山东省番茄溃疡病病原菌的分离与鉴定.pdf

山东农业科学 2020 52 5 100 104 Shandong Agricultural Sciences DOI 10 14083 j issn 1001 4942 2020 05 019 收稿日期 2019 12 30 基金项目 山东省农业良种工程项目 2017LZGC013 山东省农业科学院农业科技创新工程项目 CXGC2018E08 国家现代农业产业技 术体系建设专项资金项目 CARS 23 G14 作者简介 苏晓梅 1988 女 博士 助理研究员 主要从事番茄遗传育种研究 E mail sxm198846 126 com 通讯作者 侯丽霞 1970 女 博士 研究员 主要从事番茄遗传育种研究 E mail houlx2006 126 com 山东省番茄溃疡病病原菌的分离与鉴定 苏晓梅1 刘淑梅1 李嘉琦2 王施慧1 侯丽霞1 1 山东省农业科学院蔬菜花卉研究所 山东省设施蔬菜生物学重点实验室 国家蔬菜改良中心山东分中心 农业部黄淮地区蔬菜科学观测实验站 山东 山东济南 250100 2 吉林农业大学园艺学院 吉林长春 130118 摘要 本试验对山东省内不同地区番茄溃疡病发病情况进行调查 采集具有典型症状的病样 采用组织分 离方法分离纯化病原菌 并对其进行形态学观察 分子生物学鉴定和致病性测定 结果表明 不同地区番茄病 样分离得到的4个菌株均属于溃疡病菌Cmm 但致病力存在差异 本研究可为番茄溃疡病的准确鉴定和病 害防治提供参考 关键词 番茄溃疡病 Cmm 病原菌 分离鉴定 中图分类号 S436 412 1 文献标识号 A 文章编号 1001 4942 2020 05 0100 05 Isolation and Identification of Pathogen Causing Bacterial Canker of Tomato in Shandong Province Su Xiaomei1 Liu Shumei1 Li Jiaqi2 Wang Shihui1 Hou Lixia1 1 Institute of Vegetables and Flowers Shandong Academy of Agricultural Sciences Shandong Provincial Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables Shandong Branch of National Improvement Center for Vegetables Huang Huai Hai Region Scientific Observation and Experimental Station of Vegetables Ministry of Agriculture and Rural Affairs Shandong Jinan 250100 China 2 College of Horticulture Jilin Agricultural University Changchun 130118 China Abstract In this experiment the incidence of tomato bacterial canker disease was investigated in differ ent areas of Shandong Province The diseased samples with classical symptom were collected and then the pathogen was isolated by tissue isolation and the morphological characteristics molecular identifica tion and pathogenicity test were conducted The results showed that four strains were obtained from the investi gated areas in Shandong Province All they belonged to Cmm with different pathogenicity