百日菊白粉菌的分子检测与鉴定.pdf

刘 闰 周 暄 邢 帅 等 百日菊白粉菊菌的分子检测与鉴定 J 江苏农业科学 2020 48 6 98 103 doi 10 15889 j issn 1002 1302 2020 06 020 百日菊白粉菌的分子检测与鉴定 刘 闰 周 暄 邢 帅 杨旭欣 王占斌 东北林业大学林学院 黑龙江哈尔滨 150040 摘要 对百日上的白粉菌进行分子生物学分析 采用试剂盒法提取病原菌总基因组 DNA PCR 扩增其 rDNA 内转 录间隔区 internal transcribed spacer 简称 ITS 的保守序列并测序 并通过 Clustal 与 MEAG 软件构建系统发育树推演 系统进化关系 在分子水平鉴定该菌种并比较与其他白粉菌菌种的亲缘关系 结果表明 本研究测序的百日菊白粉菌 BC180623 的 ITS 序列与发生在土耳其菊芋上的 Erysiphe cichoracearum KF453969 1 相似度达到 99 与其具有比较 近的亲缘关系 以百日菊白粉菌为研究对象 在分子水平鉴定该菌种并分析其进化亲缘关系为本试验的创新之处 关键词 百日菊 白粉菌 内转录间隔区 序列分析 中图分类号 S435 672 文献标志码 A 文章编号 1002 1302 2020 06 0098 06 收稿日期 2019 01 30 基金项 目 东北林业大学大学生创新创业训练计划 编 号 201710225294 作者简介 刘 闰 1998 女 内蒙古赤峰人 硕士研究生 主要从 事植物病理学研究 E mail 1293365687 qq com 通信作者 王占斌 博士 副教授 主要从事分子植物病理学研究 E mail wangzbchina 163 com 百日菊 Zinnia elegans Jacq 别称百日草 为中 药材 以全草入药 百日菊也是一年生草花主栽品 种之一 其色彩丰富 花大 艳丽 花期长达百日 故 得百日菊之美名 白粉病是百日菊常见的最重要 病害之一 在生长区几乎每年都普遍发生 1 3 百 日菊被白粉菌侵染后 最初叶片出现白色粉状斑 点 后病斑扩大或相连成片 发病后期叶面布满白 色粉层 叶片变褐 严重影响观赏价值 甚至导致植 株成片死亡 发病后期在发病部位形成的小黑点 即为病菌的闭囊壳 据以前的研究报道有 2 个属的 白粉菌引起百日菊的白粉病 分别是白粉菌属 Erysiphe 和单丝壳属 Sphaerotheca 属于子囊菌 门 Ascomycota 白粉菌目 Erysiphales 白粉菌科 Erysiphaceae 4 7 白粉菌传统的鉴定以其形态学为主要特征 如 有性世代闭囊壳内子囊的个数及子囊孢子的数目 闭囊壳外附属丝的特征等 但传统的分类特征有诸 多不足之处 8 11 近年来 分子生物学在植物病害 鉴定上的应用越来越广泛 特别是植物病原菌在 rDNA 的内转录间隔区 internal transcribed spacer 简称 ITS 既具有保守性 又在科 属 种水平上均有 特异性序列的特点 通过特异性引物对 ITS 区段进 行 PCR 扩增 可用于快速鉴定 检测植物病原菌以 及病害的诊断等 12 13 目前国内关于百日菊白粉 病病原菌分子分类系统的研究未见报道 通过提取 百日菊白粉菌总基因组 DNA 利用分子生物学技术 对其分类特征及进化关系进行研究 可为该花卉白 粉病的准确调查提供有效和实用的手段 1 材料与方法 1 1 试验材料 白粉菌样本于 2017 年 8 月 12 日采自黑龙江省 哈尔滨市东北林业大学城市实验林场 样品编号为 BC180623 寄主植物为百日菊 提取白粉菌基因组 DNA 的试剂盒购自盛泽生物试剂有限公司 目录 号 DP321 1 2 试验方法 1 2 1 样品白粉菌的收集 刀片轻轻刮下叶片表 面的菌丝与闭囊壳混合物 放入 2 mL 离心管中 置 于 4 冰箱中保存 1 2 2 基因组 DNA 的提取 采用试剂盒法提取百 日菊白粉菌基因组 DNA 1 取适量白粉菌菌丝放 入研钵中 加入液氮充分研磨 2 加入 400 L 缓 冲液 FP1 和 6 LRNaseA 10 mg mL 涡旋振荡 1 min 室温放置 10 min 3 加入 130 L 缓冲液 FP2 充分混匀 涡旋振荡 1 min 12 000 r min 离心 5 min 将上清液转移至新的离心管中 重复这一步 骤 4 向上清液中加入 0 7 倍体积的异丙醇 充分 混匀 此时出现絮状基因组 DNA 离心 2 min 弃上 89 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 6 期 清 保留沉淀 5 加入 700 L 70 乙醇 涡旋振荡 5 s 12 000 r min 离心 2 min 弃上清 重复这一步 骤 6 开盖倒置 