枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒根系及根际微生态影响.pdf

342287-293 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 4 月 收稿日期 2017-11-01 基金项目江苏省农业自主创新基金（ CX-16-1021） ；国家重点研发计划（ 2016YFD0201007） 作者简介 *共同第一作者，乔俊卿，博士，副研究员， E-mail ；罗德旭，硕士，副研究员， E-mail ；**通信作者，博士，研究员， E-mail 。 DOI 10.16409/ki.2095-039x.2018.02.017 枯草芽胞杆菌 PTS-394可湿性粉剂对辣椒根系 及根际微生态影响 乔俊卿1*，罗德旭2*，彭 彪1,3，孙玉东2，刘永锋1，刘邮洲1**（ 1. 江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014； 2. 江苏省淮安市农业科学研究院，淮安 223001； 3. 扬州大学生物科学与技术学院， 扬州 225009） 摘要本研究通过测定辣椒根系活力及生长情况，检测根际土壤可培养微生物数量和土壤酶活性等，以期明确枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒根系及根际微生态的影响。结果显示，枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂（1100）稀释菌液能够显著促进辣椒根系的伸长，促生比例达8.61，对辣椒根重量也有促进作用，增加比例为19.2，同时还可以显著提高辣椒的根系活力，尤其是在施用后的第12和24 h；而菌株PTS-394（11000）稀释菌液虽然对辣椒的根长、重量和根系活力也都有促进作用，但未达到显著效果。此外，稀释100倍的枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂对辣椒根际土壤中的真菌和放线菌含量均具有显著抑制作用，最高抑制率分别达63.6和69.5，而对细菌则无显著影响。同时，该稀释浓度的PTS-394菌液还具有促进土壤脲酶和蔗糖酶活性的作用。本研究结果不仅扩展了枯草芽胞杆菌PTS-394可湿性粉剂的施用范围，丰富了促生机理，更为其在设施辣椒栽培中的安全使用提供了理论基础。 关 键 词枯草芽胞杆菌可湿性粉剂；辣椒；根系活力；根际微生物群落；土壤酶活 中图分类号 S476 文献标识码 A 文章编号 1005-9261201802-0287-07 The uation of Impact on Pepper Root and Rhizosphere Microbial Community rted by Bacillus subtilis PTS-394 Water Powder QIAO Junqing1*, LUO Dexu2*, PENG Biao1,3, SUN Yudong2, LIU Yongfeng1, LIU Youzhou1**1. Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. Huai’an Academy of Agricultural Sciences, Huai’an 223001, China; 3. College of Biology Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China Abstract In order to clarify the effect on plant root of Bacillus subtilis PTS-394 water powder and its impact on the microbial community in rhizosphere, the pepper root growth, root activity, the amount of microbial of rhizosphere and soil enzyme activity were measured. The results showed that B. subtilis PTS-394 WP 1100 dilution has ability to promote the growth of pepper root and can increase the root dry weight and root activity. The root length and weight were about 