This research could provide references for the identification and control of tomato bacterial canker Keywords Bacterial canker of tomato Cmm Pathogen Isolation and identification 番茄溃疡病 bacterial canker of tomato 是一 种由细菌侵染而引起的维管束病害 病原菌为密 执安棒形杆菌密执安亚种 Clavibacter michiganen sis subsp michiganensis Cmm 可侵染辣椒 龙葵 裂叶茄及其它番茄属植物 番茄溃疡病的主要症 状包括叶片边缘坏死 叶片萎蔫至枯死 茎和叶柄 出现褐色条斑 病斑下陷 开裂而露出髓腔 呈溃 疡状以及维管束变褐等 果实出现圆形病斑 中央 浅褐色 边缘为白色晕圈 形似鸟眼状 可联合成 不规则斑块 1 该病害在番茄生育期内均可发 生 特别是温暖潮湿条件更易造成该病的大规模 暴发与流行 我国于1985年首次在北京市平谷 发现番茄溃疡病 2 1993年东北地区也报道了 该病发生 3 2002年 安徽省国宁市方塘乡番茄 溃疡病发病率超过80 2007 2009年 该病给 贵州省修文县造成的产量损失达40 50 4 近年来 随着气候的异常变化及番茄种植规模扩 大 番茄溃疡病在黑龙江 吉林 辽宁 内蒙古 新 疆 河北 河南 山东 上海 海南 重庆 湖北 贵州 等省区均有不同程度发生 且逐年加重 这对番茄 生产造成一定影响 1 5 8 本研究对山东省不同地区番茄溃疡病田间发 病情况进行调查 采集病样进行病原菌分离与纯 化 并对分离得到的病原菌进行形态学观察 分子 生物学鉴定以及致病性测定 以明确不同地区番 茄溃疡病菌的致病力差异 为番茄溃疡病的鉴定 防治及探索该病病原菌的多态性提供参考 1 材料与方法 1 1 试验材料 供试培养基 523液体培养基 每升含10 g 蔗糖 8 g水解酪素 4 g酵母浸膏 2 g K2HPO4 0 3 g MgSO4 7H2O 523固体培养基 在上述 523液体培养基基础上添加15 g琼脂 培养基用 前高压灭菌 且pH值调整为6 9 7 1 病原菌致病性测定试验所用番茄品种Heinz 1706 种植于32孔穴盘 待长至三叶一心时进行 处理 1 2 田间调查及病样采集 于2018 2019年调查山东省泰安市岱岳区 济南市济阳区 蒙阴县 寿光市等地番茄溃疡病发 病情况 选择典型病株 观察 记录病害症状 并将 病样带回实验室进行病原菌分离 1 3 病原菌分离培养及形态观察 采用常规组织分离法对病原菌进行分离 具 体步骤 使用灭菌解剖刀切取病健交界处1 2 cm茎段 先用无菌水冲洗干净 再经1 NaClO 溶液消毒5 min 后用无菌水清洗3次 将消毒后 茎段置于灭菌培养皿中 加1 2滴无菌水 挤压 使组织液渗出 用灭菌接种环蘸取组织液在523 固体培养基平板上划线 先在平板的一侧顺序划 3 5条线 再将培养皿转60 从第二条线末端顺 序划3 5条线 9 后置于28 恒温箱中培养 2 3 d后 挑取疑似溃疡病菌落进行纯化培养 观 察 记录菌落形状 大小 颜色等形态特征 1 4 病原菌分子生物学鉴定 挑取纯化后菌落至523液体培养基中 28 200 r min振荡培养12 h后 6 000 r min离心2 min 弃上清 菌体用无菌水洗涤2次后 重悬于无 菌水中备用 以上述重悬菌体为模板 采用表1中引物进 行PCR扩增 反应体系 10 L 菌悬液2 L 上 下游引物各0 25 L 2 Taq Mix 5 L ddH2O 2 5 L 反应程序 94 预变性5 min 94 变性 30 s 55 退火30 s 72 延伸1 min 32个循环 72 延伸5 min 16 保存 扩增产物经1 5 琼 脂糖凝胶电泳检测后送至北京六合华大基因科技 有限公司测序 利用NCBI数据库的Blast程序 对测序结果进行比较 表1 试验所用引物 引物编号引物名称引物序列 5 3 产物长度 bp 参考文献 1 Cmm5 GCGAATAAGCCCATATCAA 614 Dreier等 10 Cmm6 CGTCAGGAGGTCGCTAATA 2 ClaF1 TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC 271 Pastrik等 11 ClaR2 TACTGAGATGTTTCACTTCCCC 3 BT1 CGTCAGGCGTCTGTTCT 268赵文军等 12 BT2 GATGCTCGCGTCCACT 4 ITS1 GCATGTGCACCTCTCCTCTGTAT 420李江利等 5 ITS2 TCACATGAGATTGAATCGTTTCGCCT 5 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1300张庆萍等 13 1492R GGTTACCTTGTTACGACT 1 5 病原菌致病性测定 将纯化后各病原菌分别转至523液体培养基 中 28 200 r min振荡培养12 h后 将各菌悬 液浓度调至108 109 cfu mL 采用打顶法接种 将手术剪前端1 cm处蘸取菌悬液 在幼苗新叶处 将主茎剪断 14 以蘸取无菌水为对照 每份菌悬 液接种8株 重复3次 接种后 先将植株置于 28 环境中 RH为90 100 保湿48 h 再进 行正常管理 白天25 28 夜晚20 22 平均 湿度80 90 20 d后观察病情发展情况 2 结果与分析 2 1 山东省不同地区番茄溃疡病的田间发病情况 经调查发现 不同地区番茄病株表现症状一 致 均为下部叶片先出现染病症状 后逐渐向顶端 蔓延 该病进一步扩展时 叶柄 侧枝或主茎出现 灰褐色条斑 后期茎部略变粗 表面产生许多不定 101 第5期 苏晓梅 等 山东省番茄溃疡病病原菌的分离与鉴定 根或刺状突起 开裂 髓部中空变褐 全株枯死 果 实出现典型的 鸟眼斑 症状 即病斑中央产生黑 色小斑点并伴有白色晕圈 多个病斑融合使果实 表面粗糙 图1 图1 山东省不同地区番茄溃疡病田间发病情况 2 2 病原菌分离与形态学鉴定 本试验从不同地区番茄病样中分离得到4株 菌株 培养3 d后 各菌株形态基本相同 菌落呈 凸圆形 黄色 表面平滑 边缘无锯齿 粘稠状 直 径为1 3 mm 图2 根据形态学特征 初步鉴 定4个菌株均为番茄溃疡病菌Cmm a 济阳分离菌株b 蒙阴分离菌株c 岱岳分离菌株d 寿光分离菌株 下同 图2 不同地区分离病原菌株形态 2 3 病原菌分子生物学鉴定 由图3可以看出 不同引物均能扩增出特异 条带 大小与预期一致 而对照无条带 将引物 27F 1492R扩增得到的产物进行测序 经Blast比 对 发现其与HQ144241 1 已知Cmm序列的 GeneBank登录号 同源性达99 以上 图4 因 此 分离获得的病原菌为番茄溃疡病菌Cmm M Takara DL1000 DNA Marker CK 无菌水 1 5 对应表1不同Cmm引物扩增结果 图3 不同引物对4个菌株的PCR扩增产物 201山东农业科学 第52卷 图4 引物27F 1492R扩增产物的部分比对结果 2 4 病原菌致病性鉴定 由图5可以看出 接种济阳 蒙阴 寿光分离 菌株的番茄幼苗明显出现萎蔫 死亡症状 其中 接种济阳分离菌株的幼苗症状最重 所有植株均 死亡 接种蒙阴分离菌株的幼苗症状次之 接种寿 光分离菌株的8株幼苗中有3株萎蔫死亡 5株 萎蔫 而接种岱岳分离菌株的幼苗无明显发病症 状 仅在接种伤口处出现萎蔫 个别叶片发生萎 图5 接种不同地区分离菌株的番茄幼苗发病情况 蔫 因此 不同地区的番茄溃疡病菌株致病力强 弱存在差异 3 讨论与结论 本试验采集山东省内主要番茄产区的番茄溃 疡病样 并从中分离获得纯化菌株 根据形态学 观察和分子生物学鉴定结果 证实所得菌株均为 Cmm 这与其它地区所报道 5 7 的番茄溃疡病菌 一致 然而 本研究样本仅采自山东省 存在一定 局限性 但引起番茄溃疡病的病原菌并没有生理 小种分化 只是致病力有所差异 这与前人的研 究 15 17 基本一致 因此 下一步应扩大采集和鉴 定国内番茄产区的溃疡病菌 对其遗传多样性及 致病性差异进行分析 另外 番茄溃疡病菌Cmm 的测序工作已经完成 18 可充分利用基因组数据 信息 在病原菌的致病机制和寄主的抗病机理及 阐明二者互作机制方面开展研究 从而更好地为 该病害防治提供参考 301 第5期 苏晓梅 等 山东省番茄溃疡病病原菌的分离与鉴定 近年来番茄溃疡病已成为我国番茄生产的重 大威胁 许多国家已将其列为检疫性病害 目前 