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园艺学报， 2018， 45 (3)： 482 492. Acta Horticulturae Sinica 482 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0369； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2017 11 02； 修回日期 ： 2018 01 08 基金项目 ： 中国博士后科学基金项目（ 2016M601973） ；浙江省自然科学基金项目（ LQ18C150002） ；国家自然科学基金项目（ 31572145） ；浙江省蔬菜新品种选育重大科技专项子课题（ 2016C02051-4-2） ；浙江省农业科学院青年人才培养项目（ 2017R23R08E01） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： fanminfmsina.com） 西瓜 miR164b 靶基因鉴定及其对黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染应答的分析 孙玉燕，何艳军，牛晓伟，崔 狄，范 敏*（浙江省农业科学院蔬菜研究所，杭州 310021） 摘 要： 将 miR164b 序列与西瓜基因组进行比对，获得 miR164b 前体 Pre-miR164b 基因并克隆。Pre-miR164b 长度为 97 bp，含有完整的茎环结构。 Pre-miR164b 启动子区含有光响应元件、赤霉素响应元件、乙烯响应元件、水杨酸响应元件、真菌诱导响应元件等多个顺式作用元件。降解组测序获得miR164b 的 4 个靶基因，均注释为 NAC 转录因子基因，剪切位点位于 miR164b 序列 5 端第 10 位碱基。miR164b 及靶基因在黄瓜绿斑驳花叶病毒（ CGMMV）侵染不同时间的表达模式不同，靶基因 Cla018596的表达模式与 miR164b 呈负相关，而 Cla019099、 Cla023219 和 Cla023357 的表达模式与 miR164b 没有相关性。 关键词： 西瓜； miR164； NAC；降解组测序；表达模式 中图分类号： S 651 文献标志码： A 文章编号： 0513-353X（ 2018） 03-0482-11 Identification of the Targets of miR164b and Their Response to Cucumber green mottle mosaic virus Infection in Watermelon SUN Yuyan， HE Yanjun， NIU Xiaowei， CUI Di， and FAN Min*（ Institute of Vegetables， Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， China） Abstract： The precursor gene of miR164b， Pre-miR164b， was obtained through blast of miR164b and the watermelon genome. Pre-miR164b， with a length of 97 bp， was able to form the stem-loop structure. The promoter of Pre-miR164b contains several cis-acting regulatory elements， such as light responsive element， gibberellin responsive element， ethylene responsive element， salicylic acid responsive element，and fungal elicitor responsive element. Four target genes of miR164b， annotated as NAC transcription factor， were predicted and the cleavage site was located at the 10th of miR164b at the 5 end. Expression patterns of miR164b and NAC were different during the process of Cucumber green mottle mosaic virus（ CGMMV） infection. Expression of Cla018596 was negatively correlated with miR164b. However， the expression of Cla019099， Cla023219 and Cla023357 was not correlated with miR164b. Keywords： watermelon； miR164； NAC； degradome sequencing； expression pattern 孙玉燕，何艳军，牛晓伟，崔 狄，范 敏 . 西瓜 miR164b 靶基因鉴定及其对黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染应答分析 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 482 492. 