番茄匍柄霉叶斑病拮抗细菌的筛选与鉴定.pdf

园艺学报 2020 47 4 741 748 Acta Horticulturae Sinica doi 10 16420 j issn 0513 353x 2019 0630 http www ahs ac cn 741 收稿日期 2019 12 23 修回日期 2020 03 03 基金项目 国家重点研发计划项目 2017YFD0201102 中国农业科学院科技创新工程项目 CAAS ASTIP IVFCAAS 农业部园艺作 物生物学与种质创制重点实验室项目 通信作者 Author for correspondence E mail libaoju xiexuewen 番茄匍柄霉叶斑病拮抗细菌的筛选与鉴定 李新宇 1 2 李 磊 1 陈利达 1 石延霞 1 柴阿丽 1 谢学文 1 李宝聚 1 1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 北京 100081 2 沈阳农业大学植物保护学院 沈阳 110866 摘 要 应用平板对峙法从连作多年的番茄根际土样中筛选得到对番茄匍柄霉叶斑病具有较强拮抗 活性的细菌菌株 ZF161 该菌株对番茄匍柄霉的平板抑制率达到 70 51 离体叶片试验显示 菌株 ZF161 对番茄匍柄霉叶斑病防治效果达到 69 83 通过菌落形态观察 生理生化特性 Biolog 测定和多基因系 统发育树综合分析 鉴定菌株 ZF161 为枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 番茄盆栽试验结果表明 菌株 ZF161 对番茄匍柄霉叶斑病的防治效果达到 63 27 进一步平板对峙抑菌谱试验结果显示 菌株 ZF161 对其他 7 种病原真菌也具有较好的抑制效果 上述结果说明 菌株 ZF161 对番茄匍柄霉叶斑病具有良好 的防治效果 且对多种病原真菌也具有抑制作用 具有开发应用的潜力 关键词 番茄 拮抗细菌 枯草芽孢杆菌 番茄匍柄霉叶斑病 防治效果 中图分类号 S 641 2 文献标志码 A 文章编号 0513 353X 2020 04 0741 08 Screening and Identification of Antagonistic Bacteria Against Gray Leaf Spot of Tomato Caused by Stemphylium solani LI Xinyu 1 2 LI Lei 1 CHEN Lida 1 SHI Yanxia 1 CHAI Ali 1 XIE Xuewen 1 and LI Baoju 1 1 Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100081 China 2 Plant Protection College Shenyang Agricultural University Shenyang 110866 China Abstract Gray leaf spot is one of major diseases on tomato At present chemical control was the only way against the disease So it has a significant meaning to screen and use biocontrol bacteria to deal with the disease A bacterial strain named ZF161 isolated from rhizosphere soil of tomato in a continuous cropping system exhibited a high antagonistic effect on gray leaf spot of tomato caused by Stemphylium solani Weber The plate bioassay showed that the inhibition rate on S solani was 70 51 The control effect of ZF161 against tomato gray leaf spot of inoculated tomato detached leaf was 69 83 The strain was identified as Bacillus subtilis based on morphological biochemical and physiological analysis The pot experiment result revealed that the control effect of ZF161 against