该病害主要以预防为主 生产中尚无有效防治药 剂 而培育抗病品种是有效的防治手段 本研究 对番茄溃疡病菌进行分离鉴定以及致病力测定 这是进行番茄溃疡病抗性鉴定的前提 下一步还 需建立完善的苗期接种鉴定体系以及筛选鉴定番 茄种质资源 更好地为番茄溃疡病的抗病育种及 利用研究奠定基础 参 考 文 献 1 李焕玲 石延霞 谢学文 等 李宝聚博士诊病手记 四十 二 番茄溃疡病的发生规律与防治技术 J 中国蔬菜 2011 23 24 27 2 刘泮华 张乐 李明远 北京市发生番茄溃疡病 简报 J 植物保护 1986 12 1 32 33 3 赵廷昌 王克 白金镗 等 东北地区番茄细菌性溃疡病的 发生和病原鉴定研究 J 植物病理学报 1993 23 1 29 34 4 石延霞 张珊珊 黄大野 等 李宝聚博士诊病手记 二十 三 贵州省修文县番茄 火烧疫 病原鉴定 J 中国蔬 菜 2010 7 18 19 5 李江利 欧阳林杰 郭淼淼 等 河南省番茄溃疡病的发现 与分子确诊 J 河南农业大学学报 2011 45 3 349 352 6 祁占东 承德地区番茄溃疡病发生特点与综合防治技术 J 中国蔬菜 2014 1 71 72 7 陈磊 罗金燕 赵玉强 等 上海市番茄溃疡病的确诊及其 防控对策 J 浙江农业科学 2016 57 12 2054 2057 8 康华军 温智浩 袁军海 等 新疆加工番茄细菌性斑点病 与溃疡病复合侵染鉴定及防治建议 J 中国蔬菜 2018 6 83 86 9 曹春梅 徐利敏 胡俊 25个番茄品种抗细菌性溃疡病室 内测定 J 内蒙古农业科技 2008 2 30 32 10 Dreier J Bielefeld U Biologie F Southern hybridization and PCR for specific detection of phytopathogenic Clavibacter michi ganensis subsp michiganensis J Phytopathology 1995 85 462 468 11 Pastrik K H Rainey F A Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reac tion based techniques J Journal of Phytopathology 1999 147 11 12 687 693 12 赵文军 夏明星 陈红运 等 番茄溃疡病菌PCR快速检 测技术 J 植物检疫 2007 21 2 75 77 13 张庆萍 王燕春 赵伟强 等 番茄溃疡病病原菌遗传多样 性分析 J 北方农业学报 2017 45 6 20 23 14 罗来鑫 李健强 Bolkan H 番茄细菌性溃疡病苗期接种新 方法的研究 J 植物病理学报 2005 35 2 123 128 15 王蕊 罗来鑫 李健强 不同来源番茄溃疡病菌致病力差异 研究 J 植物保护 2010 36 1 73 76 16 Milija evic Marc ic S Gartemann K H Frohwitter J et al Characterization of Clavibacter michiganensis subsp michi ganensis strains from recent outbreaks of bacterial wilt and can ker in Serbia J European Journal of Plant Pathology 2012 134 697 711 17 张庆萍 王燕春 徐佳 等 番茄溃疡病病原菌致病性的鉴 定 J 北方农业学报 2016 44 6 26 30 18 Gartemann K H Abt B Bekel T et al The genome sequence of the tomato pathogenic actinomycete Clavibacter michi ganensis subsp michiganensis NCPPB382 reveals a large island involved in pathogenicity J Journal of Bacteriology 2008 190 6 2138 2149 401山东农业科学 第52卷