483 miRNA 是长度为 19 25 nt 调控基因表达的内源小 RNA， 2002 年首次在植物中发现 （ Reinhart et al.， 2002） 。成熟 miRNA 的形成涉及多个生物过程，需要多个进化保守蛋白家族的参与（ Rogers & Chen， 2013）。植物 miRNA 的主要作用机制是其介导的靶基因切割。大多数植物 miRNA 能够将与其完全互补或接近完全互补的靶基因序列进行切割，试验证明这类切割精确地发生在 miRNA 配对碱基的第 10 或 11 位（ Llave， 2004）。 miRNA 在植物生长发育和抗逆应答中起着重要作用。逆境条件下， 植物通过调控 miRNA 的表达， 作用于相应的靶基因来提高植物对胁迫的抗性 （ Khraiwesh et al.， 2012）。 miR164 是植物中较为保守的一类 miRNA 家族。近年来，关于 miR164 调控植物对病毒胁迫应答的研究取得了一定进展。受烟草花叶病毒（ Tobacco mosaic virus， TMV）的侵染，烟草中 miR164的表达被诱导 （ Bazzini et al.， 2007） 。 miR164 在芜菁黄化花叶病毒 （ Turnip yellow mosaic virus， TYMV）侵染后表达被诱导，在转病毒沉默抑制蛋白基因 P1/HC-Pro 的拟南芥植株中， miR164 的表达同样被诱导（ Kasschau et al.， 2003） 。 miR164 主要调控 NAC 转录因子（ NAM、 ATAF1/2 和 CUC2）的表达（ Nikovics et al.， 2006；Phookaew et al.， 2014； Zhu et al.， 2015） 。在拟南芥中， miR164 靶向 5 个编码 NAC 结构域的基因NAC1、 CUC1、 CUC2、 At5g07680 和 At5g61430（ Mallory et al.， 2004） 。拟南芥 miR164 通过介导NAC1 mRNA 的切割调控生长素信号，进而促进侧根的形成（ Xie et al.， 2000； Guo et al.， 2005） ；miR164 通过调控 CUC1 和 CUC2 的表达影响拟南芥分生组织的发育和气生器官的分离 （ Laufs et al.，2004； Baker et al.， 2005） 。此外， miR164 与 NAC 结合还可调控植物胚胎和花的形成（ Larue et al.，2009） 、衰老（ Kim et al.， 2009） 、协助 mRNA 在韧皮部运输（ Kehr & Buhtz， 2007）等。 除调控植物生长发育外， miR164 及靶基因 NAC 参与植物对胁迫的应答。拟南芥中， TMV 和油菜花叶病毒 （ Oilseed rape mosaic virus， ORMV） 侵染可提高 miR164a 启动子的转录活性 （ Bazzini et al.， 2009） 。 马铃薯 StNAC 和拟南芥 ATAF1、 ATAF2 的表达在病原菌侵染和受伤后被诱导 （ Collinge & Boller， 2001） 。双生病毒 DNA 复制蛋白 RepA 与两个 NAC 蛋白 GRAB1 和 GRAB2 互作（ Xie et al.， 1999） 。 在油菜中， NAC 在虫害、 核盘菌侵染、 冷害和干旱等胁迫后呈现差异表达， 其中 BnNAC14与 BnNAC85 相互作用（ Hegedus et al.， 2003） 。 本课题组前期通过对黄瓜绿斑驳花叶病毒（ Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）侵染前后的西瓜自交系材料 JJZ-M进行 miRNA 高通量测序，发现 miR164b 在病毒侵染后呈现抑制表达（ Sun et al.， 2017） 。本研究中从 JJZ-M中分离并克隆 miR164b 的前体基因，分析其启动子区的顺式作用元件，同时对 miR164b 的靶基因及其剪切位点进行鉴定，对不同接种时间的表达模式进行分析，为进一步了解 miR164b 及靶基因对 CGMMV 胁迫应答的分子机制奠定基础。 1 材料与方法 1.1 植物材料 试验材料为西瓜（ Citrullus lanatus）高代自交系 JJZ-M 。 2017 年 3 月播种于浙江省农业科学院玻璃温室，温度控制在 25 。取发病叶片和磷酸盐缓冲液（ PBS， pH 7.2）按 1 5 的比例混合，研磨成糊状病毒汁液。取两片真叶期待接种的植株，在叶面散上金刚砂，蘸取少量病毒汁液轻轻摩擦叶面 2 3 次，清水冲去多余的金刚砂。分别于接种后 0、 1、 6、 18、 24 和 48 h 取样， 3 株混成 1个样品重复， 3 次生物学重复。 RNAiso 试剂（ TaKaRa）提取总 RNA 备用。 Sun Yuyan， He Yanjun， Niu Xiaowei， Cui Di， Fan Min. Identification of the targets of miR164b and their response to Cucumber green mottle mosaic virus infection in watermelon. 484 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 482 492. 1.2 miR164b 前体基因预测及分子克隆 根据课题组前期 miRNA 高通量测序结果， miR164b（ TGGAGAAGCAGGGCACGTGC）在CGMMV 侵染西瓜叶片后呈现抑制表达（ Sun et al.， 2017）。