结果 表 2 表明 11 个品种的株高 在 15 58 cm 之间 茎粗在 4 83 7 89 cm 之间 微 风索尔的花径最大 达 10 5 cm 花径最小的品种是 粉色 仅 3 5 cm 花色中多为粉色 红色 黄色 品种 粉色从定植到开花的时间最短 为 130 d 表 2 11 个菊花品种农艺性状的统计 品种 株高 cm 花径 cm 茎粗 mm 花型 花色 定植时间 月 日 现蕾时间 月 日 显色时间 月 日 开花时间 月 日 花洒绿色心情 39 8 7 4 83 莲座 绿色 05 29 09 24 10 28 11 11 色彩火山 34 7 7 6 11 单瓣 红黄 05 31 09 25 10 28 11 30 微风橙绿 28 8 6 7 30 单瓣 橙色 06 05 09 19 10 18 11 03 微风玫瑰 17 7 9 6 21 单瓣 粉色 06 05 09 25 10 22 11 03 微风索尔 37 10 5 7 32 单瓣 黄色 05 31 09 25 10 23 11 04 青柠水晶 34 9 6 7 89 莲座 黄色 06 21 09 28 10 28 11 11 梦幻粉水晶 58 6 8 7 73 莲座 粉色 06 21 09 23 10 23 11 04 微风深红 44 8 3 5 23 单瓣 红色 06 21 10 01 10 21 11 09 红水晶 36 7 9 6 10 莲座 红色 06 21 09 29 10 21 11 09 微风红霞 29 7 5 4 95 单瓣 红色 06 05 09 30 10 14 11 09 粉色 15 3 5 6 44 复瓣 粉时色 06 10 09 14 10 07 10 18 2 2 不同基因型叶片外植体再生差异 在 3 种常用分化培养基上 11 个品种盆栽小菊 的叶片外植体分化差异较大 其中微风深红 微风 索尔 微风红霞 微风玫瑰 粉色 红水晶都能产生 不定芽 但是其他品种梦幻粉水晶 花洒绿色心情 色彩火山 微风橙绿 青柠水晶都出现明显的褐化 现象且不能分化出不定芽 因此 本试验选择微风 深红 微风索尔 微风红霞 微风玫瑰 粉色 红水晶 6 个品种进行下一步细筛试验 enou 等的试验表明 6 BA 和 NAA 是对菊花 26 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 11 期 再生最佳的植物生长调节剂 11 将 6 种盆栽菊花 叶片外植体接种在 9 种含不同配比 NAA 和 6 BA 激素的分化培养基上进行再生率的观察 从表 3 可以看出 只有品种微风深红可以在所有不同配比 的分化培养基上都分化出不定芽 同一品种在不同 的激素浓度处理下分化情况有着较大的差异 当 6 BA NAA 浓度分别为 1 0 0 2 mg L 时 再生率 最高 可达 95 表 3 图 1 试验结果还可以看 出 在同一处理下不同盆栽菊的分化情况也有所不 同 其他 5 个品种只能在特定 NAA 和 6 BA 比例 的 MS 培养基上产生不定芽 此结论与李金童等对 4 种露地菊建立再生体系的试验结果 12 一致 因 此 在后续试验中以微风深红作为遗传转化对象 确定其叶片分化培养基为 MS 1 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 其他 5 个品种不作进一步研究 表 3 不同激素配比对菊花叶片再生的影响 培养基编号 不同品种的再生频率 微风红霞 红水晶 微风索尔 微风玫瑰 微风深红 粉色 M1 0 00 0 00b 8 33 7 63ab 3 33 1 15ef 0 00 0 00c 95 00 1 00a 0 00 0 00b M2 5 00 5 00a 0 00 0 00c 16 67 1 52de 0 00 0 00c 61 67 1 53b 10 00 2 89a M3 0 00 0 00b 0 00 0 00c 83 33 1 52a 0 00 0 00c 13 33 1 53c 8 33 6 01ab M4 0 00 0 00b 10 00 5 00a 0 00 0 00c 0 00 0 00c 60 00 3 00b 3 33 3 33ab M5 0 00 0 00b 3 33 5 78abc 20 00 3 00d 0 00 0 00c 63 33 3 06b 1 67 1 67ab M6 0 00 0 00b 0 00 0 00c 88 33 1 52a 0 00 0 00c 18 33 3 06c 1 67 1 67ab M7 0 00 0 00b 0 00 0 00c 0 00 0 00c 28 33 3 51a 76 67 3 79ab 1 67 1 67ab M8 0 00 0 00b 0 00 0 00c 58 33 2 08b 15 00 1 00b 66 67 2 31b 0 00 