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园艺学报， 2018， 45 (3)： 503 510. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0785； http： /www. ahs. ac. cn 503 收稿日期 ： 2018 01 09； 修回日期 ： 2018 03 01 基金项目 ： 国家自然科学基金项目（ 31301786， 31672165） ；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（ CARS-24-A-10） ；山东省重点研发计划项目（ 2017GNC10110） ；山东省农业科学院青年科研基金项目（ 2015YQN33） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： ty_7163.com； wutta2014163.com） 洋葱 S 型细胞质雄性不育相关基因的挖掘及分子标记开发 陈 立1,2，杨亚会1,2，霍雨猛2，刘冰江2，孙雨晴2,3，杨建平1，吴 雄2,*，杨妍妍2,*（1山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018；2山东省农业科学院蔬菜花卉研究所，济南 250100；3吉林农业大学园艺学院，长春 130118） 摘 要： 以洋葱（ Allium cepa L.） S 型细胞质雄性不育系和保持系材料为试材，对洋葱线粒体全基因组中的 58 个开放阅读框（ ORF）进行差异表达分析，发现了一个表达差异片段 orf393。采用实时荧光定量 PCR 技术，利用洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系的根，叶片，花茎以及花粉母细胞、四分体、单核花粉粒、成熟花粉粒等 4 个发育时期的花蕾对 orf393 进行时空表达分析。结果表明： orf393 在洋葱 S型细胞质雄性不育系的根、叶片、花茎和 4 个发育时期的花蕾中均有表达，尤其是在四分体时期花蕾中表达量最高，之后恢复到营养生长时期的表达水平，但在保持系中未见其表达，这表明 orf393 是组成型表达，可能与洋葱的花粉发育存在某种关联。利用 orf393 在 S 型细胞质雄性不育系和保持系之间的序列差异，开发了一个稳定可靠的鉴别洋葱细胞质类型的 SCAR 分子标记 GXX393。 关键词： 洋葱；细胞质雄性不育； orf393；基因表达；分子标记 中图分类号： S 633.2 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 03-0503-08 Gene Discovery Related to S-type Male Sterility in Onion and Its Usage for Development of Molecular Marker CHEN Li1,2， YANG Yahui1,2， HUO Yumeng2， LIU Bingjiang2， SUN Yuqing2,3， YANG Jianping1， WU Xiong2,*， and YANG Yanyan2,*（1College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018， China；2Institute of Vegetables and Flowers， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；3College of Horticulture， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China） Abstract： The differential expression of 58 open reading frames（ ORFs） identified in the intergenic sequence of the mitochondrial genome was analyzed using a male sterile line and a maintainer line of onion（ Allium cepa L.） ， through which， a differentially expressed fragment was obtained， designated as orf393. By quantitative real-time PCR， the temporal-spatial expression of orf393 was carried out in different tissues and organs， including roots， leaves， stalks， and the buds of different developmental stages （ pollen mother cells， tetrad， mononuclear， and matured pollen grains） . The results showed that orf393 was Chen Li， Yang Yahui， Huo Yumeng， Liu Bingjiang， Sun Yuqing， Yang Jianping， Wu Xiong， Yang Yanyan. Gene discovery related to S-type male sterility in onion and its usage for development of molecular marker. 