tomato gray leaf spot was 63 27 The antifungal activity of strain ZF161 was tested by plate confrontation method The result showed that strain ZF161 exhibited a broad spectrum against seven pathogenic fungi Overall B subtilis ZF161 is a beneficial bacteria in biocontrol of plant disease Keywords tomato antagonistic bacteria Bacillus subtilis gray leaf spot of tomato control effect Li Xinyu Li Lei Chen Lida Shi Yanxia Chai Ali Xie Xuewen Li Baoju Screening and identification of antagonistic bacteria against gray leaf spot of tomato caused by Stemphylium solani 742 Acta Horticulturae Sinica 2020 47 4 741 748 番茄匍柄霉叶斑病主要为害番茄的叶片 茎蔓和果实 全生育期均可发病 从局部发病到全株 感染只需要 2 3 d 防治难度较大 李戌清 等 2015 番茄匍柄霉叶斑病由茄匍柄霉 Stemphylium solani Wallr 和番茄匍柄霉 Stemphylium lycopersici Enjoji Yamamoto 引起 其中茄匍柄霉是主 要病原菌 李宝聚 等 2009 近几年 芽孢杆菌 Bacillus sp 制剂得到了广泛的应用 大量实践证明芽孢杆菌容易从植株 根际土壤 根系和叶片等部位分离 并且能产生耐热 耐旱 抗紫外线和有机溶剂的芽孢 可迅速 在植株及根系定殖和扩繁 谢学文 等 2016 石玉莹 等 2017 申顺善 等 2019 目前已有大 量报道关于应用芽孢杆菌进行植物病害的防治 王伟等 2010 筛选到 1 株对番茄灰霉病菌具有较 强拮抗效果的贝莱斯芽孢杆菌 B velezensis Chen 等 2014 筛选到 1 株对核盘菌具有拮抗效果 的枯草芽孢杆菌 B subtilis Mohammad 等 2018 发现 1 株对疫霉菌具有拮抗效果的枯草芽孢 杆菌 B subtilis 本研究中从番茄根际土壤中分离并筛选出 1 株对番茄匍柄霉叶斑病有明显拮抗活性的生防芽孢 杆菌 对其拮抗效果进行了初步研究 以期为番茄匍柄霉叶斑病的生物防治及生物药剂的开发提供 理论基础和科学依据 1 材料与方法 1 1 供试材料 供试番茄品种为 齐达利 购于先正达生物科技 中国 有限公司 病原真菌包括茄匍柄霉 S solani 多主棒孢菌 Corynespora cassiicola 葫芦科刺盘孢菌 Colletotrichum orbiculare 辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 茄病镰孢菌 Fusarium solani 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 和茄链格孢 Alternaria solani 等 均由中国农业科学院蔬菜花卉 研究所保存 供试培养基 PDA 培养基 马铃薯 200 g L 1 葡萄糖 20 g L 1 琼脂 18 g L 1 PD 培养基 马铃薯 200 g L 1 葡萄糖 20 g L 1 LB 固体培养基 胰蛋白胨 10 g L 1 酵母提取物 5 g L 1 NaCl 10 g L 1 琼脂 18 g L 1 LB 液体培养基 胰蛋白胨 10 g L 1 酵母提取物 5 g L 1 NaCl 10 g L 1 脱脂牛奶培养基 蛋白胨 10 g L 1 牛肉粉 3 g L 1 NaCl 5 g L 1 pH 7 0 脱脂 牛奶 100 mL L 1 对照药剂为 50 异菌脲 陕西皇牌作物科技有限公司 可湿性粉剂 1 2 拮抗细菌的分离 纯化与筛选 从山东寿光 北京大兴 天津武清等多年连续种植番茄的大棚采集根际土样共 14 份 使用无 菌样品袋带回实验室及时保存处理 拮抗细菌的分离步骤 称取 10 g 土样 放入盛有 90 mL 无菌水的锥形瓶中 置于 28 180 r min 1 的摇床上振荡 30 min 使之充分悬浮 80 水浴处理 15 min 后梯度稀释至 10 3 10 4 分别 吸取 100 L 滴加到 LB 固体平板的中央 用涂布器涂匀后正向静置 2 h 使溶液充分渗进平板中 