室温晾干 10 min 彻底晾干残余 的乙醇 7 加入适量洗脱缓冲液 TE 65 水浴 10 60 min 溶解 DNA 期间颠倒混匀数次助溶 最 终得到 DNA 溶液 用琼脂糖凝胶电泳方法检测得 到的 DNA 溶液 1 2 3 ITS 序列 PCR 扩增 PCR 反应的引物采用 通用引物 ITS1 ITS4 1 13 PCR 反应所用的试剂是 PCR Mix 25 L 的反应体系如下 模板 DNA 1 L PCR Mix 12 L ddH 2 O 10 L P1 和 P2 分别为 1 L PCR 扩增条件 94 预变性 2 min 94 变 性 30 s 60 退火 30 s 72 延伸 2 min 30 次循环 72 最终延伸 10 min PCR 扩增产物经 0 8 琼脂 糖凝胶电泳检测 EB 染色观察 检测合格样品进行 序列测定与分析 1 2 5 序列分析 将所得 DNA 序列输入 GenBank 进行 BLAST 比对检索 从 NCBI 数据库中调取 22 种 白粉菌 ITS 保守序列 采用 Clustalx1 83 将测序白粉 菌 BC180623 结果与不同白粉菌的 ITS 序列构建 系统发育树 推演系统进化关系 2 结果与分析 2 1 基因组 DNA 提取与 PCR 扩增的结果 ITS 通用引物扩增获得的目的片段用胶回收试 剂盒回收并纯化 对所得结果进行电泳检测 图 1 PCR 扩增产物在回收后送生工生物工程 上海 股 份有限公司测序 测序获得长度为 603 bp 的碱基序 列 结果如下 AGGACGTAGCTTGTGCTGCGTCGTG CATCGACCTCTCCACCCGTGTTGACTTTATCACTT GTTGCTTTGGCGGACCGGGCCGCGCACACGTCTGT GTGTGTTGGTCCGCTGGCTACGGCTGGAGCGCGT CTGCCAGAGACTTATAAACAACCTAACTCAAGTT TTACCTGCAGTCTAAGACAAGATTTATTAAGAAT TGATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTG GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT AATGTGAATTGCAGAATTTAGTGAATCATCGAAT CTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGCATTCCGAG GGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATAACACCCCCCT CAAGTCACCGTTTGTGTGACTTCGGTGTTGGGGCT CGCCCACCTGGGTGGCCCTTAAAGACAGTGGCGG TACCGGCGTGAGCTCTACGCGTAGTAATCTGTATC TCGCGACAGAGCGCCGACGGTGGCTGGCCAAAAG CTCCTCCTTTGTAGATGTTTATCTACATCCAAGGT TGACCTCGAATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT TAAGCATATCAATAGCCGGGAGGAAAA 2 3 百日菊白粉菌 ITS 序列进化树构建结果与 分析 获得的序列用 NCBI 的 BLAST 进行序列搜索 从 GenBank 中选取部分植物白粉菌 ITS 序列与本试 验测序结果进行比较分析 表 1 对表 1 白粉菌的 ITS 序列对比分析结果见图 2 由图 2 可知 样品百日菌白粉菌 BC180623 的 ITS 序列与 KF453969 1 的 ITS 序列最为接近 相似 度达到 99 两者序列差异性主要体现在第 2 4 19 560 581 585 位碱基上 说明样品百日菊白粉 菌与 KF453969 1 具有较近的亲缘关系 此外 23 种白粉菌 ITS 序列 219 374 bp 之间保留着较高的 一致性 因此 这些区段有可能起到了保障白粉菌 性状稳定遗传的功能 对 23 种白粉菌用 MEGA 5 05 软件分析处理 构建系统发育树 图 3 结果表明 23 种白粉菌的 ITS 序列形成 3 个比较大的分支 本研究测序的百 日菊白粉菌 BC180623 的 ITS 序列与发生在土耳其 菊芋上的白粉菌 KF453969 1 英国大波斯菊上的 白粉菌 KY660959 1 日本蓼属植物上的白粉菌 LC331790 1 的 ITS 距离最近 这说明本研究的白 粉菌菌种与它们具有比较近的亲缘关系 从分子水 平证明了发生在本地百日菊上的白粉病是 Erysiphe cichoracearum 所引起的 3 讨论 传统对于白粉菌的分类方法过多地依据寄主 