504 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 503 510. only expressed in the samples of the male sterile line； its expression could be detected in all samples of the male sterile line， especially the buds during the tetrad stage， which had the highest expression of orf393. The expression level of orf393 returned to the same level as that during the vegetative stage. Our results suggest that orf393 is constitutively expressed and may associate with the male sterility of onion. Based on the sequence difference of orf393 between the male sterile line and its maintainer line， we developed a reliable molecular marker， namely GXX393， for the identification of cytoplasm types of onion. Keywords： onion； cytoplasmic male-sterility； orf393； gene expression； molecular marker 细胞质雄性不育（ Cytoplasmic male-sterility， CMS）是高等植物中的一种母性遗传的不能产生有活力花粉的现象。利用细胞质雄性不育，可保证制种质量和种子纯度，因此广泛用于杂交种的生产。洋葱（ Allium cepa L.）是最早应用细胞质雄性不育系进行杂交种选育的蔬菜作物，虽然现在已知的细胞质类型有 S、 T 和 N 型 3 种，但是在实际育种中以 S 型细胞质雄性不育为主。 1936 年美国的 Jones 和 Emsweller（ 1936）首次在 Italian Red洋葱品种群体中发现了 1 个雄性不育株（ 13-53） ，利用气生鳞茎繁殖保存并与其他可育材料杂交、回交选育出了洋葱细胞质雄性不育系，不育性由不育的细胞质（ S） 与 1 对隐性基因（ msms）共同控制，因此称为 S 型细胞质雄性不育（ Jones & Clarke，1943） 。由于洋葱是 2 年生异花授粉蔬菜，自交衰退严重，采用传统育种方法选育洋葱雄性不育系一般需要 4 8 年的时间（ Havey， 1995） ，而利用细胞质雄性不育基因分子标记辅助选择技术，可以大大提高洋葱雄性不育系及其保持系的选择效率。目前已有一些洋葱细胞质雄性不育相关的报道。de Courcel 等（ 1989）首次开发出可以区分洋葱 S 型与 M 型（ T 型、 N 型）细胞质的 RFLP 标记。Sato（ 1998）发现洋葱线粒体 cob 基因的起始编码上游区域（从 53 到 523）有一段叶绿体基因的插入，利用线粒体 cob 基因设计特异引物，通过 PCR 扩增可对 S 型、 T 型和 N 型 3 种洋葱细胞质类型进行快速鉴定，并推测其导致了洋葱的细胞质雄性不育，但是与该嵌合基因有关的生理生化过程还需要进一步研究。 Kim 等（ 2009）在细胞质雄性不育材料中发现了 1 个嵌合基因 orf725，其 5端几乎包含了 cox 基因的全长序列， 3端与细香葱的 orfA501 同源，推测该嵌合基因可能是导致洋葱细胞质雄性不育的候选基因，并利用 orf725 在 3 种洋葱细胞质类型（ S 型、 T 型、 N 型）中具有不同拷贝数，开发了一个能鉴定 3 种细胞质类型的多重 PCR 分子标记。李永博等（ 2015）开发了鉴定洋葱细胞质基因型的 SCAR 标记， 该标记可以避免因为试验操作失误和 PCR 的无效扩增导致的错误分类。 众多的研究结果表明植物细胞质雄性不育与线粒体基因异常有关（ Kaul， 1988； Hanson & Folkerts， 1992； Dragoeva et al.， 1998） 。本研究中利用已公开的洋葱 S 型细胞质雄性不育系线粒体全基因组序列（ GenBank accession： KU318712） ，通过验证不育系和保持系中不育细胞质线粒体基因组的 58 个 ORF 的表达差异，深入挖掘洋葱的细胞质雄性不育相关基因，开发稳定高效的鉴定细胞质类型的分子标记，丰富洋葱的分子标记辅助育种体系，为揭示洋葱的细胞质雄性不育机理奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验材料为本课题组选育的 10 组洋葱 S 型细胞质雄性不育系（ CMS-S）及其相应的保持系。陈 立，杨亚会，霍雨猛，刘冰江，孙雨晴，杨建平，吴 雄，杨妍妍 . 洋葱 S 型细胞质雄性不育相关基因的挖掘及分子标记开发 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 503 510. 505 2015 年 9 月 5 日于山东省农业科学院蔬菜花卉研究所核心试验区播种， 10 月 25 日定植，选取四叶一心时期的叶片用于基因组总 DNA 的提取。 2016 年 5 月 20 日收获洋葱球， 10 月 18 日定植于采种棚， 2017 年 5 月下旬田间检测花粉育性。选取洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118 和保持系 N218 的根， 叶片， 花茎以及花粉母细胞、 四分体、 单核花粉粒、 成熟花粉粒 4 个发育时期的花蕾用于总 RNA的提取，花蕾的分级参照吴海涛等（ 2010）的方法。 1.2 洋葱总 RNA 的提取及 cDNA 的制备 洋葱总 RNA 的提取参照孙亚玲等（ 2016）的方法，利用 DNase I（宝生物工程大连有限公司）去除基因组 DNA 的污染， 1.5%的琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测 RNA 的浓度和质量。按照反转录试剂盒 PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser（宝生物工程大连有限公司）的说明书进行反转录合成 cDNA，利用总 RNA 为模板进行 qRT-PCR 来判断是否存在基因组 DNA 的污染。 1.3 实时荧光定量 PCR 分别以等量根、叶片、花茎和 4 个发育时期花蕾的 cDNA 为模板，在美国伯乐 CFX96 荧光定量 PCR 系统上进行 qRT-PCR，以 tubulin 作为内参基因。 