每个梯度重复 3 次 平板倒置于 28 恒温培养箱中培养 2 d 挑取形态不同的细菌菌落通过平板划 线法纯化后进行编号保存 采用平板对峙法 郭芳芳 等 2014 将直径 5 mm 的茄匍柄霉菌菌饼接种于 PDA 平板 直径 90 mm 中央 培养 24 h 后 在距离培养皿中心 30 mm 处以十字交叉法均匀打 4 个孔 注入拮抗细 菌发酵液 以接种无菌 LB 培养基作为对照 每个处理 3 次重复 将培养皿倒置于 28 培养箱内 李新宇 李 磊 陈利达 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚 番茄匍柄霉叶斑病拮抗细菌的筛选与鉴定 园艺学报 2020 47 4 741 748 743 培养 当对照菌落菌丝即将布满整个平板时 测量菌落的直径 抑制率 对照菌落直径 处理菌落直径 对照菌落直径 菌饼直径 100 在 LB 平板上活化菌株 ZF161 后 挑取单菌落接种于装有 200 mL 液体培养基的 250 mL 三角瓶 中 28 180 r min 1 振荡培养 36 h 此时菌悬液含菌量约为 10 8 cfu mL 1 匍柄霉菌在 PDA 培 养基上培养 3 d 在菌落边缘用打孔器取 6 mm 的菌饼 接种于装有 200 mL PD 培养基的 250 mL 三 角瓶中 28 140 r min 1 培养振荡 7 d 后 将菌体打碎备用 参考杨利敏 2015 方法 选取大小 形状相近的番茄叶片 用 75 乙醇表面消毒 再用无菌 水冲洗 3 次 晾干后采用喷雾法接芽孢发酵液 10 8 cfu mL 1 以及对照药剂 3 g L 1 然后接匍 柄霉菌悬液 28 相对湿度 95 100 黑暗条件下保湿培养直至对照充分发病 按 农药田间 药效实验准则 农业部农药检定所生测室 1993 调查叶片发病情况 设 3 次重复 每个重复 5 个叶片 番茄匍柄霉叶斑病病情按病斑面积占叶片面积比例分级 0 级 0 1 级 1 5 3 级 6 10 5 级 11 25 7 级 26 50 9 级 50 以上 病情指数 各级值 各级病叶数 调查总叶数 最高级值 100 防治效果 对照组病情指数 处理组病情指数 对照组病情指数 100 1 3 拮抗细菌 ZF161 的鉴定 参考伯杰氏细菌鉴定手册 Buchanan Gibbons 1994 和 常见细菌系统鉴定手册 东秀珠 和蔡妙英 2001 进行 ZF161 的形态特征及生理生化特性分析 使用 BIOLOG GENIII 试剂盒 按照试剂盒说明书操作 测定菌株 ZF161 唯一碳源利用 采用 DNA 提取试剂盒 天根生化科技 北京 有限公司 提取菌株 ZF161 的总 DNA 利用细菌 16S rDNA 通用引物 27F 1492R Weisburg et al 1990 和针对目标基因设计引物 gyrB F R atpD F R 和 rpoA F R 表 1 对菌株 ZF161 进行 PCR 扩增 反应体系 50 L 2 Rapid Taq Master Mix 南 京诺唯赞生物科技有限公司 25 L 上游引物和下游引物各 0 5 L 10 mol L 1 DNA 模板 0 2 L 60 ng mL 1 ddH 2 O 补足剩余体积 PCR 扩增程序均为 95 10 min 95 30 s 58 30 s 72 45 s 34 个循环 72 8 min PCR 产物直接测序 北京博迈德基因技术有限公司 参 与比较分析的序列均来源于 GenBank 用 MEGA 6 0 Sequence Matrix Seaview4 按顺序连接 比 对不同菌株的 16S rDNA gyrB atpD rpoA 基因 采用最大似然法构建系统发育树 分析其亲缘 关系 表 1 本研究中所用引物 Table 1 Primers used in this research 引物与序列 5 3 Sequence 目标基因 Target gene PCR 产物大小 bp PCR product 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R ACGGCTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA 1 466 gyrB F GCAGCAAAACAGTTATGATGAA gyrB R AGTCTTCTCCGATACCTGTGC gyrB 1 448 rpoA F TCAGCGACGATGCCAAA rpoA R TCTTTGCGAAGTCCGAGTC rpoA 898 atpD F ACAAGTTTGTCTTCCTCGCC atpD R TGAGGTCGCTCTTCATTTAGG atpD 1 053 1 4 菌株 ZF161 对番茄匍柄霉叶斑病的盆栽防治 盆栽番茄长至 