种类 危害症状与显微镜观察对菌物不同的形态特 征进行比较和分类 通过对大量标本测量与数据的 99 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 6 期 表 1 用于同源性比较分析的白粉菌 序号 白粉菌种类 登录号 寄主植物 备注 1 Erysiphe sp Synonyms Golovinomyces sp LC331790 1 蓼属植物 日本 2 Erysiphe adunca KY660862 1 园林植物 英国 3 Erysiphe cichoracearum Synonyms Golovinomyces cichoracearum KY660959 1 大波斯菊 英国 4 Erysiphe cruciferarum KC878683 1 大白菜 中国 5 Erysiphe cruciferarum EU140958 1 油菜 意大利 6 Erysiphe pisi FJ378868 1 豌豆 美国 7 Erysiphe heraclei KF680162 1 欧芹 韩国 8 Erysiphe Pseudoidium sp AB522714 1 罗勒 印度 9 Erysiphe betae DQ164440 1 甜菜 英国 10 Erysiphe heraclei JN603995 1 莳萝 韩国 11 Erysiphe heraclei JX499184 1 皱叶酸模 南韩 12 Erysiphe heraclei KF111807 1 山萝卜 韩国 13 Erysiphe pisi FJ378871 1 豌豆 美国 14 Erysiphe sp HQ012432 1 大叶杨 中国 15 Erysiphe diffusa AY739112 2 大豆 巴西 16 Erysiphe alphitoides EF672350 1 橡树 法国 17 Erysiphe heraclei EU010381 1 长春藤 意大利 18 Erysiphe cichoracearum Synonyms Golovinomyces cichoracearum KF453969 1 菊芋 土耳其 19 Erysiphe cruciferarum KT957424 1 芥菜 中国 20 Erysiphe diffusa KM260363 1 紫藤 中国 21 Erysiphe sp KY290257 1 盒子草 韩国 22 Erysiphe sp MF577080 1 鳄梨 美国 23 Erysiphe sp BC180623 百日菊 中国 比对之后才能得出结论 这种方法不仅费力费时 经常由于研究者的主观因素导致片面甚至错误的 结论 许多白粉菌由于种所处环境条影响 在附属 丝等细微特征上也具有差别 因此导致鉴定效率 准确率比较低 14 15 PCR 技术是诊断植物病害的有效方法 它比起 传统检测方法具有高灵敏性 快速 准确 简便等优 点 ITS 序列在不同真菌种内保守性强 而种间存 在变异 根据这一特性用 ITS 研究真菌系统发育和 检测已经成为有效的成熟手段 16 19 郭徐鹏等通 过对白粉菌 ITS 区 DNA 片段的提取扩增和分析 对 陕西关中地区甘蓝型油菜白粉病的病原菌进行了 分子水平上的鉴定 20 文静等通过对内蒙古 4 种 白粉菌的 ITS 序列分析 构建进化发育树 表明 ITS 序列可用于白粉菌属内和属间的亲缘关系和分类 分析 21 通过一对特异性引物 ITS ITS4 利用 PCR 扩增 的方法 对发生在百日菊上的白粉菌 DNA 进行扩增 并测序 将所获得的测序结果与已上传的白粉菌菌 种进行 BLAST 比对 从中筛选相似度接近或较高的 菌种数据建立系统发育树状图 发现引起该病害的 白粉菌属于 Erysiphe 属 研究结果为该病原菌的检 测 分类与鉴定提供理论依据 对此类病害的监测 具有重要意义 参考文献 1 翟小杰 段显德 何玉会 百日草白粉病病斑在叶片上的空间分 布型及抽样研究技术 J 中国植保导刊 2014 6 46 50 2 修立红 百日草白粉病无性孢子生物学特性研究 J 农业与技 术 2013 6 18 25 3 Braun U Taxonomic studies in the genus Erysiphe Generic delimitation and position in the system of the Erysiphaceae J Nova Hedwigia 1981 34 3 4 679 719 4 Braun U Takamatsu S Phylogeny of Erysiphe Microsphaera Uncinula Erysipheae and Cystotheca Podosphaera Sphaerotheca