20 L 反应体系包括 ddH2O 7 L， SYBRPremix Ex TaqTM（宝生物工程大连有限公司） 10 L，引物各 0.5 L，模板 2 L。反应程序采用二步法，退火温度为 60 。 orf393 的引物根据 DNA 序列设计。 orf393-U： 5-ATGAAACGGCAGAATAA ACATCTT-3， orf393-D： 5-AAGCCGCTAAACTAAGCAGTGATG-3。内标引物参照 Huo 等（ 2012）的文献， Tub-F： 5-GCCTTGAGCATGGGATTCAG-3， Tub-R： 5-GTGGAGAGGACACTGTTGTATGG-3。每个样品进行 3 次生物学重复。根据 2-CT法（ Bubner & Baldwin， 2004） ，原始数据经计算后采用单因素方差分析进行统计学分析，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。 1.4 洋葱总 DNA 提取及 PCR 扩增 洋葱基因组总 DNA 采用北京天根生化科技有限公司生产的快捷型植物基因组提取试剂盒提取，方法参照说明书。紫外分光光度计检测 DNA 的浓度和质量。 根据 orf393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系中的差异序列设计 SCAR 引物。 GXX-F1：5-CCCGAAGGAGTGACTTTTTCTGATTT-3和 GXX-R1： 5-TCTCTGGAGCACCGACTGAAGGG-3。PCR 扩增采用 25 L 反应体系，包括 ddH2O 9.5 L， 2 Taq PCR Master Mix 12.5 L， DNA 1 L，上述引物各 1 L。反应程序为： 95 预变性 5 min； 95 变性 30 s， 60 退火 30 s， 72 延伸 30 s，共 35 个循环； 72 后延伸 10 min； 4 保存。 PCR 扩增产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测。 2 结果与分析 2.1 洋葱细胞质雄性不育候选基因的挖掘 在已公开的洋葱 CMS-S 线粒体全基因组序列（ GenBank accession： KU318712）中，发现了 58个新的 ORF。为了进一步挖掘洋葱细胞质雄性不育候选基因，以洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118及其相应保持系 N218 的 cDNA 为模板， 根据 58 个 ORF 的序列分别设计了 58 对引物进行差异表达分析。结果发现 58 个 ORF 中，有 52 个在洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系中都表达且没有明显的差异， 5 个在不育系和保持系中均不表达，只有 1 个，即第 4 个 ORF 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系的表达上存在明显的差异（图 1， S4、 N4） 。该 ORF 全长序列 1 179 bp，编码 393 个氨Chen Li， Yang Yahui， Huo Yumeng， Liu Bingjiang， Sun Yuqing， Yang Jianping， Wu Xiong， Yang Yanyan. Gene discovery related to S-type male sterility in onion and its usage for development of molecular marker. 506 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 503 510. 基酸，命名为 orf393。由 图 1 可以看出， orf393 只在洋葱 S 型细胞质雄性不育系中扩增出大小为 397 bp 的条带，而保持系无此扩增片段。 图 1 58 个 ORF（ 1 58）在洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118（ S）和保持系 N218（ N）中的 PCR 扩增结果 Fig. 1 Amplified product of 58 ORFs（ 1 58） in onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218（ N） M： DNA marker. 2.2 orf393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系中的时空表达分析 由图 2 可以看出， orf393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系的根、叶片、花茎和 4 个发育时期花蕾 中均有表达，只是在根和叶片中表达量较低，而在四分体时期的花蕾中表达量最高，之后恢复到营养生长时期的表达水平；在保持系中未见其表达。这表明 orf393 在不育系中是组成型表达，在保持系中不表达或表达量极低。 图 2 orf393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118（ S）和保持系 N218 不同器官和花粉发育不同时期的相对表达 保持系 N218 不表达 。 Fig. 2 Relative expression quantity of orf393 in different organs and pollen development stages of onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218 Maintainer line N218 did not express. 陈 立，杨亚会，霍雨猛，刘冰江，孙雨晴，杨建平，吴 雄，杨妍妍 . 洋葱 S 型细胞质雄性不育相关基因的挖掘及分子标记开发 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 503 510. 507 图 3 orf393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118（ S）和保持系N218（ N） DNA 中的扩增结果 Fig. 3 The amplication product of orf393 in onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218（ N） M： DNA marker. 