5 片真叶时喷施菌株 ZF161 发酵液 以喷雾 50 异菌脲可湿性粉剂和清水为对照 Li Xinyu Li Lei Chen Lida Shi Yanxia Chai Ali Xie Xuewen Li Baoju Screening and identification of antagonistic bacteria against gray leaf spot of tomato caused by Stemphylium solani 744 Acta Horticulturae Sinica 2020 47 4 741 748 待叶片表面晾干后采用叶面喷雾的方式接种匍柄霉菌菌悬液 然后放入相对湿度 95 温度 26 28 玻璃棚中保湿培养 48 h 之后转入正常育苗温室培养 每处理 20 株番茄 3 次重复 接种后 10 d 清水对照充分发病时调查防治效果 1 5 菌株 ZF161 抗真菌谱的测定 采用平板对峙法测定菌株 ZF161 对 7 种病原真菌的抑菌活性 方法参照 1 2 2 结果与分析 2 1 拮抗细菌的分离 纯化和筛选 从采集土样中共分离出细菌 82 株 通过平板对峙培养 获得 7 株对茄匍柄霉菌平板抑菌率大 于 50 的菌株 其中菌株 ZF161 的抑菌效果最好 抑菌率为 75 64 表 2 表 2 筛选获得的 7 株拮抗细菌对茄匍柄霉菌的抑制效果 Table 2 Inhibition activity of acquired antagonistic bacterial strain against Stemphylium solani 处理 Treatment 菌落直径 mm Colony diameter 抑菌率 Inhibition rate IVF19 23 0 0 4 de 70 51 0 93 ab IVF43 31 7 0 5 b 59 40 1 60 d A 5 31 0 2 3 b 60 26 5 67 d ZF161 19 0 1 1 e 75 64 2 60 a 18051709 2 1 28 7 1 7 bc 43 16 4 27 cd 18051709 2 2 24 7 0 5 cd 68 38 1 25 bc 18051709 2 3 27 7 0 9 bcd 64 53 2 73 bcd 空白培养基 Control 78 0 0 4 a 注 同列数字后小写英文字母不同表示 Duncan s 新复极差法分析差异显著 P 0 05 下同 Note Different letters in the same column indicate significant difference P 0 05 The same below 应用离体叶片法检测发现 拮抗菌株 ZF161 对番茄匍柄霉叶斑病的防效达到 69 83 对照药剂 50 异菌脲可湿性粉剂的防效为 72 34 二者无显著差异 表 3 表 3 拮抗菌株 ZF161 对番茄匍柄霉叶斑病的预防结果 Table 3 Control efficacy of strain ZF161 to gray leaf spot 处理 Treatment 病情指数 Disease index 防效 Control efficacy IVF19 33 33 cd 64 79 4 96 abc IVF43 43 70 bcd 53 41 3 68 abc A 5 42 22 bcd 55 03 12 11 abc ZF161 28 15 cd 69 83 5 96 ab 18051709 2 1 48 15 bc 48 67 3 85 bc 18051709 2 2 35 56 bcd 61 55 14 75 abc 18051709 2 3 54 81 b 42 22 16 99 c 50 异菌脲可湿性粉剂 Iprodione 25 93 d 72 34 3 02 a 清水对照 Control 94 07 a 2 2 菌株 ZF161 的鉴定结果 ZF161 菌体为杆状 革兰氏阳性 在 LB 固体培养基上菌落呈乳白色 菌落周边不规则 表面 有褶皱 李新宇 李 磊 陈利达 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚 番茄匍柄霉叶斑病拮抗细菌的筛选与鉴定 园艺学报 2020 47 4 741 748 745 生理生化反应特征表明 菌株 ZF161 的耐盐性为 4 在含 10 盐培养基上不能生长 厌氧生 长 接触酶 硝酸还原反应 水解淀粉 V P 反应 水解酪蛋白 H 2 S 产生 氧化酶反应等均为阳 性 与枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 168 的生理生化反应特点相同 Biolog 测定结果表明 菌株 ZF161 能利用蔗糖 乳糖 D 