0 00b M9 0 00 0 00b 1 67 2 89bc 41 67 1 15c 0 00 0 00c 11 67 1 53c 0 00 0 00b 注 采用 Fisher s LSD 法比较差异显著性 同列数据后不同小写字母表示在 0 05 水平上差异显著 2 3 卡那霉素和潮霉素筛选浓度的确定 2 3 1 对叶片外植体再生的选择压力确定 不同 基因型 不同外植体对不同选择剂甚至同一选择剂 的敏感程度不同 因此须要进行选择剂浓度的确 定 本试验发现 抗生素 Hyg 和 Km 对菊花幼叶再 生有抑制作用 随着抗生素浓度的增加 微风深红 叶片外植体再生能力逐渐下降 表 4 当 Hyg Km 浓度分别为 10 15 mg L 时 叶片脱分化率分别为 表 4 不同浓度抗生素对微风深红叶片分化的影响 抗生素浓度 mg L 接种数 个 脱分化率 分化率 Km Hyg Km Hyg 0 60 100 0 100 0 96 7 83 3 5 60 96 7 100 0 15 0 3 3 8 60 63 3 90 0 3 3 0 0 10 60 48 3 30 0 1 7 0 0 15 60 6 7 3 3 0 0 0 0 25 60 0 0 0 0 0 0 0 0 36 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 11 期 30 6 7 不定芽的分化完全被抑制 图 2 图 3 由上述结果可知 10 mg L Hyg 15mg L Km 为 微风深红叶片外植体再生的临界耐受浓度 可作为 其遗传转化过程中叶片再生的选择压力 2 3 2 不定芽生根的选择压力确定 由表 5 可知 抗生素 Km 和 Hyg 对微风深红茎段外植体生根具 有抑制作用 且抗生素浓度越大 抑制作用越明显 当 Km 和 Hyg 浓度分别上升为 10 8 mg L 时 茎段 外植体的生根能力完全被抑制 图 4 图 5 因此 10 mg L Km 8 mg L Hyg 为微风深红茎段生根的临 表 5 不同浓度抗生素对微风深红不定芽生根的影响 抗生素浓度 mg L 接种数 个 生根数 个 生根率 Km Hyg Km Hyg 0 30 30 30 100 0 100 0 5 30 28 13 93 3 43 3 8 30 11 0 36 7 0 0 10 30 0 0 0 0 0 0 12 30 0 0 0 0 0 0 15 30 0 0 0 0 0 0 界耐受浓度 可作为遗传转化过程中生根的选择 压力 2 4 羧苄青霉素抑菌浓度的确定 由表 6 可知 Cb 对农杆菌的抑制效果相对明 显 当不添加 Cb 时 经过农杆菌侵染的叶片外植 体农杆菌大量繁殖导致植株死亡 叶片不能进行分 化 而未经侵染的叶片外植体再生率可达 92 9 图 6 而随着 Cb 浓度的増大 叶片周围产生的菌 落逐渐减少 部分外植体伤口边缘有褐化现象 当 Cb 浓度达到 400 mg L 时 农杆菌生长被完全抑制 无可见菌斑 叶片正常分化 再生频率可达 89 7 当 Cb 浓度为 500 mg L 时 虽然抑制了农杆菌的生 长 但叶盘也受到了毒害 甚至褐化死亡 再生率下 降 因此 最适抑菌浓度为 400 mg L 3 讨论 植物组织培养一直是获得再生植株和植物基 因工程育种的关键步骤之一 对于遗传转化体系来 说 拥有高效的再生率是其必要条件 13 但菊花的 组织培养具有复杂性和多样性 不同品种间再生能 46 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 11 期 表 6 不同浓度的羧苄青霉素抑菌效果对微风深红叶片分化的影响 处理 Cb 浓度 mg L 抑菌效果 再生率 CK 0 0 92 9 CK 1 0 农杆菌孳生严重 菌群布满容器 0 1 100 农杆菌孳生严重 染菌数为 60 28 3 2 200 农杆菌孳生 染菌数为 40 42 8 3 300 少量农杆菌孳生 染菌数为 15 62 0 4 400 农杆菌生长被完全抑制 无可见菌斑 89 7 5 500 农杆菌生长被完全抑制 无可见菌斑 32 9 注 CK 0 指外植体未经农杆菌侵染的空白对照 CK 1 指外植体经 农杆菌侵染的对照 力有很大的差异 激素种类以及配比的不同都对再 生有影响 14 在菊花的离体培养中使用最广泛的激 素为 6 BA 和 NAA 15 毛洪玉等诱导地被菊中国红 叶片 在 MS 2 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 的 培养基上获得了最高的不定芽分化率 16 梁芳等诱 导菊花品种狮子头叶片 发现最适的分化培养基为 MS 0 1 mg L NAA 1 0 mg L 6 BA 17 吴志苹 等的试验表明 菊花金不凋愈伤组织不定芽分化的 最适培养基为 MS 1 5 mg L 6 BA 0 5 mg L