利 用 Blastn（ E-value = 1e-2）将 miR164b序列与西瓜基因组数据 （ http： /www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/genome /index.cgi?organism=watermelon）进行比对，获得与 miR164b 成熟序列完全匹配的基因组序列。截取 miR164b 两端 150 nt 的核苷酸序列，采用 RNA Structure 3.2 软件进行分析，若其存在完整的茎环结构且成熟序列完全位于 5端，则预测该茎环结构对应的核苷酸序列为 miR164b 的前体 Pre-miR164b。 根据 pre-miR164b 茎环结构的基因组序列，设计特异性引物进行 PCR 扩增。 PCR 反应体系为20 L，包 含 2 L 10 PCR 缓冲液（ Mg2+Plus）、 1.5 L dNTPs 混合液（ 2.5 mmol L-1）、 0.5 L rTaq（ 5 U L-1）、上游和下游引物（ 10 mol L-1）各 0.5 L、 2 L DNA、 13.0 L ddH2O。 PCR 反应程序为： 94 预变性 4 min； 94 变性 30 s， 55 退火 30 s， 72 延伸 1 min， 33 个循环； 72 延伸 8 min。 PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，与 pEASY-T1 载体连接进行 T/A 克隆，热击法转化 Trans1-T1 大肠杆菌感受态细胞，菌落 PCR 筛选阳性克隆，过夜摇菌，测序。 1.3 miR164b 前体基因序列比对和启动子区顺式作用元件分析 将 miR164b 前体与 miRbase 21.0 中其他物种 miRNA 的前体序列进行 blast 比对， 并利用 MEGA 5.1 软件 Neighbor-Joining（测试方法选用 Bootstrap，重复次数设为 2 000）构建 miR164b 前体与其他物种 miR164 前体的进化树。 分离 miR164b 前体上游 1 500 bp 的序列，利用 PlantCARE（ http： /bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）软件对其所包含的顺式作用元件进行预测和分析（ Lescot et al.， 2002）。 1.4 降解组文库构建、测序及数据分析 采集对照和 CGMMV 侵染 48 h 的西瓜叶片，分别提取总 RNA，等量混合。磁珠捕获 mRNA，3和 5接头连接；生物酰化随机引物与 mRNA 混合反转录； PCR 扩增，完成整个文库制备。构建好的文库用 Hiseq 2500 测序平台（ Illumina， USA）进行测序，测序读长为单端 50 bp。 测序获得的原始数据通过数据处理得到可用于后续分析的可比对测序序列。将可比对序列与西瓜的 cDNA 数据库序列比对生成降解组密度文件。通过 Target finder 靶基因预测软件预测出与西瓜miRNA 序列配对的靶基因 mRNA 序列。 将预测的 miRNA 对应的靶基因和生成降解组密度文件中的mRNA 进行结合运算，找出共同具有的 mRNA，该 mRNA 即为 miRNA 的靶基因。给出降解组的峰值分类和分值，对产生的预测结果进行 t-plots 作图。 1.5 miR164b 及其靶基因的表达分析 利用 poly（ T） 加尾 RT-PCR（ Shi & Chiang， 2005）分析 miR164b 的表达。将约 2 g 总 RNA 利用 TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix 试剂盒（全式金）进行 Poly（ A） 加尾，然后利用含有 oligo-dT 的通用接头引物（表 1）将带有 Poly（ A） 尾巴的 miRNA 反转录成 cDNA，以U6 snRNA 作为内参。 靶基因的表达分析： 利用 Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金）将总 RNA 反转录成 cDNA，以 -actin 作为内参基因。 qRT-PCR 使用 TransStart Top Green qPCR Supermix 试剂盒（全式金） 。 qRT-PCR 在 StepOne Plus Real-Time PCR System（ ABI）中完成。反应程序为： 95 预变性 30 s， 95 变性 5 s， 55 退火 15 s， 72 延伸 10 s， 40 次循环。3 次生物学重复。试验结果采用 2-CT法计算基因相对表达量（ Livak & Schmittgen， 2001） 。 孙玉燕，何艳军，牛晓伟，崔 狄，范 敏 . 西瓜 miR164b 靶基因鉴定及其对黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染应答分析 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 482 492. 