果糖 D 木糖 D 葡萄糖 D 甘露醇 D 葡糖二酸等 19 种碳源 不能利用 D 海藻糖 D 纤维二糖 D 松二糖 水苏糖 葡聚糖等 61 种碳源 初步鉴定菌株 ZF161 属于芽孢杆菌属细菌 构建 ZF161 的多基因系统发育树 发现该菌株与枯草芽孢杆菌模式菌株聚在一簇 因此确定菌 株 ZF161 为枯草芽孢杆菌 图 1 图 1 基于多基因序列构建的菌株 ZF161 系统发育树 括号内显示了核苷酸序列数据的 GenBank 登录号 T 代表模式菌株 Fig 1 Phylogenetic tree based on the multigene sequences of strain ZF161 The GenBank accession numbers for nucleotide sequence data are shown in the brackets T means type strain 2 3 菌株 ZF161 对番茄匍柄霉叶斑病的防治效果 接种 5 d 后 清水对照开始发病 ZF161 处理无病斑出现 10 d 后对照病情指数达到 45 44 番 茄幼苗发病 叶片干枯 部分植株整株干枯 ZF161 处理轻微发病 拮抗菌株 ZF161 对番茄匍柄霉 叶斑病的防效为 63 27 对照药剂 50 异菌脲可湿性粉剂 3 g L 1 的防效为 83 47 表 4 表 4 枯草芽孢杆菌 ZF161 盆栽预防结果 Table 4 Control efficacy of strain ZF161 to gray leaf spot 处理 Treatment 病情指数 Disease index 防治效果 Control efficacy ZF161 16 93 b 63 27 3 32 b 50 异菌脲可湿性粉剂 Iprodione 7 31 c 83 47 5 49 a 清水对照 Control 45 44 a Li Xinyu Li Lei Chen Lida Shi Yanxia Chai Ali Xie Xuewen Li Baoju Screening and identification of antagonistic bacteria against gray leaf spot of tomato caused by Stemphylium solani 746 Acta Horticulturae Sinica 2020 47 4 741 748 2 4 菌株 ZF161 抗真菌谱的测定 抑菌谱测定结果表明 菌株 ZF161 的抑菌谱较广 对 7 种引起蔬菜叶部 根部病害的病原真菌 均具有较好的抑制效果 其中对黄瓜棒孢叶斑病 多主棒孢菌 Corynespora cassiicola 的抑制效果 最高 达到了 62 00 对白菜茎基腐病 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 的抑制效果最低 为 47 24 对其他病原菌的抑制率在 50 60 之间 表 5 表 5 菌株 ZF161 对植物病原真菌的抑制作用 Table 5 Inhibitory effect of strain ZF161 on plant pathogenic fungi 病原菌 Pathogenic fungi 菌落直径 mm Colony diameter 抑菌率 Inhibition rate 对照 Control 处理 Treatment 葫芦科刺盘孢菌 Colletotrichum orbiculare 79 7 0 9 39 8 0 2 50 00 0 26 d 茄病镰孢菌 Fusarium solani 80 2 0 5 37 7 0 5 53 01 0 76 c 立枯丝核菌 Rhizoctonia solani 81 3 0 2 43 8 1 0 47 24 1 26 e 灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 79 8 0 9 35 8 0 2 55 11 0 24 b 茄链格孢菌 Alternaria solani 79 7 0 5 37 8 0 2 52 51 0 50 c 辣椒疫霉菌 Phytophthora capsici 80 7 0 9 40 0 0 5 50 41 0 92 e 多主棒孢菌 Corynespora cassiicola 79 8 0 4 30 3 0 2 62 00 0 27 a 3 讨论 植物体内 植物根际土壤 水样内存在大量对病原菌具有拮抗作用的有益微生物 Kloepper 1992 芽孢杆菌是公认的抗逆性强 抗菌谱广泛的有益微生物 其中枯草芽孢杆菌是近些年生防菌 研究最多的 应用于各种作物的病害防治 汪雪静等 2011 从土壤中分离得到两株枯草芽孢杆菌 对草莓根腐病菌拮抗活性很高 