11.60 cm and 0.155 g at 25 day after application of PTS-394 WP 1100 and higher 8.61 and 19.2 than control respectively. The root activity was stimulated significantly at 12 and 24 h after treatment with PTS-394 WP 1100. Then, the root activity was decreased to the almost same level with control at sampling time point 96 h. The lower PTS-394 WP 11000 dilution has a same effect on the pepper root, but not significantly. After the application of PTS-394 WP 1100, the amount of rhizosphere soil fungus and actinomycetes were suppressed, the highest inhibitory rates were 63.6 and 69.5 respectively; while the 288 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 bacterium amount was almost the same as control. In another hand, PTS-394 WP 1100 is able to increase the soil urease and sucrase activity. All above results were not only expand the use of PTS-394 WP, but enriched the growth promotion mechanisms of B. subtilis PTS-394 on pepper and provided a theoretical basis for the safety of application in the field. Key words Bacillus subtilis water powder; pepper; root activity; microbial community in rhizosphere; soil enzyme activity 植物根系是直接影响植物地上部的生长和营养状况的主要器官，根系吸收和供给能力（即根系活力）是评价根系的重要指标[1]。由于植物根系可分泌大量的有机物质，因此有大量的微生物生存在植物根际，并与根系形成统一的微生态系统，协调互作共同影响植物的生长发育[2-4]。土壤微生物代谢分泌的酶类是土壤与微生物之间最直接、最密切的联系桥梁，也是土壤生物代谢过程的主要调节者，这些酶类总称为土壤酶活[5]。根际微生物群落和土壤酶活是根际微生态系统的直观表征[6]。植物根际促生细菌主要包括芽胞杆菌和假单胞菌属，近年来，因其具有可促进植物生长和防治植物病害的作用，已成为生物有机肥或生物农药的重要菌株来源[7]。根际促生芽胞杆菌发挥作用的关键是其在根际的成功定殖，而定殖过程也是芽胞杆菌与根际土著微生态种群的互作、信号传递和竞争的过程[8]。芽胞杆菌通过定殖施用生境，与病原菌形成营养和侵染空间位点竞争，分泌可拮抗病原菌的抗菌物质和激发植物诱导抗性，从而发挥防治植物病害的效果[9]。此外，也可以分泌生长素、嗜铁素及解磷酶等帮助植物营养吸收，促进植物生长[10]。 本实验室前期分离的生防枯草芽胞杆菌 PTS-394，是一株广谱拮抗菌，该菌可在番茄根际定殖、并能诱导番茄抗病性，对番茄青枯病、枯萎病具有较好防效[11,12]。经过对枯草芽胞杆菌 PTS-394 高效发酵工艺的优化和相关生物农药剂型的加工，将其成功开发为生防菌剂（可湿性粉剂），并申请相关专利（专利号201110339098.X）。本试验拟采用温室盆栽试验、稀释涂布平板法及土壤酶活性检测技术，就枯草芽胞杆菌 PTS−394 可湿性粉剂对辣椒根系生长、根系活力的影响、以及对根围可培养微生物和土壤酶活性的影响变化开展研究，为其在设施辣椒栽培中的高效、安全使用提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 供试材料 枯草芽胞杆菌 PTS-394 菌种由江苏省农业科学院植物保护研究所水稻病害与生物防治研究室保存。 