485 表 1 所用引物及序列 Table 1 Primers and sequences used in this study 用途 Usage 引物名称 Primer name 正向序列（ 5 3） Forward sequence 反向序列（ 5 3） Reverse sequence 前体基因克隆 Precursor gene cloning Pre-miR164b AGAGAGGCATGTTGGAG CGAGAGAATCCTGCTGGAG 内参基因 Reference gene U6 GGGGACATCCGATAAAATT TGTGCGTGTCATCCTTGC -actin CCATGTATGTTGCCATCCAG GGATAGCATGGGGTAGAGCA qRT-PCR qPCR-miR164b TTCCTTTGGAGAAGCAGGGCACGTGC GTGCAGGGTCCGAGGT qPCR-Cla018596 AGTTCACATTTCTGGGTTAGT TTTGGGTAAGGTTCTTTGAGT qPCR-Cla023219 TCGTCGCCTCGTCATCGT AGGGCACTTGCTCATACTCATTqPCR-Cla023357 TGGTAGAGCCATTGCTGAAGT GCTCGGTTCGTTCGCAGA qPCR-Cla019099 TGGCTTCTTCTTACAATACTTC GGTCTGATTTGGCGGTGA 2 结果与分析 2.1 miR164b 前体基因预测及克隆 将 miR164b成熟序列与西瓜基因组数据库进行 Blastn 序列比对， 获得与 miR164b 序列完全匹配的 4 条基因组序列， Chr3： 28186483. 28186464、Chr4： 18094484.1809446、 Chr9： 4409186.44091675和 Chr10： 28130986.8131005。其中 Chr3 ：28186483.28186464 及其上、下游序列能够形成完整茎环结构且符合植物 miRNA 的前体特征。 以西瓜基因组 DNA 为模板对 miR164b 的前体基因进行 PCR 扩增（图 1）。 回收片段进行克隆测序分析， miR164b 的前体长度为 97 bp，能形成稳定的茎环结构，推测这个茎环结构对应的核苷酸序列为 miR164b的前体Pre-miR164b（图 2）。 图 1 Pre-miR164b PCR 扩增 Fig. 1 PCR amplification of Pre-miR164b 图 2 Pre-miR164b 形成的茎环结构 Fig. 2 Stem-loop structure of Pre-miR164b Sun Yuyan， He Yanjun， Niu Xiaowei， Cui Di， Fan Min. Identification of the targets of miR164b and their response to Cucumber green mottle mosaic virus infection in watermelon. 486 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 482 492. 2.2 miR164b 前体基因序列比对及系统进化分析 将 Pre-miR164b 与 miRbase 21.0 中 miRNA 的前体基因序列进行 blast 比对，发现 Pre-miR164b序列含有两个保守区域，分别为成熟 miR164b 序列及其反向互补序列（图 3） 。 图 3 Pre-miR164b 与其他物种序列比对 mes：木薯； ppe：桃； cln：杉木； gma：大豆； cme：甜瓜； vun：豇豆； rco：蓖麻； bdi：二穗短柄草； ath：拟南芥； sbi：高粱； bra：大白菜； mdm：苹果； vvi：葡萄； ghr：棉花； bna：油菜； tcc：可可； ptc：杨树； cpa：木瓜； lus：亚麻。 Fig. 3 Sequence alignment analysis of Pre-miR164b in watermelon and other species mes： Manihot esculenta； ppe： Prunus persica； cln： Cunninghamia lanceolata； gma： Glycine max； cme： Cucumis melo； vun： Vigna unguiculata；rco： Ricinus communis； bdi： Brachypodium distachyon； ath： Arabidopsis thaliana； sbi： Sorghum bicolor； bra： Brassica rapa； mdm： Malus domestica； vvi： Vitis vinifera； ghr： Gossypium hirsutum； bna： Brassica napus； tcc： Theobroma cacao； ptc： Populus trichocarpa； cpa： Carica papaya； lus： Linum usitatissimum. 选取不同物种 miRNA 前体序列进行系统进化分析，其中 Pre-miR164b 序列与蓖麻 rco-MIR164a（ MI0013382）的亲缘关系最近（图 4） 。 孙玉燕，何艳军，牛晓伟，崔 狄，范 敏 . 西瓜 miR164b 靶基因鉴定及其对黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染应答分析 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 482 492. 487 图 4 Pre-miR164b 的系统进化分析 mes：木薯； ppe：桃； cln：杉木； gma：大豆； cme：甜瓜； vun：豇豆； rco：蓖麻； bdi：二穗短柄草； ath：拟南芥； sbi：高粱； bra：大白菜； mdm：苹果； vvi：葡萄； ghr：棉花； bna：油菜； tcc：可可； ptc：杨树； cpa：木瓜； lus：亚麻。 