其抑菌圈直径均在 15 mm 以上 卫甜等 2016 从不同生境筛选得 到 3 株枯草芽孢杆菌对黄瓜绿斑驳花叶病毒的防效在 40 以上 也有不少关于番茄病害的研究 胡 朋等 2008 从根际土壤中筛选得到 1 株对番茄灰霉病发病率的抑制率达 83 的枯草芽孢杆菌 张 斌等 2015 从番茄根际土壤中分离得到 1 株枯草芽孢杆菌 其对番茄枯萎病和青枯病的防效均在 60 以上 16S rDNA 序列分析已广泛应用于细菌的鉴定和系统分类研究中 解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢 杆菌亲缘关系很近 序列间相似度也很高 16S rDNA 基因序列分析并不能精准鉴定 Christensen et al 1998 谢学文等 2016 通过 16S rDNA 与 gyrB 序列分析 对 1 株甲基营养型芽孢杆菌进行 准确鉴定 赵昱榕等 2019 通过 16S rDNA rpoD pgk 及 gyrB 联合序列分析 对 1 株贝莱斯芽 孢杆菌进行准确鉴定 本研究中获得 1 株对番茄匍柄霉叶斑病具有较高防治效果的芽孢杆菌 ZF161 通过 16S rDNA gyrB rpoA 以及 atpD 四基因联合建树 准确地将其鉴定为枯草芽孢杆菌 番茄匍柄霉叶斑病的防治药剂较少 目前仅有 45 乙霉 苯菌灵登记用于该病害防治 李长松 等 2012 发现吡唑醚菌酯与喹啉铜复配对番茄匍柄霉叶斑病具有较高的防效 化学防治药剂种类 单一 长时间连续使用容易导致抗药性提高 本研究中通过盆栽试验发现枯草芽孢杆菌 ZF161 对番 茄匍柄霉叶斑病的防治效果达到 63 27 虽然低于化学药剂 但是利用有益微生物防治植物病害可 以减少化学农药的使用量 不仅降低了病原菌抗药性风险 也避免了作物和土壤中农药残留量的增 加对人类健康的威胁 此外 生防菌较化学药剂防治谱更广 林福呈和李德葆 2003 刘雪 等 2006 沙月霞 等 2019 本研究中 ZF161 对匍柄霉菌之外的 7 种病原真菌也表现出较好的拮抗效果 一 次施用可以兼防多种病害 因此 枯草芽孢杆菌 ZF161 可以应用于番茄匍柄霉叶斑病的防治 在蔬 李新宇 李 磊 陈利达 石延霞 柴阿丽 谢学文 李宝聚 番茄匍柄霉叶斑病拮抗细菌的筛选与鉴定 园艺学报 2020 47 4 741 748 747 菜病害预防领域具有广阔的应用前景 其作用机理及发酵工艺还有待深入研究 References Buchanan R E Gibbons N E 1994 Bergeys manual of systematic bacteriology 9th ed Baltimore Williams and Wilkins Company Chen Ya fei Gao Xiao ning Chen Yong xuan Qin Hu qiang Huang Li li Han Qing mei 2014 Inhibitory efficacy of endophytic Bacillus subtilis EDR4 against Sclerotinia sclerotiorum on rapeseed Biol Control 78 67 76 Christensen H Nordentoft S Olsen J E 1998 Phylogenetic relationships of Salmonella based on rRNA sequence International Journal of Systematic Bacteriology 48 2 605 610 Dong Xiu zhu Cai Miao ying 2001 Manual of systematic methods of determinative bacterial Beijing Science Press 349 388 in Chinese 东秀珠 蔡妙英 2001 常见细菌系统鉴定手册 北京 科学出版社 349 388 Guo Fang fang Xie Zhen Lu Peng Guo Yan bin Zhang Li qin Wang Yong jun 2014 Identification of a novel Paenibacillus polymyxa strain and its biocontrol and plant growth promoting effects Chinese Journal of Biological Control 4 489 496 in Chinese 郭芳芳 谢 镇 卢 鹏 郭岩彬 张立钦 王勇军 2014 一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定 中国生物防治学 报 4 489 496 Hu