NAA 不定芽分化率为 90 0 18 本研究以 MS 培 养基为基础 在不同的 6 BA 和 NAA 组合下 对 11 个不同基因型盆栽小菊叶片外植体进行再生能 力评估 其中 菊花品种微风深红的分化能力最 强 在 MS 1 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 的分 化培养基中再生频率高达 95 结果表明 不同基 因型菊花最适的 6 BA 和 NAA 配比是不同的 基 因型是影响外植体高效再生的决定性因素 这与前 人的观点 19 一致 在使用不同浓度激素配比进行最适再生培养 基筛选时 很多叶片会出现褐化现象 组培褐化的 发生与否通常由植物种类及自身基因型决定 20 本试验中除微风深红其他品种均出现褐化且再生 率较低 这可能与植物自身的基因型有关 彭思维 等在研究火龙果茎段愈伤组织诱导时发现 高浓度 的生长调节剂噻苯隆 TDZ 会导致植物组织加快分 裂 使得愈伤组织来不及吸收营养最终褐化 21 在 进行愈伤诱导时使用不同浓度配比的 6 BA 和 NAA 随着 6 BA 浓度的升高 褐化品种的叶片褐 化率升高 菊花叶片的褐化是与植物自身的基因 型有关 还是与植物生长调节剂的类型及浓度使用 不当有关 具体原因须要进一步研究 菊花的遗传转化中最常使用的选择标记抗生素 主要是卡那霉素和潮霉素 22 卡那霉素的使用浓度 范围一般为 5 50 mg L 潮霉素为 5 20 mg L 15 本试验发现 微风深红对 Hyg 比对 Km 更为敏感 当 Hyg 浓度为 10 mg L 时已经可以完全抑制其分 化 但是 Km 浓度要达到 15 mg L 时才能起到完全 抑制分化的作用 宁云霞用叶盘作为外植体对菊 花白安娜分化的 Hyg 浓度进行筛选 发现 8 mg L Hyg 是菊花叶盘最适的抗性选择压力 23 在本试验 中微分深红叶盘分化的临界浓度为 10 mg L Hyg 这表明不同基因型菊花对 Hyg 的敏感度不同 本 56 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 11 期 试验中只看到少数转化后的外植体产生抗性芽 原 因之一可能是预培养的时间不合理 贾红梅等的研 究表明 预培养时间过长会造成菊花叶片切割处褐 化 影响转化的成功率 24 原因之二可能是潮霉素 对植物组织有很大的毒害作用 即使是低浓度的潮 霉素也会产生很大的毒害作用 25 26 本试验在经 过农杆菌侵染后添加 Cb 抑菌 从试验结果可以看 出 Cb 浓度升高使得不定芽分化受到抑制 这与 da Silva 发现的 Cb 对菊花外植体分化不定芽具有一定 毒性的结论 27 一致 因此 抗生素在筛选转化细胞 的同时也对细胞有毒害作用 如何减少抗生素的毒 害作用 提高转化效率是今后菊花基因工程育种努 力的方向 4 结论 本研究从 11 个盆栽小菊品种中筛选出较其他 品种有很大再生优势的品种微风深红 通过叶片外 植体建立再生体系和遗传转化体系 其最适分化培 养基为 MS 1 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 再 生率为 95 0 叶片分化对 Km 和 Hyg 的抗性选择 压分别为 15 10 mg L 生根的抗性选择压分别为 10 8 mg L Cb 的最适浓度范围为 200 400 mg L 本研究能为今后菊花的转基因工作奠定良好的 基础 参考文献 1 Peng H Zhang F Jiang J F et al Identification of quantitative trait loci for branching traits of spray cut chrysanthemum J Euphytica 2015 202 3 385 392 2 王碧玉 菊花再生及遗传转化体系的研究 D 沈阳 沈阳农业 大学 2017 3 周蕴薇 刘 彧 马 欣 等 根癌农杆菌介导地被菊 紫妍 遗 传转化体系的建立 J 西北农业学报 2016 25 12 1861 1869 4 Horsch B Fry J E Hoffmann N L et al A simple and general for transferring genes into plants J Science 1985 227 4691 1229 1231 5 程密密 杨 霞 杨玉灿 等 翠菊品种库蕾娜叶片和叶柄及茎段 的再生研究 J 黑龙江农业科学 2014 10 20 22 6 魏曼曼 王江民 Imtiaz M 等 菊花花色嵌合花瓣的离体培养及 植株再生 J 北京林业大学学报 2014 36 4 107 112 7 丁晓霞 菊花组培再生体系研究进展 J 辽宁林业科技 2018 4 64 65 68 8 冯晴云 切花菊表型性状遗传多样性分析及初选核心种质构建 D 南京 南京农业大学 