枯草芽胞杆菌 PTS-394 可湿性粉剂由扬州绿源生物化工有限公司生产（ 2016 年加工，含量约为 1.7 1010～2 1010CFU/g 菌粉）。辣椒品种为“苏椒 5 号”。 1.2 温室盆栽试验设计 将 PTS-394 粉剂按照 1100 倍（含菌量为 1.74 108CFU/mL 菌液）和 11000 倍（含菌量为1.8 107CFU/mL 菌液）（ w/v）稀释备用。自然土过筛，与营养土和蛭石按 111 配比，将辣椒种子播入 72 孔穴盘，待辣椒苗 4 叶 1 心时定植于单独盆钵中，置于日光温室中生长（自然光照， 15～ 28 ℃）。菌株 PTS-394 影响辣椒根系生长和活力的试验设 3 个处理，分别是菌株 PTS-394（ 11000）处理、菌株PTS-394（ 1100）和无菌水对照处理（ CK），每处理 50 钵，重复 3 次，待测完根系活力后，在移栽后的第 25 d 测定辣椒根系重量及主根长度；菌株 PTS-394 影响辣椒根围微生物含量和土壤酶活的试验共设 2个处理，分别是菌株 PTS-394（ 1100）和无菌水对照处理（ CK），每处理 30 钵，重复 3 次。菌株 PTS-394处理中，每棵辣椒苗灌根 PTS-394 粉剂相应稀释倍数的菌液 20 mL，对照处理灌根 20 mL 无菌水。 1.3 辣椒根系活力测定 氯化三苯基四氮唑（ TTC）法是植物根系活力测定常用方法[13]。 TTC 是一种氧化还原色素，可被根系细胞内的琥珀酸脱氢酶等还原，生成红色的不溶于水的 TTF。因此， TTC 的还原强度可以反映植物根系的活力。辣椒移栽处理后的第 0、 12、 24、 36、 48、 72、 96 h 定时采集辣椒根系，每次取苗 3～ 5 棵，抖落根土，合并称取根系 0.5 g，按照根活测定方法进行测定，每个样品重复 3 次。 第 2 期 乔俊卿等枯草芽胞杆菌 PTS-394 可湿性粉剂对辣椒根系及根际微生态影响 289 1.4 样品采集及可培养微生物含量测定 辣椒根际土壤细菌、真菌和放线菌的生物量消长变化采用稀释涂平板法测定。辣椒移栽处理后的第 1、3、 5、 7、 9、 15、 25 d 定时采集辣椒根际土壤，每次取苗 6 棵（ 2 棵 /处理），抖落根土，合并称取土壤 1 g，用无菌水按照 10 倍梯度稀释，分别涂布细菌、真菌和放线菌检测培养基平板[14]， 28 ℃静置培养 48～ 72 h后，统计根际土壤中可培养微生物的含量。 1.5 辣椒根际土壤酶活测定 将待测土壤样品晒干，磨碎后过 1 mm 孔筛子。蔗糖酶活性测定采用 3,5-二硝基水杨酸比色定糖法（ DNS）[15]。脲酶活性测定采用苯酚钠法[16]。采集辣椒移栽处理后的第 1、 5、 9、 15、 25 d 的辣椒根围土壤，风干后进行土壤酶活性的检测。 1.6 数据统计与分析 试验数据采用 Excel 2003 和 SPSS 19.0 软件进行统计分析，邓肯氏新复极差法分析不同处理间差异显著性。 2 结果与分析 2.1 枯草芽胞杆菌 PTS-394 粉剂对辣椒根系的促生作用 在不同稀释浓度的 PTS-394 菌剂灌根处理后的第 25 d，调查了番茄根系主根长及根系重量，枯草芽胞杆菌 PTS-394（ 1100）稀释菌液能够显著促进辣椒根系的伸长，增加比例达 8.61，此外，对辣椒的根重也有促进作用，促生比例为 19.2；而菌株 PTS-394（ 11000）稀释菌液虽然对辣椒的根长及重量都有一定的促进作用，但并未达到显著效果。以上结果说明，合适浓度的 PTS-394 菌剂稀释液能够促进辣椒根系的生长，而根系的发达与植物地上营养部分密切相关（表 1）。 2.2 枯草芽胞杆菌 PTS-394 粉剂对辣椒根系活力的影响 植物根系活力是指根系新陈代谢活动的强弱，是反映根系吸收功能的一项综合指标。基于 2.1 的结果，采用 TTC 法测定了菌剂 PTS-394（ 1100 和 11000）稀释液处理辣椒苗后 0、 12、 24、 36、 48、 72 和 96 h的根系活力。结果显示， PTS−394 菌剂 1100 倍稀释液处理后辣椒的根系活力在第 12、 24、 48、 72 h 时都比对照显著增高，增高比例分别为 23.2、 16.5、 53.6和 68.7，而在 36～ 96 h，根系活力和对照基本保持一致； PTS-394 菌剂 11000 倍稀释液处理后辣椒的根系活力在第 24、 48、 72 h 时都比对照高，增高比例分别为 6.91、 16.3和 25.9，而在第 12、 36 到 96 h，根系活力和对照基本保持一致。以上结果表明， PTS-394 菌剂 1100 倍稀释液对辣椒的根系活力具有显著的促进作用，而当稀释倍数进一步降低时（ 11000），菌株 PTS-394 促进根系活力的效果显著下降（图 1）。 