Fig. 4 Phylogenetic relationship analysis of Pre-miR164b mes： Manihot esculenta； ppe： Prunus persica； cln： Cunninghamia lanceolata； gma： Glycine max； cme： Cucumis melo； vun： Vigna unguiculata；rco： Ricinus communis； bdi： Brachypodium distachyon； ath： Arabidopsis thaliana； sbi： Sorghum bicolor； bra： Brassica rapa； mdm： Malus domestica； vvi： Vitis vinifera； ghr： Gossypium hirsutum； bna： Brassica napus； tcc： Theobroma cacao； ptc： Populus trichocarpa； cpa： Carica papaya； lus： Linum usitatissimum. 2.3 miR164b 前体基因启动子区顺式作用元件分析 对 Pre-miR164b 上游 1 500 bp（ Chr3： 28184901.28186400）的启动子区所含的顺式作用元件进行分析，发现其含有多个顺式作用元件（表 2） 。 表 2 Pre-miR164b 启动子区顺式作用元件分析 Table 2 Analysis of Pre-miR164b promoter and its cis-acting regulatory elements 功能 Function 元件名称 Motif name 物种 Species 位置 /正（反）义链 Position/strand 序列 Sequence 光响应元件 Light responsive element 3-AF1 binding site 马铃薯 Solanum tuberosum 1 119（-） AAGAGATATTT 高转录水平顺式作用元件 cis-acting element conferring high transcription levels 5UTR Py-rich stretch 番茄 Lycopersicon esculentum 1 416（-） TTTCTTCTCT 厌氧诱导必需顺式作用元件 cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction ARE 玉米 Zea mays 1 114（-） TGGTTT 富含 AT DNA 结合蛋白的结合位点 Binding site of AT-rich DNA binding protein AT-rich element 大豆 Glycine max 1 240（ +） ATAGAAATCAA 部分光响应模块 Part of a light responsive module AT1-motif 马铃薯 Solanum tuberosum 105（ +） AATTATTTTTTATT1 020（ +） ATTAATTTTACA Sun Yuyan， He Yanjun， Niu Xiaowei， Cui Di， Fan Min. Identification of the targets of miR164b and their response to Cucumber green mottle mosaic virus infection in watermelon. 488 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 482 492. 续表 2 功能 Function 元件名称 Motif name 物种 Species 位置 /正（反）义链 Position/strand 序列 Sequence 部分参与光响应的保守 DNA 模块 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness ATCT-motif 拟南芥 Arabidopsis thaliana 141（ +） AATCTAATCT 部分参与光响应的保守 DNA 模块 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness Box 4 香芹 Petroselinum crispum 215（ +） ATTAAT 881（-） ATTAAT 770（-） ATTAAT 1 020（-） ATTAAT 光响应元件 Light responsive element Box I 豌豆 Pisum sativum 733（ +） TTTCAAA 973（-） TTTCAAA 真菌诱导响应元件 Fungal elicitor responsive element Box-W1 香芹 Petroselinum crispum 991（-） TTGACC 1 437（-） TTGACC 启动子和增强子区的普通顺式作用元件 Common cis-acting element in promoter and enhancer regions CAAT-box 拟南芥 Arabidopsis thaliana 91（ +） CCAAT 大豆 Glycine max 92（ +） CAATT 994（ +） CAATT 429（-） CAATT 大麦 Hordeum vulgare 430（-） CAAT 927（ +） CAAT 芜菁 Brassica rapa 969（ +） CAAAT 