2015 9 Murashige T Skoog F A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures J Physiologia Plantarum 1962 15 3 473 497 10 吴慧莹 蓝色花色转基因受体菊花品种筛选及其再生体系建立 D 南京 南京农业大学 2015 11 enou J P Brochard P Jalouzot ecovery of transgenic chrysanthemum Dendranthema grandiflora Tzvelev after hygromycin resistance selection J Plant Science 1993 89 2 185 197 12 李金童 吴雅妮 丁 兵 等 四种露地菊再生体系的建立 J 北方园艺 2016 19 119 124 13 张 微 王良群 刘 勇 等 玉米不同部位愈伤组织诱导及植 株再生的比较研究 J 核农学报 2017 31 11 2135 2144 14 赵喜亭 蒋丽微 王 苗 等 怀黄菊间接体胚受体再生体系的 建立及 CmTGA1 的遗传转化 J 植物学报 2016 51 4 525 532 15 许高娟 部分菊花近缘种属植物黑斑病苗期抗性及 hrfA 基因 转化菊花的研究 D 南京 南京农业大学 2009 16 毛洪玉 周 杨 刘 迪 等 地被菊 中国红 再生及遗传转化 体系的建立 J 沈阳农业大学学报 2015 46 6 672 677 17 梁 芳 王默霏 王洁琼 等 菊花高效再生体系的建立及抗生 素对叶片分化的影响 J 江苏农业科学 2015 43 6 40 43 18 吴志苹 高亦珂 范 敏 等 菊花 金不凋 再生及遗传转化体 系的构建 J 分子植物育种 2020 18 1 150 158 19 da Silva J A T Chrysanthemum advances in tissue culture cryopreservation postharvest technology genetics and transgenic biotechnology J Biotechnology Advances 2003 21 8 715 766 20 冯代弟 王 燕 陈剑平 植物组培褐化发生机制的研究进展 J 浙江农业学报 2015 27 6 1108 1116 21 彭思维 王永清 范建新 等 火龙果茎段愈伤组织诱导及再生 体系的建立 J 核农学报 2015 29 5 885 891 22 Song J Y Sivanesan I Jeong B Use of petal explants for successful transation of Dendranthema grandiflorum Kitamura Orlando mediated by Agrobacterium tumefaciens J African Journal of Biotechnology 2012 11 37 9141 9148 23 宁云霞 菊花花色芽变分离鉴定及 白安娜 遗传转化体系的 建立 D 南京 南京农业大学 2016 31 39 24 贾红梅 王碧玉 刘 迪 等 农杆菌介导 CBL 基因对菊花品种 C008 的转化 J 西北林学院学报 2017 32 1 184 189 25 Nyaboga E Tripathi J N Manoharan et al Agrobacterium mediated genetic transation of yam Dioscorea rotundata an important tool for functional study of genes and crop improvement J Frontiers in Plant Science 2015 5 463 26 Liu H Zhao H X Wu L H et al A genetic transation for cadmium hyperaccumulator Sedum plumbizincicola and non hyperaccumulating ecotype of Sedum alfredii J Frontiers in Plant Science 2017 8 1047 27 da Silva J A T Thin cell layer technology for induced response and control of rhizogenesis in chrysanthemum J Plant Growth egulation 2003 39 1 67 76 66 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 11 期