2.3 orf393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系中的 DNA 序列分析 利用 orf393 的全长引物对洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118 和保持系 N218 的基因组DNA 进行 PCR 扩增，结果 S118 和 N218 均扩增出大约 1 200 bp 的片段（图 3） 。经过测序和序列比对发现， orf393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系中的扩增片段大小为 1 179 bp，在保持系中的扩增片段大小为 1 143 bp，一致性为 94.23%。与不育系相比， orf393 在保持系中缺失了 36 个碱基，并且有 29 个 SNP（图 4） ，而且在保持系中的第 11 个 SNP 造成第 92 个氨基酸发生改变（ 274C T） ，并导致翻译提前终止。 图 4 洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118（ S）和保持系 N218（ N）中 orf393 的序列比对 Fig. 4 Alignment of orf393 sequences between onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218（ N） Chen Li， Yang Yahui， Huo Yumeng， Liu Bingjiang， Sun Yuqing， Yang Jianping， Wu Xiong， Yang Yanyan. Gene discovery related to S-type male sterility in onion and its usage for development of molecular marker. 508 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 503 510. 2.4 SCAR 标记的开发 根据 orf393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系中的差异序列，开发出鉴定洋葱细胞质基因型的 SCAR 标记， 其扩增引物为 GXX-F1 和 GXX-R1。 应用该标记对洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118及其相应的保持系 N218 进行 PCR 扩增，结果在不育系中扩增出大小为 232 bp 的条带，相应的保持系中扩增出大小为 196 bp 的片段（图 5） ，将该标记命名为 GXX393。 图 5 GXX393 标记对洋葱 S 型细胞质雄性不育系 S118（ S）及其保持系 N218（ N）的 PCR 扩增 NTC：无模板对照。 Fig. 5 The PCR amplication product of GXX393 in onion CMS-S S118（ S） and its maintainer line N218（ N） M： DNA marker； NTC： No template control. 2.5 SCAR 标记 GXX393 在洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系中的验证 为了验证标记 GXX393 在洋葱分子标记辅助育种应用中的可行性，利用本课题组选育的具有不同遗传背景的已知细胞质基因型的 10 个组合材料，每个组合材料取 10 株，进行 PCR 验证。结果如表 1 所示，所有的不育系中均扩增出 232 bp 的条带，而相应的保持系中扩增出 196 bp 的片段， PCR扩增结果与田间判断结果完全吻合。此结果表明该标记可以应用于洋葱的细胞质基因型的鉴别。 表 1 GXX393 标记在洋葱 S 型细胞质雄性不育系和保持系中的单株验证结果 Table 1 Identification of GXX393 in individual plants of onion CMS-S and maintainer lines 材料类型 Material type 材料编号 Material code 细胞质类型 Cytoplasm type GXX393 标记 /bp Molecular marker 吻合率 /% Coincidence rate 黄皮 Yellow S226 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N227 保持系 Maintainer 196 100 S228 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N229 保持系 Maintainer 196 100 S230 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N231 保持系 Maintainer 196 100 S232 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N233 保持系 Maintainer 196 100 红皮 Red S210 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N211 保持系 Maintainer 196 100 S212 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N213 保持系 Maintainer 196 100 S214 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N215 保持系 Maintainer 196 100 S216 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N217 保持系 Maintainer 196 100 S118 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N218 保持系 Maintainer 196 100 白皮 White S11 S 型细胞质雄性不育系 CMS-S 232 100 N12 保持系 Maintainer 196 100 陈 立，杨亚会，霍雨猛，刘冰江，孙雨晴，杨建平，吴 雄，杨妍妍 . 