Cystotheceae inferred from rDNA ITS sequences some taxonomic consequences J Schlechtendalia 2000 4 1 33 5 Takamatsu S New taxonomic system and molecular phylogeny of the powdery mildew fungi J Plant Prot 2002 56 229 237 6 刘铁志 内蒙古白粉菌志 M 赤峰 内蒙古科学技术出版社 2010 126 128 7 戴芳澜 中国真菌总汇 M 北京 科学出版社 1979 137 139 001 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 6 期 101 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 6 期 201 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 6 期 8 刘淑艳 高 松 白粉菌属级分类系统的讨论 J 菌物学报 2006 25 1 152 159 9 Braun U The powdery mildews Erysiphales of Europe M Jena Germany Gustav Fischer Verlag 1995 1 337 10 Takamatsu S Limkaisang S Braun U Phylogenetic relationships and generic affinity of Uncinula septata inferred from nuclear rDNA sequences J Mycoscience 2005 46 1 9 16 11 陈凤毛 真菌 ITS 区序列结构及其应用 J 林业科技开发 2007 21 2 5 7 12 Kiss L Takamatsu S Cunnington J H Molecular identification of Oidium neolycopersici as the causal agent of the recent tomato powdery mildew epidemics in North America J Plant Disease 2005 89 5 491 496 13 Takamatsu S Hirata T Sato Y et al J Phylogenetic relationships of Microsphaera and Erysiphe powdery mildews inferred from the rDNA ITS sequences J Mycoscience 1999 40 13 259 268 14 马原松 裴冬丽 王文静 等 河南省几种白粉菌的 ITS 序列分 析 J 河南农业科学 2012 41 9 87 90 15 李雪燕 王占斌 王金杰 一种鼠李白粉病菌的分子鉴定与亲缘 关系分析 J 中国森林病虫 2015 1 1 4 16 赵志礼 徐珞珊 董 辉 等 核糖体 DNA ITS 区序列在植物分 子系统学研究中的价值 J 植物资源与环境学报 2000 9 2 50 54 17 Mori Y Sato Y Takamatsu S et al Molecular phylogeny and radiation time of Erysiphales inferred from the nuclear ribosomal DNA sequences J Mycoscience 2000 41 5 437 447 18 Nomura Y A new genus Setoerysiphe Erysiphaceae on Rodgersia podophylla J Trans Mycol Soc Japan 1984 25 163 166 19 Saenz G Z Taylor J W Phylogeny of the Erysiphales powdery mildew inferred from internal transcribed spacer ITS ribosomal DNA sequences J Canadian Journal of Botany 1999 77 1 150 168 20 郭徐鹏 李建昌 李永红 等 陕西关中地区甘蓝型油菜白粉病 的病原菌鉴定 J 中国农学通报 2013 29 24 187 192 21 文 静 刘铁志 赵 冰 内蒙古 4 种白粉菌的 ITS 序列分析 J 江苏农业科学 2014 42 12 50 52 301 江苏农业科学 2020 年第 48 卷第 6 期