根系活力Rootactivityμg/g/h注不同英文字母代表在相同时间点 0.05 水平下不同处理间差异显著。 Note Different lowercase letters indicated significant difference between different treatment in the same time at 0.05 level by Duncan’s new multiple range test. 图 1 枯草芽胞杆菌 PTS-394 粉剂对辣椒根系活力的影响 Fig. 1 The effect of B. subtilis PTS-394 on pepper root activity 290 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 2.3 枯草芽胞杆菌 PTS-394 粉剂对辣椒根际微生物含量的影响 采用稀释涂板法对 PTS-394 菌剂处理和未处理的辣椒根围土壤中可培养细菌、真菌和放线菌数量进行了测定和统计分析，结果显示，随着菌株 PTS-394 的大量使用，辣椒根围细菌含量在第 1 d 时陡然增高，然而，随着辣椒的生长，对照和菌株 PTS-394 处理的辣椒根围土壤细菌含量均呈现曲折上升的趋势，且菌株 PTS-394 对细菌含量的影响不显著，基本与对照相近。就真菌而言，对照和菌株 PTS-394 处理的根围真菌含量均达到 103CFU/g 干土，菌株 PTS-394 能够显著抑制辣椒根围土壤真菌含量，尤其是在第3～ 7 d，且在第 5 d 的真菌含量抑制比率最高，比对照下降了 63.6。辣椒移栽第 5 d 后，菌株 PTS-394处理的辣椒根围土壤放线菌的数量与对照相比，呈降低趋势，在第 7 d 时，菌株 PTS-394 对放线菌的抑制效果最明显，抑制比率达 69.5；在第 9 d 时， PTS-394 处理的放线菌数量比对照稍高，但随后又呈现PTS−394 抑制放线菌的作用，直到第 25 d 时，菌株 PTS-394 处理与对照的放线菌含量基本相近（图 2）。 0501001502002503003504001 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425处理时间 Day after treatment d根围土壤细菌含量The amount of bacterium104CFU/g soil CKPTS-394 11000204060801001201401601801 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425根围土壤真菌含量The amount of fungus102CFU/g soil0501001502002501 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25根围土壤放线菌含量The amountof actinomycete104CFU/g soil图 2 枯草芽胞杆菌 PTS-394 粉剂对辣椒根围土壤可培养细菌、真菌和放线菌含量的影响 Fig. 2 The quantitative change of bacteria, fungi, actinomycetes in pepper soil inoculated with B. subtilis PTS-394 第 2 期 乔俊卿等枯草芽胞杆菌 PTS-394 可湿性粉剂对辣椒根系及根际微生态影响 291 表 1 枯草芽胞杆菌 PTS-394 对辣椒根系的生长影响 Table 1 The effect of B. subtilis PTS-394 on pepper root growth 处理 Treatment 根长 Root length cm 根重 Root weight g PTS-394 1100 11.60± 1.50 b 0.155± 0.032 b PTS-394 11000 10.95± 0.73 a 0.142± 0.028 ab 对照 CK 10.68± 1.25 a 0.130± 0.048 a 注根长、根干重分别为处理后 25 d 数据。表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示经 Duncan 氏新复极差法检验差异显著（ P＜ 0.05） 。 Note The root length and weight were recorded at 25 day after transplanted. The data in the table were mean± SE. Different letters in the same column indicated significant difference at 0.05 level by Duncan’s new multiple range test. 