Peng Shen Lin Fan Bei Yu Meng meng Sheng Ji ping 2008 Isolation and identification of antagonistic bacteria against Botrytis cinerea Food Sciences 29 6 248 251 in Chinese 胡 朋 申 琳 范 蓓 于萌萌 生吉萍 2008 番茄灰霉病拮抗细菌 Bacillus 1 的筛选和鉴定 食品科学 29 6 248 251 Kloepper J W 1992 A review of issues related to messunring colonization of plant roots by bacteria Canadian Journal of Microbiology 38 6 667 672 Li Bao ju Zhou Yan fang Zhao Yan jie Chai A li Gao Wei 2009 Occurrence and control of tomato gray leaf spot China vegetables 17 24 26 61 in Chinese 李宝聚 周艳芳 赵彦杰 柴阿丽 高 苇 2009 李宝聚博士诊病手记 十六 番茄灰叶斑病的发生与防治 中国蔬菜 17 24 26 61 Li Chang song Xu Zuo ting Wang Shao min Qi Jun shan Zhang Bo Zhao Xin lan Chen Bai shun Li Lin 2012 Antibacterial activity and control of pyraclostrobin against Gray leaf spot of tomato Shandong Agriculture Sciences 44 5 103 105 119 in Chinese 李长松 徐作珽 王绍敏 齐军山 张 博 赵新兰 陈百顺 李 林 2012 吡唑醚菌酯等对番茄灰叶斑病菌的抑菌活性与防治试验 山东农业科学 44 5 103 105 119 Li Xu qing Zheng Ji rong L Xiao han Wang Hong 2015 Research progress on tomato grey leaf spot in China China Plant Protection 35 3 24 27 in Chinese 李戌清 郑积荣 吕晓菡 王 宏 2015 我国番茄灰叶斑病研究进展 中国植保导刊 35 3 24 27 Lin Fu cheng Li De bao 2003 Cell lytic of Bacillus subtilis on plant fungal pathogens Acta Phytophylacica Sinica 33 2 174 177 in Chinese 林福呈 李德葆 2003 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis S9 对植物病原真菌的溶菌作用 植物病理学报 33 2 174 177 Liu Xue Mu Chang qing Jiang Xi liang Guo Ping Tian Yun long Zhu Chang xiong 2006 Research progress of the metabolic substances produced by Bacillus subtillis and their application on biocontrol of plant disease Chinese Journal of Biological Control 22 S1 179 184 in Chinese 刘 雪 穆常青 蒋细良 郭 萍 田云龙 朱昌雄 2006 枯草芽孢杆菌代谢物质的研究进展及其在植病生防中的应用 中国生物防 治 22 S1 179 184 Ministry of Agriculture Pesticide Test Laboratory 1993 Guidelines for the field efficacy of pesticides in the field Beijing China Standard Press 45 51 in Chinese 农业部农药检定所生测室 1993 农药田间药效实验准则 北京 中国标准出版社 45 51 Mohammad M Jafari N F Shahidi B G H Reza 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多粘类芽孢杆菌 HK18 8 对辣椒炭疽病菌的抑制作用及其定殖能 力 园艺学报 46