洋葱 S 型细胞质雄性不育相关基因的挖掘及分子标记开发 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 503 510. 509 3 讨论 在高等植物中，细胞质雄性不育是一种普遍存在的生物学现象。迄今为止，已在近 47 个属 140个种的物种中发现了雄性不育现象（ Laser & Lersten， 1972） 。 Levings 和 Pring（ 1976）首次提出了线粒体 DNA（ mtDNA）是 CMS 有关基因的载体。 Kim 等（ 2009）在细胞质雄性不育材料中获得了1 个命名为 orf725 的嵌合基因，其 5端几乎包含了 cox 基因的全长序列， 3端与细香葱的 orfA501同源，研究表明该基因在不育细胞质（ S 型和 T 型）中表达，而在 N 型细胞质中不表达，推测 orf725为洋葱细胞质雄性不育重要的候选基因。本试验的 RT-PCR 结果显示，在洋葱 S 型细胞质雄性不育系中， orf393 在花粉发育第 2 个时期即四分体时期的表达量最高，显著高于花粉发育的其他 3 个时期和营养生长时期的表达水平，这说明四分体时期是小孢子败育的关键时期，可能与洋葱的 S 型细胞质雄性不育存在某种关联。 orf393 是 1 个新的洋葱特有的基因，而且在四分体时期的表达量显著提高，这表明 orf393 也可能是洋葱细胞质雄性不育的重要相关基因。有必要将 orf393 与 orf725 作为重要的洋葱细胞质雄性不育候选基因进一步深入研究，通过遗传互补试验等手段确定与洋葱细胞质雄性不育的关系。 CMS 相关基因在不育植株中的表达有组织特异性表达，如菜豆的 orf239（ Abad et al.， 1995；Sarria et al.， 1999） ，还有组成型表达，如玉米的 urf13（ Von Allmen et al.， 1991） 。在洋葱 S 型细胞质雄性不育系中， orf393 在根、叶片、花茎和花粉发育的 4 个时期均有表达，这表明 orf393 是组成型表达。之所以其作用的表型只存在于生殖器官表现为细胞质雄性不育， 而对营养器官没有产生影响，一种原因可能是有未知的物质存在于花粉的细胞器（线粒体或者叶绿体）中，这种物质与orf393 相互作用改变细胞器的结构后产生细胞毒素，引起细胞死亡从而导致了细胞质雄性不育。这一作用机制与玉米 T 型细胞质雄性不育基因 urf13 类似（ Flavell， 1974） ；另一原因可能是 orf393相关的蛋白被营养器官中的蛋白酶所降解，类似的作用机制在菜豆的细胞质雄性不育相关基因orf239 的研究中已有报道（ Sarria et al.， 1999） 。关于 orf393 具体的作用机制，还需要后续试验进行深入研究。 与洋葱细胞质雄性不育系相比， orf393 在其保持系中缺失了 36 个碱基，利用该缺失开发了 1个稳定可靠的鉴别洋葱细胞质类型的分子标记 GXX393。通过简单提取洋葱的 DNA，经过 PCR 扩增和琼脂糖电泳后，得到 232 bp 片段的为 S 型细胞质，扩增出 196 bp 的为 N 型细胞质。与大多数显性标记相比，该标记可以有效地避免因为实验操作失误和 PCR 的无效扩增而导致错误分类情况，使得鉴定结果更加准确可靠有效，在实际育种中具有重要的意义。 References Abad A R， Mehrtens B J， Mackenzie S A. 1995. 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Gene discovery related to S-type male sterility in onion and its usage for development of molecular marker. 510 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 503 510. 259 263. Hanson M R， Folkerts O. 1992. Structure and function of the higher plant mitochondrial genome. International Review of Cytology， 141 (8)：129 172. Havey M J. 1995. Identification of cytoplasm using the polymerase chain reaction to aid in the extraction of maintainer lines from open-pollinated populations of onion. Theoretical and Applied Genetics， 90 (2)： 263 268. Huo Y， Miao J， Liu B， Yang Y， Zhang Y， Tahara Y， Meng Q， He Q， Kitano H， Wu X. 2012. The expression of pectin methylesterase in onion flower buds is associated with the dominant male-fertility restoration allele. Plant Breeding， 131 (1)： 211 216. Jones H A， Clarke A E. 1943. Inheritance of male sterility in the onion and the production of hybrid seed. Proceedings of American Society for Horticultural Science， 43： 189 194. Jones H A， Emsweller S L. 1936. 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