以上结果表明，菌株 PTS-394 对辣椒根围土壤中可培养真菌和放线菌具有显著抑制作用，而对根围土壤中可培养细菌含量则无显著影响。 2.4 枯草芽胞杆菌 PTS-394 粉剂对辣椒根际土壤酶活性的影响 基于标准葡萄糖溶液和 DNS 反应法绘制标准曲线，得出土壤蔗糖酶活性回归方程 y＝ 1.4594x－ 0.047，R²＝ 0.9977。采用苯酚钠法绘制 NH3-N 标准曲线，得出土壤脲酶活性回归方程 y＝ 0.0279x＋ 0.0119，R²＝ 0.9791。 辣椒根际土壤的蔗糖酶和脲酶活性分别按照回归方程计算获得。 随着辣椒的生长， PTS-394粉剂处理后，辣椒根际土壤脲酶的活性和蔗糖酶的活性均比对照增高；第 15 d 时的土壤脲酶增加作用最为显著，增高比例达 23.7；而土壤蔗糖酶活性在第 5 和 25 d 时增加作用则最为明显（图 3）。 CK2.002.402.803.203.604.001 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425PTS-394 1100951001051101151201251301 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25处理时间 Day after treatment d图 3 枯草芽胞杆菌 PTS-394 粉剂对辣椒根围土壤脲酶和蔗糖酶活性的影响 Fig. 3 Effects of PTS-394 on soil urease and sucrase activity in pepper rhizosphere 292 中 国 生 物 防 治 学 报 第 34 卷 3 讨论 植物根系的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长、营养状况和产量水平。孙佳瑞等[17]研究报道生防链霉菌 s506 能够提高根系活力，改变根系物理结构。乔俊卿等[18]报道枯草芽胞杆菌 PTS-394 发酵菌液也能够显著促进番茄的根系生长和活力。本研究发现，不同稀释倍数的生防菌 PTS-394 可湿性粉剂处理辣椒后，植株的根长和根重都有增加，且根系活力在处理后的第 12～ 72 h 内也显著提高，这一结果表明，番茄和辣椒虽然是不同的茄科作物， 但枯草芽胞杆菌 PTS-394 生防菌剂对辣椒根系的生长和根系活力具有相同的促进作用，进一步推测菌株 PTS-394 对常见茄科蔬菜（番茄、辣椒）的根系可能具有相似的促生作用机理。 因为植物根系可以分泌不同的营养物质，从而可以吸引土壤中的微生物向根围聚集，形成具有一定功能的根围微生态保护层，促进植物的健康生长[19]。当生防菌在生境中施用时，必然会冲击原著微生态群落的结构，可能发生有利或有弊的影响。乔俊卿等[18,20]研究报道生防菌 PTS−394 发酵液对番茄根围土壤放线菌具有显著促进作用，轻微抑制真菌含量，但对根围细菌无显著影响。本研究结果显示，枯草芽胞杆菌PTS−394 可湿性粉剂（ 1100）稀释液能够显著抑制辣椒根围土壤真菌和土壤放线菌含量，而对根围细菌无显著影响。同样是生防菌 PTS-394 灌根处理，但是在番茄和辣椒根围中的土壤可培养微生物含量变化趋势却完全不同。推测这主要是由于番茄和辣椒根系所分泌的物质种类不同，因而其根部的土壤微生物主要群落不同[21]， 可能导致菌株 PTS-394 对辣椒和番茄根际土壤中细菌、 真菌和放线菌的种群影响不同。 此外，由于分泌物的不同，因此可能诱导芽胞杆菌 PTS−394 产生的抑菌活性物质不同，也会造成其对辣椒根围微生物的影响与番茄根围的不同。 当根际环境（如温湿度、酸碱度、通气性及外来微生物入侵等）发生改变引起土壤微生物种群改变时，土壤酶活性也将随之发生相应变化[22]。本研究结果显示，枯草芽胞杆菌 PTS-394 可湿性粉剂（ 1100）稀释液的施入能够促进辣椒根际土壤脲酶和土壤蔗糖酶的活性，这与乔俊卿等[18]研究的枯草芽胞杆菌PTS-394 能够促进番茄根际土壤脲酶和土壤蔗糖酶的活性一致。以上结果表明，菌株 PTS-394 具有改善土壤酶活性，提高土壤肥力，从而增加植物产量的作用，这也是枯草芽胞杆菌 PTS-394 促进辣椒生长并防控设施辣椒土传病害的微生态机制之一。 参 考 文 献 [1] 张鋆鋆 , 刘冰洋 , 王一凡 , 等 . 植物根系研究进展 [J]. 天津农业科学 , 2016, 11 11-18. 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