133（-） CAAAT 乙烯响应元件 Ethylene-responsive element ERE 康乃馨 Dianthus caryophyllus 732（ +） ATTTCAAA 参与光响应的顺式作用元件 cis-acting regulatory element involved in light responsiveness G-box 玉米 Zea mays 384（-） CACGTT 部分光响应元件 Part of a light responsive element GA-motif 向日葵 Helianthus annuus 160（ +） AAAGATGA 部分光响应模块 Part of a light responsive element GAG-motif 菠菜 Spinacia oleracea 1 416（ +） AGAGATG 赤霉素响应元件 Gibberellin-responsive element GARE-motif 甘蓝 Brassica oleracea 616（ +） AAACAGA 光响应元件 Light responsive element GT1-motif 燕麦 Avena sativa 885（-） GGTTAAT 拟南芥 Arabidopsis thaliana 1 385（ +） GGTTAA 886（-） GGTTAA 参与热胁迫响应的顺式作用元件 cis-acting element involved in heat stress responsiveness HSE 甘蓝 Brassica oleracea 310（ +） AAAAAATTTC 727（ +） AAAAAATTTC 498（ +） AAAAAATTTC 928（ +） AAAAAATTTC 部分光响应元件 Part of a light responsive element I-box 黄菊 Flaveria trinervia 821（-） GATATGG 部分光响应元件 Part of a light responsive element LAMP-element 菠菜 Spinacia oleracea 1111（ +） CCAAAACCA 参与类黄酮生物合成基因调控的 MYB 结合位点 MYB binding site involved in flavonoid biosynthetic genes regulation MBSI 矮牵牛 Petunia hybrida 887（-） aaaAaaC(G/C)GTTA 参与光响应的 MYB 结合位点 MYB binding site involved in light responsiveness MRE 香芹 Petroselinum crispum 1 341（ +） AACCTAA 胚乳表达必需顺式作用元件 cis-acting regulatory element required for endosperm expression Skn-1_motif 水稻 Oryza sativa 164（-） GTCAT 436（-） GTCAT376（ +） GTCAT 转录起始区的核心启动子元件 Core promoter element around 30 of transcription start TATA-box 油菜 Brassica napus 10（ +） ATATAT 拟南芥 Arabidopsis thaliana 11（ +） TATA 13（ +） TATTTAAA 大豆 Glycine max 29（ +） TAATA 参与水杨酸响应的顺式作用元件 cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness TCA-element 烟草 Nicotiana tabacum 827（ +） CCATCTTTTT 890（ +） CCATCTTTTT 甘蓝 Brassica oleracea 1 457（ +） GAGAAGAATA 部分光响应元件 Part of a light responsive element TCT-motif 拟南芥 Arabidopsis thaliana 1 492（-） TCTTAC 孙玉燕，何艳军，牛晓伟，崔 狄，范 敏 . 西瓜 miR164b 靶基因鉴定及其对黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染应答分析 . 园艺学报， 2018， 45 (3)： 482 492. 489 包括基因启动子和增强子区的顺式作用元件（ TATA-box 和 CAAT-box） ，光响应元件（ 3-AF1 binding site、 AT1-motif、 ATCT-motif、 TCT-motif、 AT-rich element、 ATCT-motif、 G-box、 LAMP-element、I-box、 GA-motif、 GAG-motif、 Box、 Box 4、 GT1-motif 和 MRE） ，赤霉素响应元件（ GARE-motif） ，乙烯响应元件（ ERE） ，水杨酸响应元件（ TCA-element） ，真菌诱导响应元件（ Box-W1） ，热激响应元件（ HSE） ，胚乳表达调控元件（ Skn-1-motif） ，类黄酮生物合成基因调控元件（ MBSI）等。由此可以预测， miR164b 可能参与调控植物的生长发育、次生代谢产物合成和逆境胁迫应答等多个生理过程。 2.4 降解组测序鉴定 miR164b
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